Đang tải... (xem toàn văn)
Bệnh đầu đen (Histomonosis) là một bệnh ký sinh trùng nguy hiểm ở gia cầm, đặc biệt là gà và gà tây. Bệnh do đơn bào có tên khoa học là Histomonas meleagridis (H.meleagridis) gây ra. H.meleagridis ký sinh chủ yếu trong lòng manh tràng và nhu mô gan, gây hoại tử, xuất huyết niêm mạc manh tràng, rối loạn chức năng gan. Gia cầm bị bệnh có triệu chứng ủ rũ, xù lông, giảm ăn, uống nhiều nước, phân loãng màu vàng lưu huỳnh; da vùng đầu ban đầu xanh tím sau đó chuyển sang thâm đen (bởi vậy được gọi là bệnh đầu đen). Gà bệnh chết rải rác và thường chết về ban đêm, mức độ chết không ồ ạt nhưng sự chết kéo dài, tỷ lệ chết lên tới 85 % 95%. Hiện nay bệnh đã xảy ra ở nhiều tỉnh thành trên cả nước gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn nuôi. Tuy nhiên ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về loại kí sinh trùng gây bệnh này.
HC VIN NễNG NGHIP VIT NAM KHOA CễNG NGHấ SINH HOC KHOA LUN TễT NGHIấP TI: CHN ON V GIM NH PHN T CC CHNG HISTOMONAS MELEAGRIDIS GY BấNH TRấN G QUA KHO ST CHUI GEN 18S RIBOSOME H NI, 12/2016 HC VIN NễNG NGHIP VIT NAM KHOA CễNG NGHấ SINH HOC KHOA LUN TễT NGHIấP TI: CHN ON V GIM NH PHN T CC CHNG HISTOMONAS MELEAGRIDIS GY BấNH TRấN G QUA KHO ST CHUI GEN 18S RIBOSOME Sinh viờn Ngnh Ging viờn hng dn : Nguyn Th Thu Hng : Cụng ngh sinh hc : TS on Th Thanh Hng Vin Cụng ngh sinh hc TS Nguyn Hu c Hc vin Nụng nghip Vit Nam H NI, 12/2016 LI CAM OAN Tụi xin cam oan ton b kt qu lun l chớnh tụi trc tip thc hin Cỏc s liu v kt qu c cụng b lun l hon ton trung thc, chớnh xỏc v cha c cụng b bt k cụng trỡnh no khỏc H Ni, ngy thỏng nm 2016 Sinh viờn Nguyn Th Thu Hng i LI CM N Li u tiờn, tụi xin by t lũng kớnh trng v bit n sõu sc ti cụ TS on Th Thanh Hng Trng phũng Min dch hc, Vin Cụng ngh sinh hc, Vin hn lõm Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam Thy giỏo TS Nguyn Hu c Phú Trng khoa Cụng ngh sinh hc, Trng B mụn Cụng ngh sinh hc ng vt Hc vin Nụng nghip Vit Nam l ngi ó trc tip hng dn, tn tỡnh ch bo v to mi iu kin tt nht cho tụi sut quỏ trỡnh hc v nghiờn cu khoa hc Tụi cng xin gi li cm n sõu sc ti cỏc cỏn b phũng Min dch hc, Vin Cụng ngh sinh hc ó luụn tn tỡnh ch bo, ng viờn v cho tụi nhng li khuyờn quý bỏu cụng vic cng nh cuc sng Tip theo, tụi xin gi li cm n n cỏc Thy, Cụ khoa Cụng ngh sinh hc - Hc vin Nụng nghip Vit Nam, ó tn tỡnh ch bo cho tụi sut quỏ trỡnh hc ti trng Cui cựng, tụi xin c by t lũng bit n vụ hn n B, M v ton th nhng ngi thõn gia ỡnh cựng bn bố ó luụn h tr, ng viờn, khuyn khớch tụi sut thi gian qua Tụi xin chõn thnh cm n! H Ni, ngy thỏng nm 2016 Sinh viờn Nguyn Th Thu Hng ii MC LC LI CM N ii MC LC .iii DANH MC CH VIT TT iii DANH MC HèNH v 2.1 i cng v bnh u en 2.1.1.Lch s bnh u en .3 2.1.3.Dch t hc bnh u en 2.1.2.Cỏc bin phỏp phũng nga v iu tr bnh 2.2.c im sinh hc ca n bo histomonas meligridis kớ sinh gia cm 2.2.1.V trớ phõn loi h thng phõn loi ng vt nguyờn sinh 2.2.4.Phng thc truyn lõy bnh n bo H meleagridis g 12 2.3.3.Phng phỏp gii trỡnh t 18 3.4.6.Gii trỡnh t chui gen 18S ribosome 24 TI LIU THAM KHO 25 DANH MC CH VIT TT T vit tt àl àm bp ddNTP DNA dNTPs ELISA H.meleagridis ITS1 ITS2 MEGA6.06 nxb PCR RNA UV Tờn y Microlitre Micrometer Base pair Dideoxynucleoside Triphosphate Deoxyribonucleic acid Deoxynucleoside Triphosphate Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Histomonas meleagridis Internal Transcribed Spacer-1 Internal Transcribed Spacer-2 Molecular Evolutionary Genetics Alnalysis v6.o6 Nh xut bn Polymerase Chain Reaction Ribonucleic acid Ultra Violet iii DANH MC BNG Bng 3.1.Quy trỡnh tỏch chit DNA tng s 22 Bng 3.2.Cỏc phn ng PCR Error: Reference source not found4 Bng 3.3 Thnh phn cho mt phn ng PCR 24 Bng 3.4.Chu kỡ nhit ca phn ng PCR .24 Bng 3.5 Quy trỡnh tinh sch sn phm PCR 25 iv DANH MC HèNH Hỡnh 1.1 Vũng i ca H meleagridis trờn gia cm 12 v Phn I: Phn M u nc ta, ngnh Chn nuụi núi chung v chn nuụi g núi riờng luụn chim mt v trớ quan trng s phỏt trin chung ca t nc Xu hng chn nuụi vi quy mụ ln, ỏp dng cụng ngh tiờn tin ca th gii v ging, thc n, thuc thỳ y v quy trỡnh chm súc nuụi dng ó lm tng quy mụ cng nh cht lng n gia cm c tớnh tng s gia cm ca c nc thỏng nm 2016 t 341,5 triu con, tng 4,3% so vi cựng k nm 2015, ú s lng g t 258,7 triu con, tng 4,4% Chn nuụi g ó v ang lm thay i cuc sng, nõng cao mc thu nhp cho ngi dõn, to cỏc sn phm cú giỏ tr kinh t cao phc v cho nhu cu nc v xu t khu Bờn cnh nhng thnh tu ú thỡ ngnh chn nuụi c bit l chn nuụi g ang phi i mt vi nhiu nguy c ri ro ch yu l bnh dch em li Do quỏn chn nuụi nh l, tn dng ngun thc n t nhiờn to iu kin thuõn li cỏc bnh kớ sinh trựng núi chung v bnh giun kim g núi riờng phỏt trin, kộo theo s phỏt trin ca bnh n bo Histomonas gõy Bnh u en (Histomonosis) l mt bnh ký sinh trựng nguy him gia cm, c bit l g v g tõy Bnh n bo cú tờn khoa hc l Histomonas meleagridis (H.meleagridis) gõy H.meleagridis ký sinh ch yu lũng manh trng v nhu mụ gan, gõy hoi t, xut huyt niờm mc manh trng, ri lon chc nng gan Gia cm b bnh cú triu chng r, xự lụng, gim n, ung nhiu nc, phõn loóng mu vng lu hunh; da vựng u ban u xanh tớm sau ú chuyn sang thõm en (bi vy c gi l bnh u en) G bnh cht ri rỏc v thng cht v ban ờm, mc cht khụng t nhng s cht kộo di, t l cht lờn ti 85 % - 95% Hin bnh ó xy nhiu tnh thnh trờn c nc gõy thit hi ln v kinh t cho ngi chn nuụi Tuy nhiờn Vit Nam cha cú nhiu nghiờn cu v loi kớ sinh trựng gõy bnh ny Vi mc ớch xõy dng mt phng phỏp chn oỏn nhanh, chớnh xỏc tỏc nhõn gõy bnh cng nh tỡm hiu v c tớnh phõn t ca cỏc chng H.meleagridis ng nhim ti Vit Nam, chỳng tụi tin hnh thc hin ti Chn oỏn v giỏm nh phõn t cỏc chng Histomonas meleagridis gõy bnh trờn g qua kho sỏt chui gen 18S ribosome - Mc tiờu nghiờn cu Thu nhn cỏc mu bnh phm cha H.meleagridis t cỏc n g nghi nhim bnh - ti Vit Nam Thit k cp mi thu nhn vựng gen 18S ribosome, hoc/v mt s vựng gen khỏc Thu nhn chui gen 18S ribosome, hoc/v mt s vựng gen quan trng khỏc So sỏnh trỡnh t nucleotide vựng gen 18S ribosome vi cỏc chng ca th gii; xõy dng cõy ph h; t ú xỏc nh genotype v v trớ phõn loi ca cỏc chng H.meleagridis gõy bnh ti Vit Nam PHN II: TNG QUAN TI LIấU 2.1 i cng v bnh u en 2.1.1 Lch s bnh u en Bnh ln u tiờn c phỏt hin Rhode Island vo nm 1893 (Cushman S.,1894) Sau ú bnh ny ó c bỏo cỏo trờn khp lc a v sm tỡm thy nhiu nc khỏc Vi nhng triu chng chung l da vựng u b bin i mu, g tõy mc bnh t l cht cao, gõy thit hi ln cho ngnh chn nuụi Sau s bựng n u tiờn Rhode Island, Histomoniasis nhanh chúng lõy lan trờn n g tõy khp nc M v gõy thit hi nhiu nht s cỏc bnh gp trờn g tõy (Lund E.E.,1969) cho bit: ti M, Histomonosis ln u tiờn c phỏt hin g nm 1901 v n nm 1908 v dch u tiờn bựng phỏt trờn g Mc dự cỏc h chn nuụi M ó thc hin nhiu bin phỏp phũng bnh, nhng Histomonosis tip tc xy v lan rng nhiu tiu bang ca M, lm cht nhiu g v g tõy, gõy thit hi nng n v kinh t cho ngi chn nuụi T nm 1926 Histomonosis M ó nhanh chúng lõy lan sang cỏc chõu lc khỏc nh chõu u, c v ụng Chõu u, dch Histomonosis cng xut hin v ó c bỏo cỏo Ireland (1894), o (2006), B (2007), Anh (2007) v H Lan (2009) ụng u, bnh cú mt Bungari vo nm 1950 Nht Bn vo nm 1905.(Trng Th Tớnh.,2016) Ngy nay, Histomonosis l bnh ph bin trờn ton th gii, nht l cỏc nc cú ngnh chn nuụi g, g tõy theo li th v trung cụng nghip (Mc Dougald.,2005) Vit Nam bnh c phỏt hin vo thỏng nm 2010 cỏc n g nuụi th ti mt s tnh phớa bc (Lờ Vn Nm.,2010) ễng cng cho rng cỏc trang tri chn nuụi g tht ang b ụ nhim nng vi giun kim m nú c bit n nh mt vect sinh hc truyn bnh v chuyn sang chn nuụi g tõy Hin bnh ó xy nhiu tnh, thnh trờn c nc, gõy thit hi kinh t nng n cho ngi chn nuụi cụng vo manh trng v cỏc mụ ca manh trng Khi bnh tin trin, manh trng cú mựi hụi v xut hin mu vng Trong lũng ca manh trng cha mt hp cht lng cỏc t bo cht v mỏu Sau ú, cỏc vi sinh vt n bo theo mỏu i vo gan v phỏ hu gan to nờn cỏc vựng hoi t (t bo cht) ụi H meleagridis tn cụng vo cỏc c quan khỏc nh thn, phi, tim v nóo Blackhead git cht g v bnh ny thng b bi nhim mt s vi khun th cp nh E Coli, Bacillus subtilis, Clostridium gõy bnh nhim trựng th cp v gõy cht nhiu g hn (Mc Dougald., 2005) Mt khỏc chỳng tip tc xõm nhp vo nhng trng giun c trỳ manh trng v i ngoi theo phõn Nhng gia cm khỏc n phi s tip tc phỏt bnh Lõy nhim qua giun t: Khi trng giun kim c th g ó nhim Histomonas thi ngoi mụi trng nn chung , t Giun t n phi, ri g li n giun t thỡ mm bnh cng c phỏt (trng hp g th rong b nhim cao) mt s dch khỏc xy trờn g thỡ ngi ta khụng tỡm thy trng giun manh trng, cú l cũn cú mt cỏch truyn bnh khỏc m ta cha phỏt hin c Mt s gia cm cng b lõy nhim trc tip n thụng qua ngun nc b nhim bnh (Hu et al., 2004; Mc Dougald v Fuller, 2005) Khi gia cm n trc tip H meleagridis, cỏc thớ nghim ngh rng chỳng khụng cú kh nng sng sút qua d dy c bit l d dy tuyn - acid d dy c tit Vỡ th, Histomonas khụng th lõy truyn qua ng ming (Hu et al 2004) Tuy nhiờn, cho g nhn n khong gi, s thiu acid h d dy rut lm cho mụi trng tr nờn trung tớnh v iu ny cho phộp Histomonas sng sút qua ng ming ( McDougald, 2005) 2.2.5 Tỡnh hỡnh nghiờn cu H meleagridis Nghiờn cu giỏm nh v phõn loi H meleagridis ngoi cn c triu chng lõm sng v bnh tớch c trng, hu ht giỏm nh sinh hc phõn t u da trờn c im gen 18S ribosome (Mantini et al., 2009) Gn õy, mt s cụng trỡnh nh type (genotyping) da trờn phõn tớch chui nucleotide vựng giao gen ITS1 (internal transcribed spacer1) ó c ỏp dng v cú ba kiu gen c mụ t: genotype I v II phõn lp c liờn kt vi bnh lõm sng xut phỏt t H.meleagridis,trong ú, genotype III cú l liờn quan vi Parahistomonaswenrichi (Van der Heijden et al., 2006; Mantini et al., 2009) 13 Lollis L et al., (2011) ó thc hin phn ng PCR trờn vựng ITS- rDNA vi primer ITS1 v ITS2, trờn 28 n bo H meleagridis cú cỏc mu mụ thu thp t nhiu loi gia cm nuụi cỏc v trớ a lý khỏc nghiờn cu s a dng di truyn ca H meleagridis Kt qu cho thy, trỡnh t vựng rDNA 5,8-S v ITS ca H meleagridis khụng cú s bin ng Nh vy, khụng cú s khỏc bit v chng ca H meleagridis gõy bnh gia cỏc loi gia cm nuụi cỏc vựng a lý khỏc Klodnicki M E et al., (2013) ó tin hnh phõn tớch b gen ca H meleagridis Cỏc d liu thu c t cỏc thớ nghim ó xỏc nh c 3425 gen H meleagridis Trong ú cú 81 gen mó húa cho protein hydrogenosomal, c s dng xỏc nh cỏc codon tn s Vit Nam, ó cú nghiờn cu iu tra s ph bin v mụ t s a dng di truyn ca H meleagridis phõn lp g Nam Vit Nam (Nguyen et al, 2015) Nghiờn cu ch 99% cỏc chng ca Vit Nam tng ng vi H meleagridis cú ngõn hng gen õy l cuc kho sỏt u tiờn ca s ph bin v c tớnh di truyn ca H meleagridis g ti Vit Nam 2.3 Nguyờn lý cỏc k thut sinh hc phõn t s dng nghiờn cu gen v h gen 2.3.1 Tỏch chit DNA Ton b DNA ca t bo, bao gm tt c gen v nhng vựng liờn gen c gi l b gen Mi nghiờn cu v ng dng ca cụng ngh gen u c bt u t vic thu nhn mt lng acidnucleic tinh sch Nguyờn lý: thu nhn DNA tinh sch, ngi ta cn loi b nhng thnh phn nhim, m quan trng nht l protein S tỏch chit da trờn nguyờn tc hũa tan khỏc ca cỏc phõn t khỏc (nucleic acid/protein) hai pha khụng hũa tan (phenol, chloroform/nc) Mi quan tõm u tiờn ca k thut tỏch chit acid nucleic l thu nhn c cỏc phõn t ny trng thỏi nguyờn vn, khụng b phõn hy bi tỏc nhõn c hc, húa hc v enzyme (RNase, DNase) Phng phỏp tin hnh theo th t: - Phỏ v mng t bo, mng nhõn - Loi b protein - Ta DNA 14 Sau cụng on tỏch chit, DNA tinh sch nm mt th tớch dung dch ln Ly tõm cho phộp thu nhn DNA di dng cn ta d bo qun v cn cú th hũa li nc theo nng mong mun Cú hai kiu ta chớnh: - Ta bng ethanol: c thc hin nng mui, nng ethanol cao (th tớch ethanol/th tớch dung dch cn ta bng - 2,5) Nhit thp thỳc y s ta - Ta bng isopropanol: khụng cn mui, cú th s dng 0,8 - th tớch isopropanol/th tớch dung dch cn ta Nhng on DNA tht ngn dự nng cao cng khụng ta bng cỏch ny nờn cú th d dng loi chỳng Mt s tỏc nhõn tỏch chit thụng dng l: (1) Phenol: mt cht bin tớnh protein mnh, khụng hũa tan nucleic acid (2) Chloroform: i kốm vi phenol, cú tỏc dng b sung v loi b hon ton du vt phenol, chloroform cng lm bin tớnh protein nhng yu hn phenol; isoamylalcohol lm gim bt, n nh hai pha nc v chloroform sau ly tõm (3) Isobutanol: cú hai cụng dng l tỏch cỏc phõn t hu c nh ethidium bromide v lm m c dung dch nucleic acid Khi tỏch chit DNA thng gp phi mt s nh DNA tỏch chit b t góy, ln RNA, polysaccharide v polyphenol mu 2.3.2 Nguyờn lý k thut PCR nh ngha: Phng phỏp PCR (polymerase chain reaction) l phng phỏp khuch i nhanh nhiu bn cỏc on DNA m khụng qua to dũng Phng phỏp ny c Kary Mullis a nm 1985 v Saiki hon thin nm 1988 Phng phỏp PCR c thc hin hon ton cỏc eppendoff v thi gian ngn ta cú th thu nhn rt nhiu bn DNA K thut PCR cú th c ng dng nhiu lnh vc: chn oỏn, xột nghim cỏc tỏc nhõn vi sinh vt gõy bnh, xỏc nh gii tớnh ca phụi, gii mó di truyn, to ging mi vi cỏc t bin nh hng, nghiờn cu s tin hoỏ ca sinh vt mc phõn t, Nguyờn tc ca k thut PCR: Nguyờn tc c bn ca phn ng PCR l khuch i mt on gen quan tõm bng mi chuyờn bit kt hp vi hot ng ca enzyme chu nhit polymerase nh Taq 15 DNA polymerase mt chu trỡnh nhit hp lớ Mi tỏc ng trờn mch DNA 3' - 5' cũn c gi l forward primer (mi xuụi), kớ hiu l F Mi tỏc ng trờn mch 5' - 3' cũn c gi l reverse primer (mi ngc), kớ hiu l R Khi cỏc mi kt hp vi si DNA b sung ca nú iu kin mt khong cỏch ó c kớch hot, cỏc on DNA ny cú th s c khuch i theo phn ng dõy chuyn vi polymerase Mi chu k khuch i gm cỏc giai on: bin tớnh (denature), gn mi (anealing), kộo di (extension) ni tip Quỏ trỡnh thc hin mt chu k ca mt phn ng PCR xy rt nhanh khuch i on gen mc tiờu Thụng thng phn ng PCR ch c dựng khuch i mt on DNA cú chiu di khong 200 2000 bp Cỏc thnh phn tham gia phn ng PCR DNA khuụn Phn ng PCR ti u xy mu DNA khụng c di quỏ, thng khuch i tt nht i vi on DNA di khong - 1,5 kb Mu DNA tinh sch thỡ phn ng cng cho hiu qu tt Phng phỏp cho phộp xỏc nh mt lng thp DNA, nh hn 100 ng on mi: Mi l nhng on DNA n (oligonucleotide) cú kớch thc ch vi chc base (18 - 30 nucleotide), cú th bt cp theo nguyờn tc b sung vo on u v on kt thỳc ca chui DNA ớch chui ớch ny c bin tớnh thnh si n Mi l chỡa khúa quan trng quyt nh s thnh cụng hay tht bi ca mt phn ng PCR Nu mi c thit k mt cỏch chớnh xỏc thỡ thớ nghim s mang li kt qu v s khuch i ca mt mnh DNA n nht Vic la chn mi cn tuõn th theo mt s nguyờn tc sau: - di ca on mi khong t 17-30 nucleotide - Tong trỡnh t cỏc on mi khụng nờn cha hn nucleotide ging xp liờn tip - T l GC lý tng on mi vo khong t 40-50% nhit bt cp ca on mi l khụng quỏ thp - Trỡnh t ca mi khụng cú s bt cp gia mi xuụi v mi ngc v cng khụng to cu trỳc kp túc 16 - Nhit gn mi ca phn ng PCR nờn thp hn nhit núng chy ca mi khon 5C - Nhit núng chy ca mi khụng nờn cỏch quỏ xa Cỏc dNTPs Cỏc dNTP l n v cú th tng hp sn phm PCR Mi dNTP cú cu to gm mt ng deoxyribose cú gn mt base, cú th l adenine (dATP) hay thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay Guanine (dGTP), carbone s 1(C1) Ba phõn t phosphate (triphosphate) c gn ti v trớ carbone s (C5) ca phõn t deoxyribose ny v õy chớnh l ni m dNTP gn vo u 3' ca chui b sung trờn chui ớch Nng lng cung cp cho phn ng ny c ly t cỏc cu ni phosphate giu nng lng ca cỏc triphosphate trờn dNTP Enzyme DNA polymerase v dung dch m cho phn ng PCR: Thng dựng nht cỏc phũng thớ nghim l enzyme Taq DNA polymerase, õy l enzyme c tỏch chit t vi khun Thermus aquaticus, l mt vi khun chu nhit sng c cỏc sui nc núng Enzyme ny khụng tng hp c trỡnh t DNA di quỏ kb Lng enzyme cn thit ph thuc vo lng DNA template v kớch thc phn ng PCR Khụng nờn tng enzyme quỏ àl trờn 50 àl tng th tớch phn ng Nng Taq polymerase c s dng thụng thng l 0,5 - n v/100l dung dch phn ng Nu nng Taq quỏ cao, nhng sn phm khụng chuyờn tớnh cú th xut hin lm sai lch kt qu Nu nng Taq quỏ thp, chỳng ta s khụng cú xỳc tỏc to sn phm PCR theo ý mun m Tris HCl 10 mM, KCL 50 M v MgCl2 Ngoi ra, dung dch m PCR cũn cú th cha 0,001% BSA hay Gelatine v mt s phn ng PCR cũn cú th thờm Tween, Dimethyl sulfoxide (DMSO) hay formamide Trong cỏc thnh phn trờn, nh hng n cht lng ca PCR nhiu nht l nng MgCl2 Vỡ vy cú c mt phn ng PCR cú nhy cao v c hiu, cn phi ti u húa nng MgCl2 t 1,5 mM n mM thm dũ, xỏc nh c nng ti u nht Chu trỡnh nhit cho phn ng PCR: Giai on Bin tớnh DNA 17 Bin tớnh ng: thin - phỳt 950C nu hm lng GC l 50% hoc ớt hn Thi gian bin tớnh cú lờn ti 10 phỳt i vi khuụn giu GC Bin tớnh: Thng bin tớnh 0,5 - phỳt 94 - 950C, sn phm PCR c tng hp chu k khuch i th nht ngn hn ỏng k so vi khuụn DNA ban u v c bin tớnh hon ton di cỏc iu kin ny Nu khuch i cú hm lng GC rt cao, thi gian bin tớnh cú th c tng lờn phỳt Giai on Gn mi: Nhit ph thuc vo on mi v thng thp hn nhit bin tớnh (2 - 3oC) S dng sai nhit bc ny dn n vic on mi khụng c gn hon ton vo DNA mu hay gn khụng c hiu Thi gian gn mi khong 0,5 - phỳt Giai on Tng hp: Nhit kộo di tng hp DNA ph thuc DNA-polymerase, thng c thc hin 70 - 75oC Thi gian kộo di ph thuc vo c DNApolymerase v chiu di on DNA cn khuch i 2.3.3 Phng phỏp gii trỡnh t Sn phm PCR sau tinh sch c gii trỡnh t trc tip trờn mỏy gii trỡnh t t ng Nguyờn lý: gii trỡnh t DNA t ng da theo nguyờn lý ca phng phỏp dideoxy ca F Sanger( 1977) c ci tin da vo cỏc thit b t ng húa nhanh v chớnh xỏc hn Da vo hot ng ca enzyme DNA polymerase quỏ trỡnh tng hp DNA, enzyme DNA polymerase xỳc tỏc gn cỏc nucleotide vo mch n DNA ang tng hp v trớ cú cha nhúm 3-OH t do, gp nucleotide khụng cú cha nhm 3OH (ddNTP) thỡ phn ng tng hp dng li c trng ca phng phỏp ny l dựng ddNTP ( b mt nguyờn t oxy v trớ cacbon v 4) dng phn ng mt cỏch ngu nhiờn Kt qu l to cỏc on DNA si n di ngn khỏc v ch sai khỏc mt nucleotide (Sanger, 1997) K thut ny kt hp ba bc ca mt chu kỡ nhit phn ng PCR, bao gm bin tớnh DNA, gn mi v tng hp mi s dng l mi n di khong 20-24 nucleotide, thnh phn tng hp DNA l dNTP v 1% dideoxy NTP (ddNTP) tng ng ( lng nh ddNTP so vi dNTP nờn thnh thong mi cú ddNTP c s dng lm phn 18 ng ni di chui n nucleotide dng li ngu nhiờn) Chui DNA sn phm c xỏc nh trỡnh t theo chiu K thut gii trỡnh t t ng, ngi ta ỏnh du bng cht hunh quang (fluochrome), mi loi dideoxy nucleotide c ỏnh du bng mt fluochrome cú mu khỏc (vớ d nh xanh da tri, da cam, xanh lc v en) Nh vy cỏc phõn on DNA c ỏnh du phõn bit bi cỏc mu khỏc S dng thch polyacrylamide v quột tia lazer dc theo chui c trỡnh t, phõn tớch t ng bng mỏy vi cỏc chng trỡnh phn mm tin sinh hc 19 PHN III VT LIấU, NI DUNG V PHNG PHP NGHIấN CU 3.1 i tng, thi gian, a im nghiờn cu 3.1.1 i tng nghiờn cu Loi histomonas meleagridis cú manh trng v phõn g nhim bnh 3.1.2 a im, thi gian nghiờn cu a im nghiờn cu Phũng Min dch hc Vin Cụng ngh sinh hc - Vin hn lõm Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam Thi gian nghiờn cu: 8/2016 12/2016 3.2 Vt liu nghiờn cu 3.2.1 Mu nghiờn cu Cỏc c quan ni tng ca g b mc bnh u en; n bo H meleagridis 3.2.2 Dng c v húa cht Dng c, thit b: - Cỏc loi mỏy múc : + T lnh thng, t lnh õm sõu -20oC, t m 37oC + Mỏy ly tõm thng + Mỏy PCR (PTC- 100 thermal cycler) ca MJ Research Inc + Mỏy in di kim tra sn phm PCR ca hóng Bio-Rad + Mỏy soi gel Dolphin-c (Wealtech, USA), kốm theo mỏy vi tớnh + B pipetman (10àl, 20àl, 100àl, 200àl, 1000àl) + Mỏy tớnh v cỏc phn mn tin - sinh hc - Dng c: dao, kộo, panh, cỏc loi eppendorf, cỏc loi u cụn, l ng mụi trng, gng tay kh trựng Húa cht: - Nito lng; B sinh phm Gene JET genomic DNA Purification Kit ca hóng Thermo (M) - kit DeamTaq PCR Master Mix(2x) (Thermo M) - B sinh phm GeneJET PCR Purification Kit ca hóng Thermo (M) 20 3.3 Ni dung nghiờn cu - Thu nhn mu bnh phm ca g nghi mc bnh H.meleagridis t manh trng v phõn; - Thit k mi v thu nhn mt phn gen18S ribosome ca H.meleagridis; - So sỏnh trỡnh t nucleotide vi cỏc chng ca th gii trờn Ngõn hng Gen; - Xõy dng ph h ngun gc xỏc nh type (genotype) ca cỏc mu H.meleagridis ang tn ti Vit Nam 3.4 Phng phỏp nghiờn cu 3.4.1 Phng phỏp thu nhn mu 3.4.2 Phng phỏp tỏch chit DNA tng s Mu c cung cp bi phũng dch, vin cụng ngh sinh hc,vin khoa hc v cụng ngh Vit Nam L cỏc mu bnh phm t manh trng hoc phõn g nghi nhim H.melliagridis cỏc mu ny ó c chun oỏn s b bng quan sỏt triu chng lõm sn v kim tra bnh tớch Mu manh trng: ct dc manh trng b phõn, bng nc ct kh trựng cho sch phõn, co lp niờm mc phớa manh trng tỏch DNA DNA tng s c tỏch chit t cỏc mu trờn, s dng b sinh phm Gene JET genomic DNA Purification Kit ca hóng Thermo (M) theo hng dn ca nh sn xut vi cỏc bc c th nh sau: Bng 3.1 Quy trỡnh tỏch chit DNA tng s Bc Thc hin Nghin mu bng nito lng, mu c nghin nỏt thnh huyn dch, ng nht Ly 20mg mu nghin cho vo ng eppendof 1,5ml B sung 180 l dung dch Digestion Solution, 20 l Protease-K trn u bng pipet thnh dung dch huyn phự mu 560C cho ti mụ phõn gii hon ton (khong gi) Vortex mu 30 phỳt/1 ln B sung thờm 20àl RNase, trn u ri nhit phũng 10 phỳt B sung 200l Lysis solution, ly tõm 15 phỳt hn hp ng nht B sung 400àl dung dch EtOH 50% Trn u bng pipet hoc vortex Dựng pipet (loi 1000 l) chuyn dch cỏc mu sang cỏc ct lc (mng lc) ca b kit trờn Ly tõm 13.000 vũng/phỳt phỳt B sung 500 l dch Wash Buffer I Ly tõm 13.000 vũng/phỳt phỳt B nc phớa di ca ct lc B sung 500 l dch Wash Buffer II Ly tõm 13.000 vũng/phỳt 21 1phỳt (2 ln) lm khụ mng lc sau ú chuyn ng ct vo ng eppendof 10 1,5ml Thờm 200àl Elution Buffer thụi DNA ct phỳt nhit 11 phũng, ly tõm 13000vũng/phỳt phỳt Loi b ct lcbo qun DNA -200C 3.4.3 Thit k cp mi thu nhn chui gen 18S ribosome Thit k cp mi c hiu thu nhn mt phn gen 18S rRNA ribosome ca H.melliagridis, sn phm PCR thu c cú kớch thc khong 0,5 kb Cp mi c thit k da trờn cỏc trỡnh t gen 18S rRNA ó c cụng b trờn ngõn hng gen Cp mi s dng thu nhn mt phn chui gen 18S ribosome mu nghiờn cu cú cỏc trỡnh t c th nh sau: Mi xuụi HMF: 5-GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3 Mi ngc HMR: 5-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3 3.4.5 Thc hin phn ng PCR v tinh sch sn phm Thc hin k thut PCR thu nhn chui gen 18S ribosome K thut PCR c thc hin thu nhn gen 18S s dng b kit PCR Master mix (Fermentas) Thnh phn phn ng PCR thc hin vi khuụn DNA tng s cú cha DNA ca Histomonas, hn hp c ng ng PCR (ng ependoff chu nhit, thnh mng cú dung tớch 0,2 ml), bao gm cỏc dung mụi ca phn ng (PCR master mix), mi xuụi, mi ngc, nc v khuụn vi tng th tớch l 50 l 22 Bng 3.2 Cỏc phn ng PCR STT Tờn phn ng HmH1pcr1 Mi HMF-HMR Th tớch HmH2pcr2 HMF-HMR 50 l HmH3pcr3 HMF-HMR 50 l HmC1pcr4 HMF-HMR 50 l HmC2pcr5 HMF-HMR 50 l HmC3pcr6 HMF-HMR 50 l 50 l Bng 3.3 Thnh phn cho mt phn ng PCR Thnh phn PCR Th tớch 2X PCR master mix 25àl Mi xuụi (HMF) (10pmol/àl) 2àl Mi ngc (HMR) (10pmol/àl) DMSO 2àl Khuụn 4àl Nc 15àl Tng 50àl Nhit 94C 94C 50C 72C C 4C Bng 3.4 chu k nhit ca phn ng PCR Thi gian Chu kỡ phỳt 1 phỳt phỳt 35 phỳt 10 phỳt Nhit bo qun Sn phm sau PCR c kim tra trờn thch agarose %, tinh sch bng b sinh phm GeneJET PCR Purification Kit (Thermo, M) theo hng dn ca nh sn xut 23 Bng 3.5 Quy trỡnh tinh sch sn phm PCR Cỏc bc Bc Thc hin Thờm Binding Buffer vo ng cha sn phm PCR vi t l 1:1 Vớ d 100àl sn phm PCR tng ng vi 100àl Binding Bc Buffer, trn u bng pipet Chuyn dch t bc lờn ct cú sn kit, ly tõm 13000v/1 Bc phỳt phỳt, loi b dch di Thờm 700àl Wash Buffer vo ct Ly tõm 13000v/1 phỳt Bc Bc Bc phỳt, loi b dch di Ly tõm 13000v/phỳt phỳt lm khụ ct Chuyn ct sang ng eppendof loi 1,5ml Thờm 50àl Elution Buffer vo ct, ly tõm 13000v/1 phỳt Bc phỳt, loi b ng ct Bo qun DNA -200C 3.4.6 Gii trỡnh t chui gen 18S ribosome Sau c tinh sch, sn phm c gi cho hóng MACROGEN Hn Quc xỏc nh trỡnh t 3.4.7 X lý chui gen v phõn tớch s liu Chui nucleotide thu c sau gii trỡnh t c x lý bng ChromasLITE v2.01; truy cp Blast ti a ch http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST thu nhn cỏc chui gen 18S ribosome tng ng cao cú Ngõn hng gen So sỏnh i chiu trỡnh t nucleotide ca chui gen nghiờn cu vi cỏc chui gen ó c cụng b trờn Ngõn hng gen bng chng trỡnh GENEDOC2.7 Kho sỏt mc tng ng nucleotide v mi quan h ph h ngun gc bng cỏch s dng chng trỡnh MEGA6.06, phng phỏp kt ni lin k (Neighbor Joining) vi h s tin tng (bootstrap) 1000 lp li (Tamura v cs., 2013) 24 TI LIU THAM KHO Ti liu ting vit Bựi Hu Dng, 2014 Tng quan v bnh u en Histomonas meleagridis trờn g Lờ Vn Nm (2010), Bnh gia cm Vit Nam Bớ quyt phũng tr bnh t hiu qu cao.,tr.160-163 Nxb H Ni 2012 Lờ Vn Nm (2011), Bnh u en g v g tõy, Tp Khoa hc Cụng ngh chn nuụi, tr 88 - 91 Trng Th Tớnh, 2015 Nghiờn cu bnh u en n bo histomonas meleagridis gõy g ti tnh Thỏi Nguyờn, Bc Giang v bin phỏp phũng tr bnh Ti liu ting anh Bleyen N., De Gussem K., De Gussem J., Goddeeris B M (2007), Specific detection of Histomonas meleagridis in turkeys by a PCR assay with an internal amplification control, Veterinary Parasitology, (143), pp 206 - 213 Callait-Cardinal M P., Leroux S., Venereau E., Chauve C M., Le Pottier G., Zenner L (2007), Incidence of Histomonosis in turkeys in France since the bans of dimetridazole and nifursol, Vet Rec., 161), pp 581 - 585 Cepicka, I., Hampl, V., and J Kulda 2010 Critical taxonomic revision of parabasalids with description of one new genus and three new species Protistology 161:400-433 Cushman S (1894), A study of the diseases of turkeys, In Sixth Annual Report of the Rhode Island Agricultural Experiment Station 1893, pp 286 - 288 Duc Tan Nguyen, Ivana Bilic, Barbara Jaskulska, Michael Hess, Duc Quyet Le, Luc Ngoc Le Hua, Vu Vy Huynh, Sam Thi Nguyen, and Hung Vu Khac (2015), Prevalence and Genetic Characterization of Histomonas meleagridis in Chickens in Vietnam, Avian Diseases, 59 (2), pp 309 314 10 Farr, M., 1961 Further observations on survival of the protozoan parasite, Histomonas meleagridis, and eggs of poultry nematodes in feces of infected birds Cornell Veterinarian 51, p3-13 11 Hafez H M., Hauck R., Lỹschow D., McDougald L (2005), Comparison of the specificity and sensitivity of PCR, nested PCR, and real-time PCR for the diagnosis of Histomoniasis, Avian Dis., 49 (3), pp 366 - 370 25 12 Hauck R., Balczulat S., Hafez H M (2010), Detection of DNA of Histomonas meleagridis and Tetratrichomonas ganillarum in German poultry flocks between 2004 and 2008, Avian Dis., 54 (3), pp 1021 - 1025 13 Hu J., Fuller L., Mc Dougald L R (2004), Infection of turkeys with Histomonas meleagridis by the cloacal drop method, Avian Diseases, 48, pp 746 - 750 14 Huber K., Chauve C., Zenner L (2005), Detection of Histomonas meleagridis in turkeys cecal droppings by PCR amplification of the small subunit ribosomal DNA sequence, Vet Parasitol., 131 (3 - 4), pp 311 316 15 Klodnicki M E., McDougald L R., Beckstead R B (2013), A genomic analysis of Histomonas meleagridis through sequencing of a cDNA library, J Parasitol, Apr; 99 (2), pp 264 269 16 Lee, D L., 1969 The structure and development of Histomonas meleagridis in the female reproductive tract of its host Heterakis gallinae Parasitologry 59, p877 884 17 Liebhart D., Weissenbock H., Hess M (2006), In-situ hybridization for the detection and identification of Histomonas meleagridis in tissues, J Comp Pathol., 135, pp 237 - 242 18 Lollis L., Gerhold R., Mc Dougald L., Beckstead R (2011), Molecular characterization of Histomonas meleagridis and other parabasalids in the United States using the 5.8S, ITS-1, and ITS-2 rRNA regions, J Parasitol, Aug; 97 (4), pp 610 615 19 Lund E E (1969), Histomoniasis, Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine, 13, pp 355 390 20 Lund E E., Chute A M (1974), Reciprocal transfer of Heterakis ganillarum larvae between ring-neck pheasants and Japanese quail: effects on H ganillarum, Histomonas meleagridis, and Parahistomonas wenrichi, Proc Helm Soc Wash, 41, pp 73 76 21 Mc Dougald L R., Fuller L (2005), Blackhead disease in turkeys: direct transmission of Histomonas meleagridis from bird to bird in a laboratory model, Avian Dis., 49 (3), pp 328 331 22 McDougald, L.R., 2005 Blackhead Disease (Histomoniasis) in Poultry: A Critical Review Avian Diseases Vol 49, p 462476 23 Mielewczik M., Mehlhorn H., Al - Quraishy S., Grabensteiner E., Hess M (2008), Transmission electron microscopic studies of stages of Histomonas meleagridis from clonal cultures, Parasitology Research, 103, pp 745 - 750 26 24 Sentớes-Cuộ G., Chin R P., Shivaprasad H L (2009), Systemic Histomoniasis associated with high mortality and unusual lesions in the bursa of Fabricius, kidneys, and lungs in commercial turkeys, Avian Dis., 53 (2), pp 231 - 238 25 Shivaprasaud H L., Sentớes-Cuộ G., Chin R P., Crespo R., Charlton B and Cooper G L.(2002), Blackhead in turkeys, a re-emerging disease?, In: Proceedings of the 4th International Conference on Turkey Diseases Berlin, Germany, 15 - 18 May Ed Hafez H M ISBN 936815 - 58-5, pp 143-144 26 Springer W.T J Johnson and Reid W M., 1969 Transmission of Histomoniasis with male Heterakis gallinarum (Nematoda) Parasitology 59, p 401 405 27 Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., and Kumar S (2013), MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0, Mol Biol Evol, 30, pp 2725 - 2729 28 Tyzzer E E (1920), The flagellate character and reclassification of the parasite producing "blackhead" in turkeys-Histomonas (gen nov.) melelagridis (Smith), J Parasitol, 6, pp 124 13 29 Tyzzer E E (1934), Studies on Histomoniasis, or"blackhead" infection in the chicken and turkey, Proc Amer Acad Arts Sci, 69, pp 189 - 264 30 Van der Heijden H M., Landman W J (2011), High seroprevalence of Histomonas meleagridis in Dutch layer chickens, Avian Dis., 55, pp 324 327 31 Van der Heijden H M., Stegeman A, Landman W J (2010), Development of a blocking - ELISA for the detection of antibodies against Histomonas meleagridis in chickens and turkeys, Vet Parasitol Aug 4; 171 (3-4), pp 216 222 32 Zaragatzki E., Hess M., Grabensteiner E., Abdel-Ghaffar F., Al-Rasheid K A and Mehlhorn H (2010), Light and transmission electron microscopic studies on the encystation of Histomonas meleagridis, Parasitol Res., 106 (4), pp 977 - 983 Trang Website 33 http://channuoivietnam.com/tinh-hinh-san-xuat-chan-nuoi-thang-62016/ 27