kỹ thuật chẩn đoán và đặc trưng phân tử của kudzu mosaic virus (kumv) hại đậu tương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN NGỌC TIỆP KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN VÀ ĐẶC TRƯNG PHÂN TỬ CỦA KUDZU MOSAIC VIRUS (KuMV) HẠI ĐẬU TƯƠNG CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS HÀ VIẾT CƯỜNG HÀ NỘI – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Kết nghiên cứu luận văn kết lao động tác giả Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Trần Ngọc Tiệp Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp cố gắng thân nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, bạn bè người thân Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hà Viết Cường – người trực tiếp hướng dẫn đóng góp nhiều ý kiến quan trọng cho suốt trình thực đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị cán Trung tâm Nghiên cứu Bệnh nhiệt đới, thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực hoàn thành đề tài tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè người tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ suốt trình học tập trình thực đề tài tốt nghiệp Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả luận văn Trần Ngọc Tiệp Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU viii 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sản xuất đậu tương giới Việt Nam 1.2 Họ Geminiviridae 1.3 Chi Begomovirus 1.3.1 Tầm quan trọng 1.3.2 Tổ chức gene 1.3.3 Cơ chế gây bệnh begomovirus 1.3.4 Lan truyền begomovirus 1.4 Begomovirus họ đậu 1.5 KuMV (Kudzu mosaic virus) 1.6 Kỹ thuật RCA 10 1.7 Kỹ thuật LAMP 12 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 15 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 15 2.1.4 Vật liệu nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 2.3 Dụng cụ thiết bị 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Kết kiểm tra PCR mẫu đậu tương bị bệnh virus với cặp mồi đặc hiệu cho KuMV 3.2 22 Thiết kế cấu trúc xâm nhiễm giải trình tự toàn bộ gene mẫu virus VNP134, VNP335, VNP951 VNP963 24 3.2.1 Chuẩn bị vector pCAMBIA 2300 24 3.2.2 Nhân toàn bộ gene mẫu KuMV RCA 26 3.2.3 Dòng hóa cấu trúc xâm nhiễm virus vi khuẩn E.coli 27 3.2.4 Giải trình tự toàn bộ gene mẫu virus 34 3.3 Đặc trưng phân tử mẫu virus 36 3.3.1 Tổ chức gene 36 3.3.2 Phân tích motif chức gene mẫu virus 41 3.3.3 So sánh trình tự phân tích phả hệ mẫu virus 48 3.4 Phát triển kỹ thuật chẩn đoán KuMV LAMP 52 3.4.1 Thiết kế mồi LAMP chẩn đoán KuMV 53 3.4.2 Đánh giá tính đặc hiệu mồi LAMP 56 3.4.3 Đánh giá độ nhạy phản ứng LAMP 57 3.4.4 Đánh giá khả phát KuMV kỹ thuật LAMP mẫu DNA chiết từ 59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 66 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Phân loại virus họ Geminiviridae theo ICTV năm 2013 2.1 Trình tự mồi sử dụng để giải trình tự toàn bộ gene KuMV 16 2.2 Thành phần phản ứng LAMP (Wei et al., 2012) 21 3.1 Kết kểm tra PCR phát KuMV 38 mẫu đậu tương 23 3.2 Kết dòng hóa mẫu KuMV (VNP134, VNP335, VNP951 VNP963) vector pCambia 2300 32 3.3 Kết giải trình tự toàn bộ gene mẫu KuMV 35 3.3 Đặc trưng phân tử DNA-A mẫu virus KuMV 37 3.4 Đặc trưng phân tử DNA-B mẫu virus KuMV 40 3.5 So sánh DNA-A mẫu virus nghiên cứu với mẫu KuMV sắn dây 49 3.6 Danh lục begomovirus sẵn có GenBank phân tích phả hệ 50 3.7 Trình tự mồi LAMP Primer-CP LAMP Primer-REP 55 3.8 Kết đánh giá tính đặc hiệu kỹ thuật LAMP chẩn đoán KuMV với mồi LAMP Primer-CP LAMP Primer-REP 3.9 57 Kết đánh giá độ nhạy kỹ thuật LAMP với mồi LAMP PrimerREP so sánh với kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi KuAFor1/KuAR1 3.10 58 Kết đánh giá khả phát KuMV kỹ thuật LAMP với mồi LAMP Primer-REP với mẫu DNA chiết từ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 60 Page v DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Hình thái phân tử geminivirus 1.2 Tổ chức gene begomovirus có gene kép 1.3 Cây đậu tương Hà Nội nhiễm KuMV 1.4 Cơ chế tái phân tử DNA mạch vòng kỹ thuật RCA (Rolling 10 Circle Amplification) dùng hexamer Φ29polymeraseDNA 1.5 Cơ chế nhân dòng DNA kỹ thuật LAMP 11 (Loop-mediated isothermal amplification) (Fujii et al., 2006) 14 2.1 Sơ đồ tạo cấu trúc xâm nhiễm KuMV có ứng dụng kỹ thuật RCA 20 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR phát KuMV 38 mẫu đậu tương với cặp mồi đặc hiệu 22 3.2 Sơ đồ vector pCAMBIA 2300 25 3.3 Kết chuẩn bị vector pCAMBIA 2300 cho biến nạp 26 3.4 Kết điện di sản phẩm RCA cắt không hoàn toàn enzyme cắt giới hạn BamHI 27 3.5 Kết nhân dòng sản phẩm monomer (~2,7kb) mẫu VNP335 29 3.6 Kết nhân dòng sản phẩm dimer (~5,4kb) mẫu VNP134 VNP951 30 3.7 Kết nhân dòng sản phẩm dimer (~5,4kb) mẫu VNP963 31 3.8 Tổ chức gene mẫu virus KuMV 39 3.9 Kết phân tích motif chức vùng chung CR (common region) mẫu virus 42 3.10 Kết phân tích motif chức protein Rep mẫu virus 45 3.11 Protein CP mẫu KuMV với motif gốc axít amin chủ chốt liên quan đến chức lắp ráp virion, lan truyền qua vector nhập nhân đánh dấu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 47 Page vi 3.12 Cây phả hệ dựa DNA-A begomovirus hại đậu đỗ 52 3.13 Vị trí mồi LAMP vùng gene mục tiêu 53 3.14 Kết thiết kế mồi LAMP vùng gene CP Rep sử dụng phần mềm Primer Explorer V4 55 3.15 Kết điện di sản phẩm phản ứng LAMP với mồi 56 3.16 Kết điện di đánh giá độ nhạy kỹ thuật LAMP với mồi LAMP Primer-REP so sánh với kỹ thuật PCR 3.17 58 Kết điện di đánh giá khả phát KuMV kỹ thuật LAMP với mồi LAMP Primer-REP với mẫu DNA chiết từ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 59 Page vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Từ viết tắt Bộ NN PTNT Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn Bp Base pair CP Capsit protein CR Common region CTAB Cetryl Ammonium Bromide DNA Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxynucleotide triphotphate dsDNA Double DNA E.coli Escherichia coli FAO Food and Agriculture Organization ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses IR Intergenic region Kb Kilobase KuMV Kudzu mosaic virus LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification LB Luria and Bertani ORF Open reading frame ori Origin of replication PCR Polymerase chain reaction RCA Rolling Circle Amplification RE Restriction enzyme Ren Replication enhancer protein Rep Replication protein ssDNA Singe strand DNA TYLCV Tomato yellow leaf curl virus Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây đậu tương hay đậu nành (Glycine max) trồng có tầm quan trọng số họ đậu (Fabaceae), nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng kinh tế cao Hiện nay, đậu tương có diện tích, suất sản lượng lớn tất họ đậu (Maesen and Somaatmadja, 1996) Tại Việt Nam, đậu tương trồng có ý nghĩa kinh tế cao Tuy nhiên, đậu tương bị công nhiều bệnh hại, đặc biệt virus Theo Iwaki (1993) có tới 13 loài virus gây hại đậu tương Đông Nam Á Gần đây, Kudzu mosaic virus (KuMV) phát thấy đậu tương bị bệnh khảm vàng Hà Nội số tỉnh khác thuộc miền Bắc Việt Nam (Hà Viết Cường, 2010) Khám phá quan trọng lần KuMV phát thấy đậu tương, trồng có ý nghĩa kinh tế cao Việt Nam giới KuMV thuộc chi Begomovirus, thuộc họ Geminiviridae, phát lần sắn dây tỉnh Hòa Bình năm 2005 (Ha et al., 2008) phát thấy sắn dây Trung Quốc năm 2008 (mã số GenBank FJ539014) Vì KuMV begomovirus nên nhiều đặc tính chung nhóm virus hiểu rõ chúng virus có gene DNA, mạch vòng, sợi đơn, không truyền qua hạt giống, lan truyền tự nhiên nhờ bọ phấn (Bemisia tabaci) có khả tái tổ hợp cao Tuy nhiên virus nên nhiều đặc điểm KuMV cần phải nghiên cứu Đối với bệnh virus thực vật, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào lĩnh vực: (i) Nguyên nhân gây bệnh (đặc điểm hình thái, phân tử/di truyền, phân loại, chẩn đoán…), (ii) Các đặc trưng sinh học (phạm vi ký chủ, quan hệ vector, tính chất gây bệnh, tính hướng mô, chức gene…), (iii) Dịch tễ bệnh (ảnh hưởng tương tác yếu tố bệnh học ký chủ - điều kiện ngoại cảnh - virus đến phát triển bệnh qui mô quần thể) (iv) Phòng chống (các chiến lược chiến thuật phòng trừ bệnh) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ctctagtgctgcttctttagagagagaacaccttgggtatgtgaggaagaagtttt tggcattaacccgaaaaccctttggtctagacattatgtgaagagtttctctctct tgacaccaattggggtcgattcatttatcgccctagtattagtgtcgcatatatag tagtgacaccaatgacgtggaaagcggccatccgaataatatt VNP134-8: accaggacgcgcccggtgcctttggtgcggtgtggtcccccccgcctagtgctttc aatctcgtccgaacgttttcgttagtcttcgcgcgtggtgtgaatgcgccgtaatg cgcttgccgcaaataacgttataactgctttaatttgaatttctttaaattatgtg gaataccgggaacaccctttggtgtgatatacataacagctatatgtgcactatga gagtgcaaattggtaattgttagcaaacaattacatttcaaccgttcaggatttta ttttaagcttttagctacgatttgtgtgtgaatgatattataaacatggcctgtcc ctataaaggggattatgtctatattatagaacatgtgaaagaaaatatacttattt tcagtcttagccatgtttactcctcgagcaactcctcgtaattatcctcgtcgttt caatgggcaatttaagcgtaaattgcgtccatacaataggggtcttaacacgtatc gtaaattacgtgttgctcgaaagttatcctatgatccatctgttcgtcccttgtct ataaatacacttgttgaacggcaacatggttcacatatgacccttggaagtaattc ggatattacttcatttgttgaatatccagttcgtggtattaatggtgatggtcgtt caagggactacatcaagttgcttcatttatcagcctcaggcgttattaacgttaag gtcggttcttcagatcaagtgatggatgctggttctcgtcacaacggcgtatttgt gatgagtttgcttcaggacatgaagccgtttttacctgacggcgtcaatagcttgc caacatatgctgagttattcggaccatattcttctgcctatgttaatatgcattta ttggatagccataaacagcgttttaggattttaggtagcgtaaaaaaatttgtaag ttgtggtttggatgcggtagacatccctttcaagttagaacttaagctatccaatg ggaggtatccattgtgggcgtcatttaaagacgcagaagagggtaattgtgggggc aattatagaaatattgccaaaaatgcaataattgtaagctatgcatttgtttcatt gcatagccttaagtgtgaaccatttgtacaatttgaactccgttatatgggataat aaaatgattttattcattttgtgcttttaattacaatggtttggatacattggatc tctgcgtaactaaacacctgttaatggttgtttcgataatgctctcgatgtccgct cttgtaaccggattggtttgcgcctgtgagactgagtctcccgggtctaatgacga ctcaggtaatttgtgcatgtgttttagaggaaattctgcgtcggacgagattgtcc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 69 tgtgctcaaggcccattatattgttgtctggataccgcattgacgtgctgcgtcca atagtcgaccgtgtggcccatgtctctccaggctgtaataacatgggcctttggcg ctgtagcccgtcaggaccacatcctggcgttggtgttaatagtcgtctgatgggtt tgggcctctcgacagaccaaaagtccacgcaatccgctgtgtagtctttggacaat atttttattgttggcggtttgtatttaatgtctgtcgaatgttttgccgccgataa cttcaacttgccctttatttgggcaaatgctgtgccgtcgttgacgtttgagtctt ctactttgtatagaagctcccatggcgtctcatctttgatggagaaaaatgaggat gaaaagtaatgcagatcaacgttacagccaatggggaatgtgaaagctgcctgtgc agcctgatcatcgcttaatcttgtgtcacgtatggtgacgatgacacttccagttg cattgtaaggtacttggttacgatactcaattactatatggtcaaccttcatgcat tttcccagcattttaactgccgcttgttctatggacgacggaaattgaagagtaat tggagtttcgttgtttgtcagacggtattcgcatcgctttgattgaatatacttgt ttgtgaccagtgctccagagtatgtctccatgtgtaacacacacccgtctacaact gaataggataatgcgatgtttgttgaccttgatcctgcaaatataaactaataatt tattcttatttggccgcgcagcggcatcattcggagatttatactccgatacaagg ctaattgcaataaacaaaataaggtgcacaacaagtagtttcttgactatatggca gctggagagctgttgcatgctatgcaaaataagcaacttgaaaacaaacctgaata gagcaatattcagatacaagtgtgattatcttgcttggtagaagattttcagttct caaaatattttatagtaaaaaagttaacttaggatccatcccttatgcttaaataa gggtattcttatttaagccagaagcaagggccttgatagtgtttcacctgctcgaa ttctagagagaagttggagtttctctctctagcgacaccgattggggtcaattcat ttatcgccctagtattagtgtcgcatatatacttgtgacaccgatctacgtggcag ctgatgtcatccacccgacacgcgcgtcctgttataatatt VNP951-4: accggatggccgcgcttcggtgtccctcaaatcccctgacgtggcgttctctggcg cctcgcacatggcttagataatttgaaatttgaattataaacgtgcgctctaaggc gcctttgctttaaacatgtgggatcctttgttgaacgcctttcctgacaggttgca tggattccgctgcatgttagcagtgaagtacttgcacttagtgctgtcaacatatc ccgagaataccgtagggtattggtttttgcgtgatttgatacaggtattacgctcc aaggatcatgacaaagcggaatttcgatacggcattctcaagtccgatatcctcgg Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 70 cacggcggagactgagttacggaaccccgttagcgttgcctgcacctgctgccagt gcccaaggcacccgaagacgacgagcatggacaaaccgtccgatgtacaggaagcc tcgtctgtatcgtatgtatcgaagcccagacgtcccccgcggttgtgagggcccct gtaaggttcaatcatttgaacaaaggcatgatatttcccatgttgggaaagtaatt tgtgtttctgacgtcactcgtggtggtggtatcactcaccgagttggcaagcgttt ttgcattaagtctatctatgtttcaggtaaagtttggatggatgaaaacattaagc tcaagaatcacaccaacagtgtgctattttggttgactcgtgataggcgacctttt ggcacggcaatggattttggtcaagtttttaacatgtatgacaatgagcctagtac tgccaccgtgaagaacgacctacgtgatcgtttccaggttctgcatcgatggaatg ccaccgttacaggtggccaatatgcctgtaaggaacaggcgttagttaggcgcttt tataaagtttataatcatgttgtgtataatcatcaggaagctgcaaagtatgacaa ccatactgagaatgctctgttgttgtatatggcatgtactcatgcatcaaacccag tgtacgcaacattgaagatacggatctatttttacgattcgatatcgaattaataa agcttgtattgcacattatgattgagtgttacatcatcaacatgttcaaatacatt aaacaatacatgcgaacacgcttgtaatacagttgatagactaataactcctaaat tattaatataacgtaataattgtcttttaaaagtcgagcaaatccgcccactcggc tgtatgaaacgatggtaaatcgtcaagtccaggaaggccttgtgtatccccaacgc tttcttcagagagtggttgaacattatgcggattgttgtccggaacttttgccact ggatgaggttgtggtaccatactctgtcgtggtccatgatcttgaaactcagggga tttgctacctcccaagtaaagacgccattctctagctgagctgcagtgatgctcac ccctgtgcgtaaatccatggttgtagcagttgatatgtaggtagtaactacatcca cacttcaggtcaattcgtctgcgtcgaattgcacgtttcttggccaacctgtgttg cgccttgattggtggtggagaacagaggttctgtgagcgtgtagaagatagcattt tttaaagcccactctttgagactcgcattattctcttcgtcgagaaacattttata agaggatctgggtcccgcattacagagaaagatggtggggattccacctttaattt gagtgcgctttccgtatttgacgttgctttgccagtccttttgcgcgcccatgaat tctttgaaatgtttcagataatgcggatcgacgtcatcgattacgttgtaccacgc atcatttgaataaactttggcgcttagatccaaatggccgcacaaataattgtgcc gaccgagcgacctcgcccacatggttttacccgtacgtgactcaccctcaaccact atactaataggtctgaatggccgcgcagcggggcacaccacgttctcagctgccca Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71 tgacgtcaatgtctcagggacattattgaatgattcaatactgaatggtgtttcgt acactgttggcggtggtgcaaaaaggaagtttaggttggctctgatattgtgcaaa tggattatgaagtctctcgacgctttctcctttaatatattgagggccgatgttgt atcgcctgaattgattgcttcggcatatgcgtcatttgcacattgagaacctcctc tatttgatctcccgtcgatctggaaaattccaaaatcaatgacgtctccgtctttc tccatgtactttttaacatctgagctgctcttagctccctgaatgttcggatggaa atgtgctgacctggtttcggatatgaggtcgaagaacctttcgttgcggcactgga attttccttcaaattgaagcagaacatggaggtgaggttccccattttcatggaac tcacgacaaactctgatgaatttcttgttgacgttagtctgaatattctgtagctg ctctagtgctgcttctttagagagagaacaccttgggtatgtgaggaagaagtttt tggcattaacccgaaaaccctttggtctagacattatgtgaagagtttctctctct tgacaccaattggggtcgattcatttatcgccctagtattagtgtcgcatatatag tagtgacaccaatgacgtggaaagcggccatccgaataatatt VNP951-8: accaggacgcgcccggtgcctttggtgcgctgtggtccccgcgcccatgtgctttc aatctcgtccgcatgtttttgctagtttccgcgcgtagtgtgaacgcgccgtaatg cgcttgtcgcaaataacgatattgttgctttaatttgaattttatcaaattacttc gtctaccccttcgcgttacaaatatctcacctatacgtgcactcttcatgtgcaat ttggtatatacaagttggctgtactattacttgtcaaccgttcaggtatttatgtt aatgttgtggcgtgagatttgtttgttgactatataataaacatggcctcgtccta taaaagggattatgttgatattacagaacatgtgaaagaaaatatttctattttca taattcgccatgtttactcctagagcaactccgcgtaattatcctcgtcgtttcaa tgggcaatttaagcgtaaattgcgtccatatattaggggtctgaacacgtatcgta aattacgtgttgctcgcaagttatcttacgatccatctctccgtccgttgtctata aatacaattgttgaacggcaacatggttcacacatgacccttggaagtaattcgga tattacttcatttgttgaatatccagttcgtggtattaatggtgatggtcgttcaa gggactacatcaaattgcttcatttatcagcctcaggcgttattaacgttaaggtt gcctcgtcggatcaagtaatggatgctggttctcgtcacaacggcgtatttgtgat gagtttgcttcaggacatgaagccgtttctacctgacggcgtcaatagtttgccaa catatgctgagttattcggaccttattcgtctgcctatgttaatatgcatttattg Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 gatagccataaacagcgttttaggattttgggtagcgttaaaaaatttgtaacttg tggtatggatgcggttgacatccctttcaagttagaacttaagctatccaatggga ggtatccattatgggcgtcatttaaagacgcggaagagggtaattgtgggggcaat tatagaaatattgccaaaaatgcaataattgtaagctatgcatttgtttcattgca tagccttaagtgtgaaccatttgtacaatttgaactccgttatatgggataataaa atgattttattcattttgtgtttttaattacaatggtttggatacattggatctct gcgtaactaaacacctgttaatggttgtttcgataatgctctcgatgtccgctctt gtaaccggattggtttgcgcctgtgagactgagtctcccgggtctaatgacgactc aggtaatttgtgcatgtgttttagaggaaattctgcgtcggacgagattgtcctgt gctcaaggcccattatattgttgtctggataccgcattgacgtgctgcgtccaatt gtggaccgtgtggcccatgtctccccaggctgtaataacatgggcctttggcgctg tagcccatcaggaccacatcctggcgttggtgttaatagtcttctgatgggtttgg gcctctcgacagaccaaaagtccacgcaatcccgctgtgtagtctttggacaatat ttttattgttggcggtttgtatttaatgtctgtcgaatgttttgccgccgataact tcaacttgccctttatttgggcaaatgctgtgccgtcgttgacgtttgagtcttct actttgtatagaagctcccatggcgtctcatctttgatggagaaaaatgaggatga aaagtaatgcagatcaacgttacagccaatggggaatgtgaaagctgcctgtgcag cctgatcatcgcttaatcttgtgtcacgtatagtgacgatgacacttccagttgca ttgtaaggtacttggttacgatactcaattactatatggtcaaccttcatgcattt tcccagcattttaactgccgcttgttctatggacgacggaaattgaagagtaattg gagtttcgttgtttgtcagacggtattcgcatcgctttgattgaatatacttgttt gtgaccagtgctccagagtatgtctccatgtgtaacacacacccgtctacaactga atagtataatgcgatgtttgttgaccttgatcctgcaaatataaactaataattta ttgttatttggccgcgcagcggcatcattcggagatttatactccgatacaaggct aattgcaataaacaaaataaggtgcacaagaagcagcttcttgactatatggcagc tggagagctgttgcatgctatgcaaaataagcaacttaaaaacaaacctgaataga gcaatattcagatacaagtgtgattatcattcttggtagaagattttcagttctca aaatattttatagtacaaaagttaacttaggatccatcccttatgcttaaataagg gtattcttatttaagccagaagcaagggccttgatagtgtttcacctgctcgaatt ctagagagaagttggagtttctctctctagcgacaccgattggggtcaattcattt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 73 atcgccctagtattagtgtcgcatatatacttgtgacaccgatctacgtggcagct gatgtcatccacccgacacgcgcgtcctgttataatatt VNP963-17 accggatggccgcgcttcggtgtccctcaaatcccctgacgtggcgttctctggcg cctcgcacatggcttagataatttgaaatttgaattataaacgtgcgctctaaggc gcctttgctttaaacatgtgggatcctttgttgaacgcctttcctgacaggttgca tggattccgctgcatgttagcagtgaagtacttgcacttagtgctgtcaacatatc ccgagaataccgtagggtattggtttttgcgtgatttgatacaggtattacgctcc aaggatcatgacaaagcggaatttcgatacggcattctcaagtccgatatcctcgg cacggcggagactgagttacggaaccccgttagcgttgcctgcacctgctgccagt gcccaaggcacccgaagacgacgagcatggacaaaccgtccgatgtacaggaagcc tcgtctgtatcgtatgtatcgaagcccagacgtcccccgcggttgtgagggcccct gtaaggttcaatcatttgaacaaaggcatgatatttcccatgttgggaaagtaatt tgtgtttctgacgtcactcgtggtggtggtatcactcaccgagttggcaagcgttt ttgcattaagtctatctatgtgtcaggtaaagtttggatggatgaaaacattaagc tcaagaatcacaccaacagtgtgctattttggttgactcgtgataggcgacctttt ggcacggcaatggattttggtcaagtttttaacatgtatgacaatgagcctagtac tgccaccgtgaagaacgacctacgtgatcgtttccaggttctgcatcgatggaatg ccaccgttacaggtggccaatatgcctgtaaggaacaggcgttagttaggcgtttt tataaagtttataatcatgttgtgtataatcatcaggaagctgcaaagtatgacaa ccatactgagaatgctctgttgttgtatatggcatgtactcatgcatcaaacccag tgtacgcaacattgaagatacggatctatttttacgattcgatatcgaattaataa agcttgtattgcacattatgattgagtgttacatcatcaacatgttcaaatacagt aaacaatacatgcgaacacgcttgtaatacagttgatagactaataactcctaaat tattaatataacgtaataattgtcttttaaaagtcgagcaaatccgcccactcggc tgtatgaaacgatggtaaatcgttaagtccaggaaggccttgtgtatccccaacgc tttcttcagagagtggttgaacattatgcggattgttgtccggaacttttgccact ggatgaggttgtcgtaccatactctgtcgtggtccatgatcttgaaactcagggga tttgctacctcccaagtaaagacgccattctctagctgagctgcagtgatgctcac ccctgtgcgtaaatccatggttgtagcagttgatatgtaggtagtaactacaccca Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74 cacttcaggtcaattcgtctgcgtcgaattgcacgtttcttggccaacctgtgttg cgccttgattggtggtggagaacagaggttctgtgagcgtgtagaagatagcattt tttaaagcccactctttgagactcgcattattctcttcgtcgagaaacattttata agaggatctgggtcccgcattacagagaaagatggtggggattccacctttaattt gagtgggctttccgtatttgacgttgctttgccagtccttttgcgcgcccatgaat tctttgaaatgtttcagataatgcggatcgacgtcatcgattacgttgtaccacgc atcatttgaataaactttggcgcttagatccaaatggccgcacaaataattgtgcc gaccgagcgacctcgcccacatggttttacccgtacgtgactcaccctcaaccact atactaataggtctgaatggccgcgcagcggggcacaccacgttctcagctgccca tgacgtcaatgtctcagggacattattgaatgattcaatactgaatggtgtttcgt acactgttggcggtggtgcaaaaagaaagtttaggttggctctgatattgtgcaaa tggattatgaagtctctcgacgctttctcctttaatatattgagggccgatgttgt atcgcctgaattgattgcttcggcatatgcgtcatttgcacattgtgaacctcctc tatttgatctcccgtcgatctggaaaattccaaaatcaatgacgtctccgtctttc tccatgtactttttaacatctgagctgctcttagctccctgaatgttcggatggaa atgtgctgacctggtttcggatacgaggtcgaagaacctttcgttgcggcactgga attttccttcaaattgaagcagaacatggaggtgaggttccccattttcatggaac tcacgacaaactctgatgaatttcttgttgacgttagtctgaatattctgtagctg ctctagtgctgcttctttagagagagaacaccttgggtatgtgaggaagaagtttt tggcattaacccgaaaaccctttggtctagacattatgtgaagagtttctctctct tgacaccaattggggtcgattcatttatcgccctagtattagtgtcgcatatatag tagtgacaccaatgacgtggaaagcggccatccgaataatatt VNP963-16 accaggacgcgcccggtgcctttggtgcgctgtggtccccgcgcccatgtgctttc aatctcgtccgcatgtttttgctagtttccgcgcgtagtgtgaacgcgccgtaatg cgcttgtcgcaaataacgatattgttgctttaatttgaattttatcaaattacttc gtctatcccttcgcgttacaaatatctcacctatacgtgcactcttcatgtgcaat ttggtatatacaagttggctgtactattacctgtcaaccgttcaggtatgtatgtt aatgttgtggcgtgagatttgtttgttgactataaaataaacatggcctcgtccta taaaagggattatgttgatattacagaacatgtgaaagaaaatatttctattttca Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 75 taattcgccatgtttactcctagagcaactccgcgtaattatcctcgtcgtttcaa tgggcaatttaagcgtaaattgcgtccatataataggggtctgaacacgtatcgta aattacgtgttgctcgcaagttatcttacgatccatctctccgtccgttgtctata aatacaattgttgaacggcaacatggttcacacatgacccttggaagtaattcgga tattacttcatttgttgaatatccagttcgtggtattaatggtgatggtcgttcaa gggactacatcaaattgcttcatttatcagcctcaggcgttattaacgttaaggtt gcctcgtcggatcaagtaatggatgctggttctcgtcacaacggcgtatttgtgat gagtttgcttcaggacatgaagccgtttctacctgacggcgtcaatagtttgccaa catatgctgagttattcggaccttattcgtctgcctatgttaatatgcatttattg gatagccataaacagcgttttaggattttgggtagcgttaaaaaatttgtaacttg tggtatggatgcggtagacatccctttcaagttagaacttaaactatccaatggga ggtatccattatgggcgtcatttaaagacgcggaagagggtaattgtgggggcaat tatagaaatattgccaaaaatgcaataattgtaagctatgcatttgtttcattgca tagccttaagtgtgaaccatttgtacaatttgaactccgttacatgggataataaa atgattttattcattttgtgtgtttaattacaatggtttggatacatttgatctct gcgtaactaaacacctgttaatggttgtttcgataatgctctcgatgtccgctctt gtaaccggattggtttgcgcctgtgagactgagtctcccgggtctaatgacgactc aggtaatttgtgcatgtgttttagaggaaattctgcgtcggacgagattgtcctgt gctcaaggcccattggaatgttgtctggataccgcattgacgtgctgcgtccaatt gtggaccgtgtggcccatgtctccccaggctgtaataacatgggcctttggcgctg tagcccgtcaggaccacatcctggtgttggtgttaatagtcgtctgatgggtttgg gcctctcgacagaccaaaagtccacgcaatccgctgtgtagtctttggacaatatt ttaattgttggcggtttgtatttgatgtctgtcgaatgttttgccgccgataattt cagtttgccctttatttgggcaaatgctgtgccgtcgttgacgtttgagtcttcta ctttgtatagaagctcccatggcgtttcgtctttgatggagaaaaaggaggatgaa aagtagtgcagatcaacgttacacccaatggggaatgtaaaagctgcctgtgcagc ttgatcgtcgcttaatcttgtgtcacgtatagtgacaataacacttccagttgcgt tgtaaggcacttggttacgatactcaattactatatggtcaaccttcatgcatttg cccagcattttaactgccgcttgttctatggacgacggaaattgaagagtaattgg agtttcgttgtttgtcagacggtattcgcatcgctttgattgaatatacttgtttg Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 76 tgactagtgctccagagtatgtctccatgtgtaacacacacccgtctacaactgaa tagtataatgcgatgtttgttgaccttgatcctgcaaatataaactaataatttaa tcttatttggccgcgcagcggcatcattcggagatttatactccgatacaaggcta attgcaataaacaaaataaggtgcacaacaagtagcttcttgactatatggcagct ggagagctgttgcatgctatgcaaaataagcaacttaaaaacaaacctgaatagag caatattcagatacaagtgtgattatcttgcttggtagaagattttcagttctcaa aatattttatagtaaaaaagttaacttaggatccatcccttatgcttaaatagggg tattgttatttaagccacaagcaagggccttgatagtgtttcacctgctcgaattc tagagagaagttggagtttctctctctagcgacaccgattggggtcaattcattta tcgccctagtattagtgtcgcatatatacttgtgacaccgatctacgtggcagctg atgtcatccacccgacacgcgcgtcctgttataatatt DT1-KuMV-A-3 accggatggccgcgcttcggtgtccctcaaatcccctgacgtggcgttctctggcg cctcgcacatggcttagataatttgaaatttgaattataaacgtgcgctctaaggc gcctttgctttaaacatgtgggatcctttgttgaacgcctttcctgacaggttgca tggattccgctgcatgttagcagtgaagtacttgcacttagtgctgtcaacatatc ccgagaataccgtagggtattggtttttgcgtgatttgatacaggtattacgctcc aaggatcatgacaaagcggaatttcgatacggcattctcaagtccgatatcgtcgg cacggcggagattgagttacggaaccccgttagcgttgcctgcacctgctgccagt gcccaaggcacccgaagacgacgagcatggacaaaccgtccgatgtacaggaagcc tcgtctgtatcgtatgtatcgaagcccagacgtcccccgcggttgtgagggcccct gtaaggttcaatcatttgaacaaaggcatgatatttcccatgttgggaaagtaatt tgtgtttctgacgtcactcgtggtggtggtatcactcaccgagttggcaagcgttt ttgcattaagtctatctatgtttcaggtaaagtttggatggatgaaaacattaagc tcaagaatcacaccaacagtgtgttattttggttgactcgtgataggcgacctttt ggcacggcaatggattttggtcaagtttttaacatgtatgacaatgagcctagtac tgccaccgtgaagaacgacctacgtgatcgtttccaggttctgcatcgatggaatg ccaccgttacaggtggccaatatgcctgtaaggaacaggcgttagttaggcgtttt tataaagtttataatcatgttgtgtataatcatcaggaagctgcaaagtatgacaa ccatactgagaatgctctgttgttgtatatggcatgtactcatgcatcaaacccag Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 77 tgtacgcaacattgaagatacggatctatttttacgattcgatatcgaattaataa agcttgtattgcacattatgattgagtgttacatcatcaacatgttcaaatacagt aaacaatacatgcgaacacgcttgtaatacagatgatagactaataactcctaaat tattaatataacgtaataattgttttttaaaagtcgagcaaatccgcccactcggc tgtatgaaacgatggtaaatcgtcaagtccaggaaggccttgtgtatccccaacgc tttcttcagagagtggttgaacattatgcggattgttgtccggaactttggccact ggatgaggttgtggtaccatactctgtcgtggtccatgatcttgaaattcagggga tttgctacctcccaagtaaagacgccattctctagctgagctgcagtgatgctcac ccctgtgcgtaaatccatggttgtagcagttgatatgtaggtagtaactacaccca cacttcaggtcaattcgtctgcgtcgaattgcacgtttcttggccaacctgtgttg cgccttgattggtggtggagaacagaggttctgtgagcgtgtagaagatagcattt tttaaagcccactctttgagactcgcattattctcttcgtcgagaaacattttata agaggatctgggtcccgcattacagagaaagatggtggggattccacctttaattt gagtgggctttccgtatttcacgttgctttgccagtccttttgcgcgcccatgaat tctttgaaatgtttcacataatgcggatccacgtcatctattatgttgtaccacgc atcatttgaataaactttggcgcttagatccaaatggccgcacaaataattgtgcc gaccgagcgacctcgcccacatggttttacccgtacgtgactcaccctcaaccact atactgataggtctgaatggccgcgcagcggggcacaccacgttctcagctgccca taacgtcaatgtctcagggacattattgaatgattcaatactgaatggtgtttcat acactgttggcggtggtgcaaaaagaaagttaaggttggctctgatattgtgcaaa tggattatgaagtctctcgacgctttctcctttaatatattgagggccgatgttgt atcgcctgaattgattgcttcggcatatgcgtcatttgcacactgagaacctcctc tatttgatcttccgtcgatctggaaaattccaaaatcaatgacgtctccgtctttc tccatgtactttttaacatctgagctgctcttagctccctgaatgttcggatggaa atgtgctgacctggtttcggatacgaggtcgaagaacctttcgttgcggcactgga attttccttcaaattgaagcagaacatggaggtgaggttccccattttcatggaac tcacgacaaactctgatgaatttcttgttgacgttagtctgaatattctgtagctg cgctagtgctgcttctttagagagagaacaccttgggtatgtgaggaagaagtttt tggcattaacccgaaaaccctttggtctagacattatgtgaagagtttctctctct tgacaccaattggggtcgattcatttatcgccctagtattagtgtcgcatatatag Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 78 ttgtgacaccaatgacgtggaaagcggccatccgaataatatt DT1-KuMV-B-7 accaggacgcgcccggtgcctttggtgcgttgtggtccccgcgcccatgtgctttc aatctcgtccgcatgtttttgctagtctccgcgcgtagtgtgaacgcgtcgtaatg cgcttgtcgcaaataacgatattgttgctttaatttgaattttatcaaattacttc gtctaccccttcgcgttacaaatatctcacctatacgtgcactcttcatgtgcaat ttggtatatacaagttggctgtactattacctgtcaaccgttcaggtatttatgtt aatgttgtggcgtgagatttgtttgttgactatataataaacatggcctcgtccta taaaagggattatgctgatattatagaacatgtgaaagaaaatatttctattttca taattcgccatgtttactcctagagcaactccgcgtaattatcctcgtcgtttcaa tgggcaatttaagcgtaaattgcgtccatataataggggtctgaacacgtatcgta aattacgtgttgctcgcaagttatcttacgatccatcgctccgtccgttgtctata aatacaattgttgaacggcaacatggttcacacatgacccttggaagtaattcgga tattacttcatttgttgaatatccagttcgtggtattaatggtgatggtcgttcaa gggactacatcaaattgcttcatttatcagcctcaggcgttattaacgttaaggtt gcgtcgtcggatcaagtaatggatgctggttctcgtcacaacggcgtatttgtgat gagtttgcttcaggacatgaagccgtttctacctgacggcgtcaatagtttgccaa catatgctgagttattcggaccttattcgtctgcctatgttaatatgcatttattg gatagccataaacagcgttttaggattttgggtagcgttaaaaaatttgtaacttg tggtatggatgcggtagacatccctttcaagttagaacttaagctatccaatggga ggtatccattatgggcgtcatttaaagacgcggaagagggtaattatgggggcaat tatagaaatattgccaaaaatgcaatcattgtaagctatgcatttgtttcattgca tagccttaagtgtgaaccatttgtacaatttgaactccgttatatgggataataaa atgattttattcattttgtgtttttaactacaatggtttggatacattggatctct gcgtaactaaacacctgttaatggttgtttcgataatgctctcgatgtccgccctt gtaaccggattggtttgcgcctgtgagaccgaatctcccgggtctaatgacgactc agtaatttgtgcatgtgttttagaggaaattctgtgtcggacgagattgtcctgtg ctcaaggcccattatattgttgtctggataccgcattgacgtgctgcgtccaatag tcgaccgtgtggcccatgtctctccaggctgtaataacatgggcctttggcgctgt agcccgtcaggaccacatcctggcgttggtgttaatagtcgtctgatgggtttggg Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 79 cctctcgacagaccaaaagtccacgcaatccgctgtgtagtctttggacaatattt ttattgttggcggtttgtatttaatgtctgtcgaatgttttgccgccgataacttc aacttgccctttatttgggcaaatgctgtgccgtcgttgacgtttgagtcttctac tttgtatagaagctcccatggcgtctcatctttgatggagaaaaatgaggatgaaa agtaatgcagatcaacgttacagccaatggggaatgtgaaagctgcctgtgcagcc tgatcatcgcttaatcttgtgtcacgtatagtgacgatgacacttccagttgcatt gtaaggtacttggttacgatactcaattactatatggtcaaccttcatgcattttc ccagcattttaactgctgcttgttctatggacgacggaaattgaagagtaattgga gtttcgttgtttgtcagacggtattcgcatcgctttgattgaatatacttgtttgt gaccagtgctccagagtatgtctccatgtgtaacacacacccgtctacaactgaat agtataatgcgatgtttgttgaccttgatcctgcaaatataaactaataatttatt cttatttggccgcgcagcggcatcattctgagatttatactccgatacaaggctaa ttgcaataaacaaaataaggtgcacaacaagtagcttcttgactatatggcagctg gagagctgttgcatgctatgcaaaataagcaacttaaaaacaaacctgaatagagc aatattcagatagaagtgtgattatcttgcttggtagaagattttcagttctcaaa atattttatagtaaaaaagttaacttaggatccatcccttatgcttaaataagggt attcttatttaagccagaagcaagggccttgatagtgtttcacctgctcgaattct agagagaagttggagtttctctctctagcgacaccgattggggtcaattcatttat cgccctagtattagtgtcgcatatatacttgtgacaccgatctacgtggcagctga tgtcatccactcgacacgcgcgtcctgttataatatt VNP335-1 accggatggccgcgcttcggtgtccctcaaatcccctgacgtggcgttctctggcg cctcgcacatggcttagataatttgaaatttgaattataaacgtgcgctctaaggc gcctttgctttaaacatgtgggatcctttgttgaacgcctttcctgacaggttgca tggattccgctgcatgttagcagtgaagtacttgcacttagtgctgtcaacatatc ccgagaataccgtcgggtattggtttttgcgtgatttgatacaggtattacgctcc aaggatcatgacaaagcggaatttcgatacggcattctcaagtccgatatcctcgg cacggcggagactgagttacggaaccccgttagcgttgcctgcacctgctgccagt gcccaaggcacccgaagacgacgagcatggacaaaccgtccgatgtacaggaagcc tcgtctgtatcgtatgtatcgaagcccagacgtcccccgcggttgtgagggcccct Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 80 gtaaggttcaatcatttgaacaaaggcatgatatttcccatgttgggaaagtaatt tgtgtttctgacgtcactcgtggtggtggtatcactcaccgagttggcaagcgttt ttgcattaagtctatctatgtttcaggtaaagtttggatggatgaaaacattaagc tcaagaatcacaccaacagtgtgctattttggttgactcgtgataggcgacctttt ggcacggcaatggattttggtcaagtttttaacatgtatgacaatgagcctagtac tgccaccgtgaagaacgacctacgtgatcgtttccaggttctgcatcgatggaatg ccaccgttacaggtggccaatatgcctgtaaggaacaggcgttagttaggcgtttt tataaagtttataatcatgttgtgtataatcatcaggaagctgcaaagtatgacaa ccatactgagaatgctttgttgttgtatatggcatgtactcatgcatcaaacccag tgtacgcaacattgaagatacggatctatttttacgattcgatatcgaattaataa agcttgtattgcacattatgattgagtgttacatcatcaacatgttcaaatacagt aaacaatacatgcgaacacgcttggaatacagttgatagactaataactcctaaat tattaatataacgtaataattggcttttaaaagtcgagcaaatccgcccagtcggc tgtatgaaacgatggtaaatcgtcaagtccaggaaggccttgtgtatccccaacgc tttcttcagagagtggttgaacattatgcggattgttgtccggaacttttgccact ggatgaggttgtggtaccatactctgtcgtggtccatgatcttgaaactcagggga tttgctacctcccaagtaaagacgctattctctagctgagctgcagtgatgctcac ccctgtgcgtaaatccatggttgtagcagttgatatgtaggtagtaactacaccca cacttcaggtcaattcgtctgcgtcgaattgcacgtttcttggccaacctgtgttg cgccttgattggtggtggagaacagaggttctgtgagcgtgtagaagatagcattt tttaaagcccactctttgagactcgcattattctcttcgtcgagaaacattttata agaggatctgggtcccgcattacagagaaagatggtggggattccacctttaattt gagtgggctttccgtatttgacgttgctttgccagtccttttgcgcgcccatgaat tctttgaaatgtttcagataatgcggatcgacgtcatcgattacgttgtaccacgc atcatttgaataaactttggcgcttagatccaaatggccgcacaaataattgtgcc gaccgagcgacctcgcccacatggttttacccgtacgtgactcaccctcaaccact atactaataggtctgaatggccgcgcagcggggcacaccacgttctcagctgccca tgatgtcaatgtctcagggacattattgaatgattcaatactgaatggtgtttcgt acactgttggcggtggtgcaaaaagaaagtttaggttggctctgatattgtgcaaa tggattatgaagtctctcgacgctttctcctttaatatattgagggccgatgttgt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 81 atcgcctgaattgattgcttcggcatatgcgtcatttgcacattgagaacctcctc tatttgatctcccgtcgatctggaaaattccaaaatcaatgacgtctccgtctttc tccatgtactttttaacatctgagctgctcttagctccctgaatgttcggatggaa atgtgctgacctggtttcggatacgaggtcgaagaacctttcgttgcggcactgga attttccttcaaattgaagcagaacatggaggtgaggttccccattttcatggaac tcacgacaaactctgatgaatttcttgttgacgttagtctgaatattctgtagctg ctctagtgctgcttctttagagagagaacaccttgggtatgtgaggaagaagtttt tggcattaacccgaaaaccctttggtctagacattatgtgaagagtttctctctct tgacaccaattggggtcgattcatttatcgccctagtattagtgtcgcatatatag tagtgacaccaatgacgtggaaagcggccatccgaataatatt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 82 i [...]... Xác định được đặc trưng phân tử và mức độ đa dạng phân tử của virus KuMV - Phát triển được kỹ thuật LAMP chẩn KuMV 1.2.2 Yêu cầu - Kiểm tra PCR phát hiện KuMV trên các mẫu đậu tương bị bệnh virus thu thập ở miền Bắc Việt Nam với mồi đặc hiệu cho virus này - Dòng hóa toàn bộ bộ gene của 3-4 mẫu KuMV - Giải trình tự toàn bộ bộ gene của các mẫu virus đã dòng hóa - Phân tích đặc trưng phân tử, mức độ đa... gene đích nên tích đặc hiệu cao Phản ứng LAMP diễn ra trong điều kiện đẳng nhiệt, thời gian phản ứng ngắn, độ nhạy cao hơn so với PCR, có thể kiểm tra sản phẩm bằng phát hiện màu và không yêu cầu máy móc phức tạp Dựa trên cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Kỹ thuật chẩn đoán và đặc trưng phân tử của Kudzu mosaic virus (KuMV) hại đậu tương 1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục...Dựa vào điều kiện và khả năng, đề tài này sẽ thực hiện một số nội dung có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao như đánh giá mức độ đa dạng và phát triển kỹ thuật chẩn đoán virus KuMV Để đánh giá mức độ đa dạng của KuMV, đề tài sẽ sử dụng kỹ thuật RCA (Rolling Circle Amplification) để nhân bộ gene virus Kỹ thuật RCA dùng enzyme DNA polymerase của thực khuẩn thể Φ29 và mồi hexamer để nhân các phân tử DNA... gene của các mẫu virus đã được dòng hóa Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 - Thiết kế 1 bộ mồi LAMP cho chẩn đoán KuMV - Đánh giá tính đặc hiệu, độ nhạy và khả năng phát hiện KuMV trên các mẫu DNA tổng số chiết từ cây đậu tương của mồi LAMP 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Nghiên cứu mức độ đa dạng, đặc trưng phân tử và phát triển kỹ thuật LAMP chẩn. .. (Mungbean yellow mosaic virus) , MYMIV (Mungbean yellow mosaic India virus) , HgYMV (Horsegram yellow mosaic virus) , VeBSMV (Velvet bean severe mosaic virus) , LeYMV (Legume yellow mosaic virus) , CowGMV Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8 (Cowpea golden mosaic virus) và KuMV (Kudzu mosaic virus) Trong số các virus này, KuMV có nguồn gốc phân lập từ Việt Nam và phía Nam... dựa trên đặc điểm bộ gene là: (i) Cụm hai begomovirus có bộ gene đơn là Soybean crinkleaf virus (SbCLV), phân lập trên đậu tương từ Thái Lan, và Mimosa yellow leaf curl virus (MiYLCV), phân lập trên cây xấu hổ của Việt Nam Mặc dù đây là hai virus hại cây họ đậu nhưng vị trí tiến hóa của chúng thường không được đề cập (Ha et al., 2008) (ii) Cụm legumovirus gồm tất gồm tất cả các virus hại cây họ đậu có... phát triển kỹ thuật LAMP chẩn đoán KuMV hại đậu tương từ đó tiến tới nghiên cứu các đặc trưng sinh học, dịch tễ bệnh và phòng chống virus này Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam Cây đậu tương hay đậu nành (Glycine max) là cây họ đậu có nguồn gốc tử Đông Á và được xem là 1 trong các cây... plasmid và giải trình tự toàn bộ bộ gene của virus - Phân tích các đặc trưng phân tử của bộ gene virus - Thiết kế mồi LAMP để phát hiện virus - Đánh giá tính đặc hiệu, độ nhạy và khả năng phát hiện của mồi LAMP 2.3 Dụng cụ và thiết bị chính Máy PCR, bể điện di, tủ định ôn, tủ lạnh 40C bảo quản mẫu, môi trường, tủ lạnh -200C, tủ lạnh -800C, bể nhiệt, máy li tâm, máy spin, máy lắc, box cấy, cân điện tử và. .. 1.4 Begomovirus trên cây họ đậu Cho tới nay, có khoảng 20 begomovirus được ghi nhận hại cây đậu đỗ trên thế giới và được chia thành hai cụm phân biệt trên cơ sở phân bố địa lý là cụm Tân Thế giới gồm các virus được phân lập từ châu Mỹ và cụm Cựu Thế giới gồm các virus được phân lập từ phần còn lại của thế giới (Fauquet et al., 2008) Các virus thuộc cụm Cựu Thế Giới lại được chia thành hai cụm phân biệt... enzyme cắt giới hạn thích hợp và được dòng hóa trong các vector dòng hóa thông thường Đây là kỹ thuật hiện đang rất thông dụng trong nghiên cứu các virus có bộ gene DNA mạch vòng kể cả các begomovirus Để chẩn đoán KuMV, đề tài sẽ thử nghiệm một kỹ thuật chẩn đoán tương đối mới là LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) Kỹ thuật LAMP sử dụng 4 mồi khác nhau được thiết kế đặc biệt nhận ra 6 đoạn riêng