Xác định và đặc trưng phân tử của một số virus thuộc chi begomovirus (họ geminiviridae)
TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài thực tập tốt nghiệp, nhận nhiều giúp đỡ từ thầy cô, gia đình bạn bè Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hà Viết Cường – người trực tiếp hướng dẫn đóng góp nhiều ý kiến quan trọng cho suốt trình thực đề tài tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị cán trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới, thầy cô giáo môn Công nghệ sinh học giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực hoàn thành đề tài tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè người tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ suốt trình học tập trình thực đề tài tốt nghiệp Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2010 Sinh viên Trần Ngọc Tiệp i TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH .vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT .viii Phần I MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu yêu cầu đề tài Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đặc điểm họ Geminiviridae Đặc điểm chi Begomovirus .3 2.1 Lịch sử phát hiện, phân bố đa dạng Begomovirus 2.2 Phân loại chi Begomovirus .4 2.3 Triệu chứng bệnh Begomovirus gây 2.4 Vector truyền bệnh lan truyền Begomovirus .7 2.5 Thiệt hại kinh tế Begomovirus gây 2.6 Biện pháp phòng trừ 2.7 Đặc điểm hình thái cấu trúc gen Begomovirus 10 2.7.1 Hình thái Begomovirus 10 2.7.2 Cấu trúc DNA-A 11 2.7.3 Cấu trúc DNA-B 12 2.7.4 Đặc điểm vùng IR 13 2.7.5 Cấu trúc DNA-β .13 2.7.6 Cấu trúc Nanovirus-like DNA-1 .15 2.8 Quá trình tái Begomovirus 16 ii TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM 2.9 Tương tác tái tổ hơp Begomovirus 16 Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 3.1 Đối tượng, vật liệu, thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu .18 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu .19 3.1.4 Thời gian nghiên cứu 19 3.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 19 3.2.1 Tiến hành thu mẫu nghiên cứu 19 3.2.2 Chiết tách DNA tổng số từ mẫu mô thực vật 19 3.2.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) điện di sản phNm PCR 20 3.2.4 Phương pháp tinh chiết sản phNm PCR 20 3.2.5 Nhân dòng InsTAclone™ PCR Cloning Kit (của Fermentas) .20 3.2.6 Tinh chiết plasmid .21 3.2.7 Phương pháp giải trình tự Gen .21 3.2.8 Phương pháp phần mềm phân tích chuỗi DNA 21 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Nhân dòng giải trình tự toàn gen ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89 Dudu 31 22 4.1.1 Thiết kế mồi nhân toàn bộ gen mẫu virus 22 4.1.2 Nhân toàn bộ gen mẫu virus PCR 24 4.1.3 Nhân dòng gen mẫu virus vi khuNn E.coli .25 4.1.4 Kiểm tra kết biến nạp vector tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn 26 4.1.5 Kết giải trình tự gen 28 4.2 Đặc trưng phân tử ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89 Dudu 31 30 4.2.1 Tổ chức gen .30 4.2.2 Phân tích motif chức gen mẫu virus 33 4.2.2.1 Phân tích vùng liên gen IR mẫu virus 33 iii TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM 4.2.2.2 Phân tích protein Rep mẫu virus .35 4.2.2.3 Phân tích protein CP mẫu virus 37 4.2.3 So sánh trình tự phân tích phả hệ mẫu virus 40 4.2.3.1 Tìm kiếm chuỗi tương đồng GenBank .40 4.2.3.2 So sánh trình tự virus với begomovirus công bố 40 4.2.3.3 So sánh iteron IRD virus với begomovirus công bố 44 4.2.3.4 Phân tích phả hệ 46 4.2.3.5 Phân tích tái tổ hợp 49 4.2.4 Phân loại mẫu virus Dudu31, Cachua89, Cachua100 52 4.2.4.1 Hai mẫu Dudu31 Cachua89 52 4.2.4.2 Mẫu Cachua100 53 4.3 Phát begomovirus gây bệnh xoăn vàng cà chua đồng ruộng 55 4.3.1 Thu thập xử lý mẫu 55 4.3.2 Xác định begomovirus PCR giải trình tự 56 4.3.2.1 Kiểm tra có mặt begomovirus cặp mồi chung (degenerate primers) 56 4.3.2.2 Kiểm tra có mặt ToLCVV TYLCVNV mồi đặc hiệu .56 Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHN 59 5.1 Kết luận 59 5.2 Kiến nghị 61 iv TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Nguồn gốc mẫu virus nghiên cứu báo cáo 22 Bảng 4.2: Các mồi liền kề nhân toàn bộ gen ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89 Dudu 31 .23 Bảng 4.3 Kiểm tra vector tái tổ hợp (miniprep) BamHI E.coRI 27 Bảng 4.4 Đặc điểm gen mẫu begomovirus .31 Bảng 4.5: Virus công bố sẵn có GenBank gần gũi với mẫu virus .40 Bảng 4.6 So sánh trình tự virus Dudu31, Cachua89 Cachua100 với số begomovirus 41 Bảng 4.7: So sánh iteron IRD virus Dudu31, Cachua89 Cachua100 với số begomovirus 45 Bảng 4.8 Các virus sẵn có GenBank dùng phân tích phả hệ 47 Bảng 4.9 Mức đồng nucleotide (%) đoạn tái tổ hợp Cachua100 51 Bảng 4.10 Các begomovirus hại trồng phát Việt Nam 54 Bảng 4.11 Kiểm tra PCR phát begomovirus, TYLCVNV ToLCVV mẫu cà chua 58 v TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Triệu chứng Begomovirus gây cà chua Hình 2.2 Hình thái Begomovirus .10 Hình 2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A Begomovirus 12 Hình 3.1: Sơ đồ tổ chức gien DNA-A (biểu diễn dạng mạch thẳng) begomovirus vị trí tương đối cặp mồi BegoAFor1 BegoARev1………………18 Hình 4.1 Vùng bảo thủ dùng để thiết kế mồi chung liền kề nhân toàn bộ gen mẫu virus Dudu31, Cachua 89 Cachua100 Vùng thiết kế mồi bôi đen .23 Hình 4.2 Vị trí tương đối cặp mồi chung liền kề Hai50F/Hai50R gen begomovirus .24 Hình 4.3 PCR nhân toàn DNA-A ba mẫu virus .24 Hình 4.4 Các mẫu vi khuN n XL1-blue biến nạp cấy trải ủ qua đêm môi trường chọn lọc trắng xanh 26 Hình 4.5: Kết điện di sản phN m miniprep cắt BamHI E.coRI .28 Hình 4.6: Sơ đồ giải trình tự gen mẫu virus dòng hóa vector pTZ57R/T .29 Hình 4.7: Tổ chức gen mẫu virus 32 Hình 4.8 (A) Sơ đồ vùng ori begomovirus (Fontes cộng sự, 1994)…………… 34 Hình 4.9.(A) Sơ đồ vùng chức begomovirus (Hanley-Bowdoin cộng sự, 1999)……………………………………………………………………………… 36 Hình 4.10 Protein CP virus Dudu31, Cachua89 Cachua100 với motif gốc aa chủ chốt liên quan đến chức lắp ráp virion, lan truyền qua vector nhập nhân in màu đánh dấu 39 Hình 4.11: Cây phả hệ dựa toàn bộ gen begomovirus……………………….48 Hình 4.12 Nguồn gốc tái tổ hợp ToLCHV theo Zhang cộng (2010) 50 Hình 4.13: Tái tổ hợp Cachua100 51 Hình 4.14: Triệu chứng mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng 55 Hình 4.15 Kiểm tra PCR phát begomovirus, ToLCVVV TYLCVNV mẫu cà chua 57 vi TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Bp Base pair CP Capsit protein CTAB Cetryl Ammonium Bromide DNA Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxynucleotide triphotphate dsDNA Double DNA E.coli Escherichia coli ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses IGR Intergenic region Kb Kilobase LB Luria and Bertani ORF Open reading frame PCR Polymerase chain reaction RE Restriction enzyme Ren Replication enhancer protein Rep Replication protein ssDNA Singe strand DNA TAE Tris-HCl-EDTA Taq Thermus aquatic TYLCD Tomato yellow leaf curl disease TYLCV Tomato yellow leaf curl virus β- ME Beta- Mercaptoethanol vii TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM TÓM TẮT Trong nghiên cứu tiến hành nhân dòng giải trình tự toàn bộ gen mẫu begomovirus, cho chưa phát Việt Nam gây hại đu đủ cà chua, Lê Văn Hải phân lập năm 2009 Kết toàn bộ gen mẫu begomovirus nhân dòng thành công vào tế bào E.coli chủng XL1Blue Chúng giải trình tự thu toàn bộ gen mẫu virus với kích thước khoảng 2.7 kb Tiến hành so sánh trình tự thu được, phân tích đặc trưng phân tử gen, phân tích tái tổ hợp phả hệ chứng minh mẫu virus Dudu31 Cachua89 thành viên loài Tomato leaf curl Hainan virus phát gần (năm 2010) từ Trung Quốc Những phân tích phả hệ cho thấy mẫu virus Cachua100 virus thuộc loài chi Begomovirus Virus đặt tên Tomato leaf curl Hanoi virus (ToLCHanV) Chúng tiến hành kiểm tra mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng thu thu thập Thanh Hóa Bắc Ninh PCR thấy tất chúng nhiễm begommovirus Dùng mồi đặc hiệu để kiểm tra PCR thấy 5/8 mẫu nhiễm Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV), 3/8 mẫu nhiễm Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV), có mẫu nhiễm hỗn hợp virus Giải trình tự trực tiếp mẫu (thu Thanh Hóa) nhiễm begomovirus PCR âm tính với ToLCVV TYLCVNV thấy mẫu nhiễm ToLCHV viii TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM Phần I MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây cà chua bị công nhiều loài virus Trong số bệnh virus hại cà chua vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, bệnh xoăn vàng xem bệnh quan trọng (Pico cộng sự, 1996) Nguyên nhân gây bệnh xoăn vàng cà chua phức tạp Bệnh xem bệnh phức, có nghĩa bệnh nhiều loài virus thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae gây (Moriones Navas-Castillo, 2000) Các begomovirus có hình thái phân tử dạng hình cầu kép (hình chuỳ) có gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,6 - 2,8 kb (Stanley cộng sự, 2005) Các begomovirus không truyền qua hạt giống lan truyền đồng ruộng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Pico cộng sự, 1996) Có khoảng 40 loài begomovirus hại cà chua công bố giới (Stanley cộng sự, 2005) Trên cà chua, begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điển hình là: (cong lại hình thìa); mép (đặc biệt non) biến vàng; nhỏ hẹp; nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu thấp Danh tính virus gây bệnh biết dựa vào phân tích phân tử (Moriones Navas-Castillo, 2000) Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng xem bệnh virus quan trọng cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh ruộng trồng cà chua thường cao, có tới 100 % Bệnh phát thấy cà chua từ năm 80 Một số nghiên cứu tạo kháng huyết chN n đoán, lây nhiễm nhân tạo thực thời gian chất thật virus chưa rõ Gần đây, dựa vào phân tích phân tử, có loài begomovirus phát gây bệnh xoăn cà chua Việt Nam gồm Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) (Green cộng sự, 2001), Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) (Ha cộng sự, 2008) Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi (TYLCKaV) (Ha cộng sự, 2008) Trong số loài trên, loài phân lập mẫu cà chua bệnh xoăn vàng miền Bắc ToLCVV TLCVNV Cũng dựa phân tích phân tử, Việt Nam dường trung tâm đa dạng TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM begomovirus (Ha va cộng sự, 2006, 2008) Mặc dù số lượng loài begomovirus xác định thực vật Việt Nam gồm 19 loài phân lập từ nhiều loài cây, nhiều loài dại (Green cộng sự, 2001; Revill cộng sự, 2003, 2004; Ha cộng sự, 2006, 2008) Năm 2009, Lê Văn Hải phân lập begomovirus chưa phát Việt Nam gây hại đu đủ cà chua Tuy nhiên phát xác định dựa việc giải trình tự đoạn DNA-A với chiều dài 819 nts Việc xác đinh rõ danh tính loài virus kết luận giải trình tự toàn DNA-A Kết gợi ý nhiều loài begomovirus gây hại cà chua trồng khác Việt Nam cần phải xác định Chính tiến hành đề tài: “Xác định đặc trưng phân tử số virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae)” Mục tiêu yêu cầu đề tài Mục tiêu - Xác định đặc trưng phân tử số Begomovirus miền Bắc Việt Nam Yêu cầu - Thiết kế mồi để giải trình tự toàn DNA-A số mẫu begomovirus - PCR để nhân toàn DNA-A - Nhân dòng sản phN m PCR vector nhân dòng - Giải trình tự sản phN m nhân dòng - Phân tích trình tự có sau giải trình tự - Thu mẫu xử lý mẫu bệnh virus với triệu chứng điển hình nhóm begomovirus gây cà chua - Xác định có mặt begomovirus PCR dùng mồi chung DNA-A BegoAFor1 & BegoAReV1 - Xác định thành phần loài tìm miền Bắc Việt Nam sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu ToLCVV (ToLCVV-sp-F2 & ToLCVV-sp-R2) TYLCVNV (TYLCVNV-sp-F1 & TYLCVNV-sp-R1) - Giải trình tự sản phN m PCR số begomovirus gây bệnh trồng TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM ToLCVV TYLCVNV Nhiễm bệnh hỗn hợp hay nhiều begomovirus tượng phổ biến begomovirus (Fauquet cộng sự, 2005) Nhiễm bệnh hỗn hợp gây hậu lớn tiến hóa begomovirus chúng tái sinh thông qua chế phụ thuộc tái tổ hợp (Jeske cộng sự, 2001) dẫn tới hình thành begomovirus M 8 Begomovirus M ĐC ToLCVV M ĐC TYLCVNV Hình 4.15 Kiểm tra PCR phát begomovirus, ToLCVVV TYLCVNV mẫu cà chua M thang DNA (GeneRuler kb, Fermentas) giếng số đến giếng số tương ứng mẫu từ mẫu số đến mẫu số (Bảng 4.11) Băng sản phN m PCR rõ mũi tên 57 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM Bảng 4.11 Kiểm tra PCR phát begomovirus, TYLCVNV ToLCVV mẫu cà chua Mẫu PCR Địa điểm thu mẫu Begomovirus TYLCVNV ToLCVNV Nga Thành, Nga Sơn, Thanh Hóa + – + Nga Thành, Nga Sơn, Thanh Hóa + – + Nga Thành, Nga Sơn, Thanh Hóa + + - Nga Mĩ, Nga Sơn, Thanh Hóa + – - Nga Mĩ, Nga Sơn, Thanh Hóa + + - Ba Đình, Bỉm Sơn, Thanh Hóa + + + Ba Đình, Bỉm Sơn, Thanh Hóa + – + Hồ, Thuận Thành, Bắc Ninh + – + Kết kiểm tra PCR phát thấy mẫu số (mẫu thu Nga Mĩ, Nga Sơn, Thanh Hóa) có kết (-) hai cặp mồi này, mẫu số không nhiễm virus ToLCVV TYLCVNV mà nhiễm virus khác nhiễm loài virus Để xác định danh tính virus này, giải trình tự trực tiếp sản phN m PCR mồi PCR Kết giải trình tự chiều cho thấy chất lượng trình mồi giải trình tự mồi chung Tuy nhiên thu đoạn khoảng 960 nt đọc (Phụ lục 5) So sánh trình tự (kể tìm kiếm BLAST) thấy đoạn đồng khoảng 95 % với đoạn tương ứng ToLCHV gợi ý mẫu virus số thu Thanh Hóa thuộc loài Tuy nhiên danh tính xác virus xác định dựa toàn bộ gen 58 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHN 5.1 Kết luận Đã sử dụng phản ứng PCR để nhân toàn bộ gen mẫu begomovirus Dudu31 (gây bệnh xoăn đu đủ Hưng Yên), Cachua89 Cachua100 (gây bệnh xoăn vàng cà chua thu Hà Nội) Từ sản phN m PCR, toàn bộ gen mẫu begomovirus nhân dòng thành công vào tế bào E.coli chủng XL1-Blue Đã giải trình tự toàn bộ gen mẫu virus Toàn bộ gen có kích thước khoảng 2.7 kb (2740 nt - Cachua100; 2743 nt - Cachua 89; 2748 nt – Dudu31) giống begomovirrus khác Các phân tích phân tử dựa gien giải trình tự virus cho thấy: chúng có tổ chức gien tương tự virus thuộc chi Begomovirus nhóm Cựu giới Mỗi gien chứa ORF đặc trưng gồm ORF sợi virus (V2, V1, chiều kim đồng hồ) ORF sợi bổ sung với sợi virus (C4, C1, C2, C3, ngược chiều kim đồng hồ) Các ORF mã hóa cho protein chức đặc trưng begomovirus Trên sợi virus, ORF V2 mã hóa protein V2, ORF V1 mã hóa protein vỏ CP Trên sợi bổ sung, ORF lớn ORF C1 mã hóa protein Rep, ORF nhỏ ORF C4 mã hóa protein C4; hai ORF lại C2 (mã hóa protein TrAP) C3 (mã hóa protein Ren) Bộ gen virus có vùng liên gen không phiên mã (IR, Intergenic Region) kích thước khoảng 270 nt có vị trí tính từ đầu 5’ ORF C1 tới đầu 5’ ORF V2 tương tự IR begomovirus khác Phân tích vùng gen quan trọng virus IR, protein Rep protein CP thấy chúng chứa trình tự, motif dấu hiệu quan trọng cho chức sống chủ chốt virus tái sinh, vận chuyển, đặc hiệu vector lắp ráp phân tử virus (virion) So sánhh trình tự gen virus với begomovirus công bố thấy mẫu Dudu31 Cachua89 giống với Tobacco leaf curl Hainan virus (ToLCHV) với 59 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM mức đồng nucleotid >90% so sánh toàn bộ gien hay vùng gen quan trọng IR, ORF V1 (CP), ORF C1 (Rep) Đối với mẫu Cachua100, virus giống với ToLCHV toàn bộ gien (với mức đồng 87.6 %), lại giống Papaya leaf curl China virus (PaLCuCNV) vùng IR (92 %), giống Ageratum leaf curl virus (ALCV) ORF V1 (97.4 %), giống Tomato yellow leaf curl Thailand virus (TYLCTHV) ToLCHV ORF C1 (lần lượt 92.5 92.2 %) Các phân tích phả hệ cho thấy hai mẫu virus Dudu31 Cachua89 với mẫu ToLCHV từ Trung Quốc hình thành cụm loài (ToLCHV) rõ rệt Phân tích cho thấy mẫu Cachua100 hình thành nhánh độc lập gần gũi với cụm ToLCHV cụm chứa mẫu PaLCuCNV Các phân tích tái tổ hợp phát đoạn tái tổ hợp liên quan đến mẫu Cachua100 Đoạn tái tổ hợp thức đoạn lớn dài 1574 nt, có nguồn gốc từ PaLCuCNV, bao phủ vùng từ khoảng ORF C1 qua vùng IR tới gần hết đầu 3’ ORF V1 Đoạn tái tổ hợp thứ 2, có nguồn gốc từ ALCV, có kích thước 1157 nts, bao trùm toàn ORF V2, ORF V1 phần đầu ORF C3 Các phân tích phân tử phả hệ chứng minh mẫu virus Dudu31 Cachua89 thành viên loài Tomato leaf curl Hainan virus phát gần (năm 2010) từ Trung Quốc Đây lần virus phát đặc trưng Việt nam Đối với mẫu Cachua100, phân tích phân tử phả hệ cho thấy virus thuộc loài chi Begomovirus Danh pháp virus đề xuất : • Tên virus: Tomato leaf curl Hanoi virus • Loài virus: Tomato leaf curl Hanoi virus • Viết tắt: ToLCHanV • Isolate: [Vietnam:Hanoi:tomato:2010] = [VN:Han:To:2010] 60 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM Kiểm tra mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng thu thu thập Thanh Hóa Bắc Ninh PCR thấy tất chúng nhiễm begommovirus Dùng mồi đặc hiệu để kiểm tra PCR thấy 5/8 mẫu nhiễm Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV), 3/8 mẫu nhiễm Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV), có mẫu nhiễm hỗn hợp virus Giải trình tự trực tiếp mẫu (thu Thanh Hóa) nhiễm begomovirus PCR âm tính với ToLCVV TYLCVNV thấy mẫu nhiễm ToLCHV 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu đặc điểm sinh học tính gây bệnh, khả lan truyền, phổ ký chủ điều tra để xác định mức độ phổ biến ToLCHanV ToLCHV Tiếp tục giải trình tự toàn bộ gen mẫu ToLCHV thu thập Thanh Hóa Tiếp tục điều tra, thu thập phát begomovirus khác gây hại cà chua trồng khác nước 61 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Lương Tề - Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuN n virus hại trồng NXB Giáo dục, Tr178 – 183 Lê Văn Hải (2009) Xác định virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) cà chua khác khu vực Hà Nội vùng phụ cận Báo cáo thực tập tốp nghiệp, chuyên ngành CNSH Nguyễn Văn Viên (1999) Nghiên cứu tình hình phát sinh phát triển biện pháp phòng trừ số bệnh nghiên cứu bệnh xoăn hại cà chua vùng Hà Nội phụ cận Luận án TS nông nghiệp Phạm Thị Nhất (2000), Sâu bệnh hại số thực phN m biện pháp quản lý NXB Nông Nghiệp Hà Nội, Tr34 – 54 Vũ Triệu Mân – Lê Lương Tề chủ biên (2001) Giáo trình Bệnh Nông Nghiệp NXB Nông Nghiệp Vũ Văn Hải (2007) Điều tra nghiên cứu bệnh xoăn vàng cà chua Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) hại cà chua vụ thu đông sớm 2006 Hà Nội phụ cận Báo cáo thực tập tốt nghiệp, chuyên ngành BVTV TÀI LIỆU TIẾNG ANH Accotto, G P., NavasCastillo, J., Noris, E., Moriones, E & Louro, D (2000) Typing of Tomato yellow leaf curl viruses in Europe European Journal of Plant Pathology 106, 179-186 Alberter, B., Ali Rezaian, M., and Jeske, H (2005) Replicative intermediates of Tomato leaf curl virus and its staellite DNAs Argüello-Astorga & Ruiz-Medrano, (2001) An iteron-related domain is associated to Motif in the replication proteins of geminiviruses: identification of potential interacting amino acidbase pairs by a comparative approach 10 Arguello-Astorga, G R., Guevara-Gonzalez, R G., Herrera-Estrella, L R & RiveraBustamante, R F (1994) Geminivirus replication origins have a group specific organization of iteractive elements: amodel for replication Virology 203, 90-100 11 Briddon, R W (2003) Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus complex Molecular Plant Pathology 4, 427-434 12 Cohen, S & Antignus, Y (1994) Tomato yellow leaf curl virus, a whitefly-borne geminivirus of tomatoes Advances in Disease Vector Research 10, 259-288 13 Cohen, S., Duffus, J E., Perry, R & Dawson, R (1989) A collection and marking system suitable for epidemiological studies on whitefly -borne viruses Plant Dis 73, 765-768 62 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM 14 Czosnek, H & Laterrot, H (1997) A worldwide survey of tomato yellow leaf curl viruses Archives of Virology 142, 1391-1406 15 Czosnek, H., Ghanim, M & Ghanim, M (2002) The cicurlative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci - insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus Annals of Applied Biology 140, 215-231 16 Czosnek, H., Navot, N & Laterrot, H (1990) Geographical distribution of Tomato yellow leaf curl virus A first survey using a specific DNA probe Phytopathology Mediterranean 29, 1-6 17 Desbiez, C., David, C., Mettouchi, A., Laufs, J., and Gronenborn, b (1995) Rep protein of tomato yellow leaf curl geminivirus has an ATPase activity required for viral DNA replication Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America 92, 5640-4 18 D'Hondt, M & Russo, M (1985) Tomato yellow leaf curl in Senegal Plant Pathol 112, 153-160 19 Faria J.C., Bezerra I.C., Zerbini F.M., Ribeiro S.G., Lima M.F (2000) Situação atual das geminiviroses no Brasil Fitopatologia Brasileira 25: 125-137 20 Fauquet, C M & Stanley, J (2003) Geminivirus classification and nomenclature: progress and problems Annals of Applied Biology 142, 165-189 21 Fauquet, C M and Stanley, J (2005) Revising the way we conceive and name viruses below the species level: A review of geminivirus taxonomy calls for new standardized isolate descriptors Archives of Virology 150(10), 2151-2179 22 Fauquet, C M., and Stanley, J (2005) Revising the way we conceive and name virus below the species level: A review ò geminivirus taxonomy calls for new standardized isolate descriptors Archives of Virology 150, 2151-2179 23 Fauquet, C.M., Briddon, R., Brown, J.K., Moriones, E., Stanley, J., Zerbini, M & Zhou, X (2008) Geminivirus strain demarcation and nomenclature Archives of Virology 153:783–821 24 Fauquet, M C & Mayo, M A (1999) Abbreviations for plant virus names Archives of Virology 144, 1249-73 25 Fontes, E P., Gladfelter, H J., Schaffer, R L., Petty, I T., and Hanley-Bowdoin, L (1994b) Geminivirus replication origins have a modular orgnization Plant Cell 6, 405-16 26 Fontes, E., Eagle, P., Sipe, P., Luckow, V., and Hanley-Bowdoin, L (1994a) Interaction between a geminivirus replication protein and origin DNA is essential for viral replication Juornal of Biological Chemistry 269, 8459-8465 27 G R Argüello-Astorga1, R Ruiz-Medrano (2001) An iteron-related domain is associated to Motif in the replication proteins of geminiviruses: identification of potential interacting amino acid-base pairs by a comparative approach 28 Gafni, Y., and Epel, B L (2002) The role of host and viral proteins in intra-and intercellular trafficking of geminiviruses 63 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM 29 Gennadius, P (1889) Disease of tobacco plantations in the Trikonia The aleyrodid of tobacco Ellenike Georgia 5, 1-13 30 Green, S K., Tsai, W S., Shih, S L., Black, L L., Rezaian, A., Rashid, M H., Roff, M M N., Myint, Y Y & Hong, L T A (2001) Molecular characterization of begomoviruses associated with leafcurl diseases of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia, Myanmar, and Vietnam Plant Dis 85, 1286 31 Guerra-Peraza, O., Kirk, D., Seltzer, V., Veluthambi, K., Schmit, A C., Hohn, T & Herzog, E (2005) Coat proteins of Rice tungro bacilliform virus and Mungbean yellow mosaic virus contain multiple nuclear-localization signals and interact with importin a J Gen Virol 86, 1815–1826 32 Ha, C (2007) Detection and indentification of potyviruses and geminiviruses in VietNam 33 Ha, C., Coombs, S., Revill, P., Harding, R., Vu, M & Dale, J (2008) Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation Journal of General Virology 89: 312-326 34 Hanley-Bowdoin L, Settlage SB, Orozco BM, Nagar S, Robertson D (1999) Geminiviruses: models for plant DNA replication, transcription and cell cycle regulation Crit Rev Plant Sci 18: 71–106 35 HanleyBowdoin, L., Settlage, S B., Orozco, B M., Nagar, S & Robertson, D (2000) Geminiviruses: Models for plant DNA replication, transcription, and cell cycle regulation Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 35, 105-140 36 Harrison, B D., Swanson, M M & Fargette, D (2002) Begomovirus coat protein: serology, variation and functions Physiol Mol Pl Path 60, 257-271 37 Howarth, A J & Vandemark, G J (1989) Phylogeny of geminiviruses Journal of General Virology 70, 2717-2727 38 Hui Zhang, Gaojie Hu and Xueping Zhou, (2009) Molecular Characterization of Tomato Leaf Curl Hainan Virus, a New Begomovirus, and Evidence for Recombination 39 Hussain A., A Saleem, W.S han, H Tariq, (1991) Vector, whitefly (B.tabaci) in: Cotton leaf curl viruses, the problem, disease situation, rescarch update and control Publ Directorate of Agric Information, Lahore:7 40 Jeske, H., Lutgemeier, M., and Preiss, W (2001) DNA forms indicate rolling circle and recombination-dependent replicationg of Abutilon mosaic virus EMBO Journal 20, 61586167 41 Jones, D R (2003) Plant viruses transmitted by whiteflies Eur J Plant Pathol 109, 195219 42 Kheyr-Pour, A., Bananej, K., Daffalla, G A., Caciagli, P., Noris, E., Ahoonmanesh, A., Lecoq, H., and Gronenborn, B (2000) Watermelon chlorotic stunt virus from the Sudan and Iran: sequence comparisons and identification of a whitefly-transmission determinat Phytopathology 90, 629-635 64 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM 43 Konaté, G., Barro, N., Fargette, D., Swanson, M M & Harrison, B D (1995) Occurence of whitefly-transmitted geminiviruses in crops in Burkina Faso, and their serological detection anddifferentiation Annals of Applied Biology 126, 121-129 44 Kunik, T., Palanichelvam, K., Czosnek, H., Citovsky, V & Gafni, Y (1998) Nuclear import of the capsid protein of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) in plant and insect cells Plant J 13, 393–399 45 Laufs J, Traut W, Heyraud F, Matzeit V, Rogers SG, Schell J, Gronenborn B (1995) In vitro cleavage and joining at the viral origin of replication by the replication initiator protein of tomato yellow leaf curl virus Proc Natl Acad Sci USA 92:3879–3883 46 Lazarowitz, S G (1992) Geminivirues: genomes structure and gene function Critical Reivews in Plant Science 11, 327-349 47 Legg J P; Fauquet C M Cassava mosaic geminiviruses in Africa Plant molecular biology 2004; 56(4):585-99 48 Markham, P G., Bedford, I D., Liu, S., Frolich, D F., Rosell, R & Brown, J K (1995) The transmission of geminiviruses by biotypes ofBemisia tabaci (Gennadius) In Bemisia : 1995, pp 69-75 Edited by D G a R T Mayer Andover: Intercept 49 Morales, F J & Anderson, P K (2001) The emergence and dissemination of whiteflytransmitted geminiviruses in Latin America Arch Virol 146, 415–441 50 Moriones, E & Navas-Castillo, J (2000) Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide Virus Res 71, 123–134 51 Noris, E., Vaira, A M., Caciagli, P., Masenga, V., Gronenborn, B., and Accotto, G P (1998) Amino acids in the capsid protein of tomato yellow leaf curl virus that are crucial for systemic infection, particle formation, and insect transmission Journal of Virology 72, 100507 52 Orozco BM, Miller AB, Settlage SB, Hanley-Bowdoin L (1997) Functional domains of a geminivirus replication protein J Biol Chem 272: 9840–9846 53 Padidam, M., Sawyer, S., and Fauquet, C M (1999) Possible emergence of new geminiviruses by frequent recombination Virology 265, 218-225 54 Pico, B., Diez, M J., Neuz, F (1999) Improved diagnostic techniques for tomato yellow leaf curl virus in tomato breeding programs Plant Disease 83, 1006-1012 55 Pico, B., Diez, M.-J & Nuez, F (1996) Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop II The tomato yellow leaf curl virus - a review Scienta Hort 67, 151-196 56 Polston J.E., Anderson P.K (1997) The emergence of whitefly-transmitted geminiviruses in tomato in the Westernhemisphere Plant Disease 81: 1358-1369 57 Preiss, W., and Jeske, H (2003) Multitasking in replication is common among geminiviruses Journal of Virology 77, 2972-80 65 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM 58 R W Briddon, J K Brown, E Moriones, J Stanley, M Zerbini, X Zhou, C M Fauquet (2008) Recommendations for the classification and nomenclature of the DNA-b satellites of begomoviruses 59 Ribeiro S.G., Inoue-Nagata A.K., Daniels J., Avila A.C (2006) Potato deforming mosaic disease is caused by an isolate of Tomato yellow vein streak virus Plant Pathology 55: 569 60 Rybicki, E P (1994) A phylogenetic and evolutionary justification for three genera of Geminiviridae Arch Virol 139, 49-47 61 Stanley, J., Bisaro, D M., Briddon, R W., Brown, J K., Fauquet, C M., Harrison, B D., Rybicki, E P., and Stenger, D C (2005) Geminiviridae In "Virus Taxonomy VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses" (C M Fauquet, M A Mayo, J.Maniloff, U.Desselberger, and L A Ball, Eds.), pp 301-326 Elsevier/Academic Press, London 62 Unseld, S., Hohnle, M., Ringel, M & Frischmuth, T (2001) Subcellular targeting of the coat protein of African cassava mosaic geminivirus Virology 286, 373–383 63 van Regenmortel, M H V., Fauquet, C M., Bishop, D H L., Carstens, E., Estes, M K., Lemon, S., Maniloff, J., Mayo, M A., McGeoch, D., Pringle, C R & Wickner, R B., 1999 Virus Taxonomy Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses Academic Press London, pp 1044 San Diego: Academic Press London 64 Varma, A & Malathi, V G (2003) Emerging geminivirus problems: A serious threat to crop production Annals of Applied Biology 142, 145-164 65 Were, H K., Winter, S & Maiss, E (2004) Viruses infecting cassava in Kenya Plant Dis 88, 17–22 66 Yassin, A M & Nour, M A (1965) Tomato leaf curl disease in the Sudan and its relation to tobacco leaf curl Annals of Applied Biology 56, 207-217 67 Yassin, A M (1975) Epidemics and chemical control of leaf curl virus disease of tomato in the Sudan Experimental Agriculture 11, 161-165 CÁC TRANG WEB http://www.avrdc.org http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html http://wcrc.confex.com http://www.informaworld.com http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.rothamsted.bbsrc.ac.uk 66 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào E Coli LB Lỏng LB agar Thành phần Khối lượng (g) Thành phần Khối lượng (g) Tripton 1.0 Tripton 1.0 NaCl 0.5 NaCl 0.5 Cao nấm men 0.5 Cao nấm men 0.5 Agar 1.5 Phụ lục Chất lượng đọc trình tự mẫu virus Phụ lục Trình tự toàn bộ gen mẫu Dudu31, Cachua89 Cachua100 Trình tự toàn bộ gen mẫu Dudu31 (2748 nt) ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTACATGGTCCCCACCACTAATAAATGTTCTCCACTTAGATCGCTCCCTC AAAGCCTATTTAATTCAAATCCATTATATATACTTGGTCCCCAAGTACTCACTTTAAAATATGTGGGATCC TTTACTGAATGAGTTTCCCGAAACCGTACACGGTTTTAGGTGTATGTTAGCGATTAAATATTTGCAATTAG TAGAAAATACATACTCTCCTGATACATTAGGGTACGATTTGCTTCGTGATTTAATTTCAGTTATTCGTGCT 67 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM AAGGACTATGCCGAAGCGTCCCGCAGATATAGTCATTCCCACTCCCGCATCCAAGGTGCCTCGCCGGCTGA ATTTCGACAGCCCGTATGCCAGCCGTGCTGCTGCCCCCACTGTCCTCGTCACAAACAAAAGGAGGTCATGG GTGAATCGGCCCATGTACCGAAAGCCCAGGATGTACAGAACGTACAAAAGCCCTGATGTTCCTCGAGGATG TGAAGGCCCATGTAAGGTTCAGTCCTATGAACAGCGTCATGATGTAGAGCACGTAGGTAAAGTCATTTGTG TGTCGGATGTTACTCGTGGTAACGGGTTGACTCATCGAGTGGGAAAGAGGTTTTGTGTTAAGTCTGTTTAT GTTTTGGGCAAGATATGGATGGATGAGAAAATTAAGACCAAGAATCACACTAATACTGTAATGTTTTTTTT AGTTCGTGATAGGAGACCATTTGGGACTCCACAGGATTTTGGTCAGGTGTTTAACATGTATGATAACGAGC CAAGTACAGCCACTGTGAAGAACGACAACAGAGATCGCTTTCAAGTTCTACGGCGTTTTCAGGCGACTGCT ACTGGTGGTCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTTAGGAAGTTTATGAAGGTGAACAACCATGTGAC GTATAATCATCAAGAAGCTGCGAAGTATGACAATCACACAGAGAATGCTCTTTTGTTGTATATGGCATGTA CTCATGCTAGTAATCCTGTGTATGCTACTTTGAAAATCAGAATCTATTTCTATGATTCTGTTCAGAATTAA TAAAGATTGAATTTTATTATATTTGAATGTGTTACATATTCTGTTTTTTCCAATACATCCCATAATACATG ATCACATGCTCTAATTACATTGTAAATACTAATTACACCCAAATTATCTAAATATTTCATACATTGAACCC TAAATACTCTTAAGAAACGCCAAGTCTGAGGACGTAAACGAGTCCAGATCTGGAAGATTAGAAAACATTGG TGTATTCCCAACGCTTTCCTCAGGTTGTAATTGAATTGGACTTGTATTGTGATGATGTCGTGGTTCATCAG AAATGGTCTCTCGTCGTGGTTGGTTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACCGTCCAGATATATACGCCAC TCTCTGCTTGAGTTGCAGTGATAGCTTCCCCTGTGCGAGAATCCATAATTGTGACAGCCTAGTGCAATGAA GTATGAACAGCCACAAGGGAGATCAACTCTCCGTCTCCTCGTTGCTTTCTCGGCGTTGCGGTGTTGCACCT TGATAGGAACCTGAGTAGAGTGCGACTTGGAGGGTGACGAAGATCGCATTTTTTATTGCCCAGTTTTTAAG CGCGCTGTTCTTCTCTTCCTCCAAGAATTCTTTATAGCTTGAATTGGGGCCGGGATTGCAGAGGAAGATAG TGGGAATTCCCCCTTTAATTTGAACGGGTTTTCCGTACTTTGTGTTGCTTTGCCAGTCCCTTTGGGCCCCC ATGAATTCTTTAAAATGCTTTAGGTAGTGCGGATCAACGTCATCAATGACGTTGTACCAGGCATCATTACT ATACACTTTTGGACTCAAATCAAGATGACCACACAGGTAATTATGTGGTCCTAATGACCTAGCCCACATCG TCTTACCCGTCCTGCTATCACCCTCTATGACTATACTTACCGGTCGTAATGGCCGCGCAGCGGCACTGACA ACGTTCTCTGCAGCCCACTCTTCGAGTTCCTCTGGGACTCGATCAAACGAAGAAGAAGAAAAAGGGGAAAC GTAAACCTCCATTGGAGGAGTAAAGATCCTATCTAAATTACTATTTAAATTATGAAACTGTAAAACAAAAT CTTTGGGAGCTTTCTCCCTTAATATATTGAGGGCCGTAGCTTTGGACCCTGAATTGATTGCCTCGGCATAT GCGTCGTTTGCAGACTGGCAACCTCCTCTAGCCGATCTTCCATCGATCTGGAAAACTCCATGATCAATAAC GCCTCCGTCTTTGTCCATATAGGCTTTGACATCTGTTGAGCTTTTAGCGCTCTGAATGTTCGGATGGAAAT GTGCTGACCTGGTTGGGGATACGAGATCGAAGAATCTGTTGTTTTGGCATTTGAATTTTCCTTCGAACTGG ATGAGGACATGCAGGTGAGGAGACCCATCTTCGTGTAATTCCCTGCAGATTCGAATGAATAATTTATTTGT TGGTGTCGTTAGAGCTAACAATTGGGAAAGTGCCTCTTCTTTGCTTAGTGAGCAATGTGGGTATGTGAGGA AATAGTTTTTGGCATTTATTAGAAATTTTTTGGGCGGAGGCATGTTGACTTGGTCAATCGGGTCCTCTCAA ACTTAGCTATGCAATCGGGGAATGGGTCCTTATTTATATGTGAGGACCTAAATGGCACAATTGTAAATAAT CATATTAAATCCAAAATTCAAATTGGTAAAGCGGCCATCCGTATAATATT Trình tự toàn bộ gen mẫu Cachua89 (2743 nt) ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTACATGGTCCCCACCACTAACAAATGTCCTCCACTTAGAACGCTCCCTC AAAGCCTATTTAATTCAAATCCATTATATATACTTGGTCCCCAAGTACTCACTTTAAAATATGTGGGATCC TTTACTGAATGAGTTTCCCGAAACCGTACACGGTTTTAGGTGTATGTTAGCGATTAAATATTTGCAATTAG TAGAAAATACATACTCTCCTGATACATTAGGGTACGATTTGCTTCGTGATTTAATTTCAGTTATTCGTGCT 68 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM AAGGACTATGTCGAAGCGTCCCGCAGATATAGTCATTTCCACTCCCGCATCCAAGGTGCGTCGCCGGCTGA ATTTCGACAGCCCGTATGCCAGCCGTGCTGCTGCCCCCACTGTCCTCGTCACAAACAAAAGGAGGTCATGG GTGAATCGGCCCATGTACCGAAAGCCCAGGATGTACAGAATGTACAAAAGCCCTGATGTTCCTCGAGGATG TGAAGGCCCATGTAAGGTTCAGTCGTATGAACAGCGTCATGATGTAGCGCACGTAGGTAAAGTCATTTGTG TGTCGGATGTTACTCGTGGTAACGGGTTGACTCATCGAGTGGGAAAGAGGTTTTGTGTTAAGTCTGTTTAT GTTTTGGGCAAGATATGGATGGACGAGAACATTAAGACCAAGAATCACACTAATACTGTGATGTTTTTTTT AGTTCGTGATAGGAGACCATTTGGGACTCCACAGGATTTTGGTCAGGTGTTTAACATGTATGATAACGAGC CAAGTACAGCCACAGTGAAGAACGATAACAGAGATCGCTTTCAAGTTCTACGGCGTTTTCAGGCGACTGTT ACTGGTGGTCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTTAGGAAGTTTATGAAGGTGAACAACCATGTGAC GTATAATCATCAAGAAGCTGCGAAGTATGACAATCACACAGAGAATGCTCTTTTGTTGTATATGGCATGTA CTCATGCTAGTAATCCTGTGTATGCTACTTTGAAAATCAGAATCTATTTCTATGATTCTGTTCAGAATTAA TAAAGATTGAATTTTATTATATTTGAATGTGTTACATATTCTGTCTTTTCTAATACATCCCATAATACATG ATCACATGCTCTAATTACATTGTTAATACTAATTACACCCAAATTATCTAAATATTTCATACATTGAACCC TAAATACTCTTAAGAAACGCCAAGTCTGAGGACGTAAACGAGTCCAGATTTGGAATATTAGAAAACATTGG TGTATTCCCAACGCTTTCCTCAGGTTGTAATTGAATTGGACTTGTATTGTGATGATGTCGTTGTTCATCAG AAATGGTCTCTCGTCGTGGCTGATTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACCGTCCAGATATATACGCCAC TCTCTGCTTGAGCTGCAGTGATAGCTTCCCCTGTGCGAGAATCCATGATTGTGACAGCCTAGTGCAATGAA GTATGAACAGCCACAAGGAAGATCAACTCTCCGTCTCCTCGTTGCTTTCTTGGCGTTGCGGTGTTGCACCT TGATAGGAACCTGAGTAGAGTGCGCCTTGGAGGGTGACGAAGATCGCATTTTTTATTGCCCAGTTTTTAAG TGCGCTGTTTTTCTCTTCCTCCAAGAATTCTTTATAGCTTGAATTGGGGCCGGGATTGCAGAGGAAGATAG TGGGAATTCCCCCTTTAATTTGAACGGGTTTTCCGTACTTTGTGTTGCTTTGCCAGTCCCTTTGGGCCCCC ATGAATTCTTTAAAATGCTTTAGGTAGTGCGGATCAACGTCATCAATGACGTTGTACCAGGCATCATTATT GTATACCTTCGGACTCAAATCAAGATGACCACACAAATAATTATGTGGTCCTAATGACCTAGCCCACATCG TCTTTCCCGTCCGACTATCACCTTCGATAACTATACTTATCGGTCTCAAAGGCCGCGCAGCGGCACTGACA ACGTTCTCTGCAGCCCACTCTTCGAGTTCTTCTGGAACTCGATCAAACGAAGAAGAAGAAAAAGGCGAAAC ATAAACCTCCATTGGAGGAGTAAAAATCCTATCTAAGTTATTATTTAAATTATGAAACTGTAAAACATAAT CTTTAGGTGCTTTTTCCCTTAGTATATTGAGGGCCGAAGTTTTGGACCCTGAATTGATTGCCTCGGCATAT GCGTCGTTAGCAGATTGGCAACCTCCTCTAGCCGATCTTCCATCGATCTGGAAAAGTCCATGATCAAGCAC GTCTCCGTCTTTGTCCATATAGGACTTGACATCTGTTGAGCTTTTAGCTGCCTGAATGTTCGGATGGAAAT GTGCTGACCTGCTTGGGGATGTGAGATCGAAGAATCTTTGGTTTTTACACTGGAATTTCCCTTCGAATTGG ATGAGAACATGCAGGTGAGGAGTTCCATCTTCGTGGAATTCTCTGCAGATGCGGATAAATAGTTTATTTAC TGGGGTTTCTAGGTTTTTAAGTTGGGAAAGTGCTTCTTCTTTAGTGAGAGAGCAGTGTGGATATGTGAGGA AATATTTTTTGGCATTTATTCTGAATTTATTAGGAGGAGCCATTGACTGGTCAATCGGTGTCTCTTAAACT TGGCTATGCAATTGGTGTCTGGTGTCTTATTTATATGTGGACACCAAATGGCATTATCGTAATTCCTAAAA GAAATTCAAAATTCAAATTGGTAAAGCGGCCATCCGTATAATATT Trình tự toàn bộ gen mẫu virus Cachua100 (2740 nt) ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTAAAGTGGTCCCCGCATGCGCTCCTGCCCAATCCTATCCACTCCTCAAA GCTAAATTATTAATTTGTCTCCTATATAACTTGGTCCCCAAGTAGTCACGTCAAACATGTGGGATCCTTTA CTAAACGAGTTTCCCGAAACGGTACATGGTTTCAGGTGTATGCTAGCAATTAAGTATTTGCAATTGGTAGA AAATACGTACTCTCCAGATACATTAGGGCACGATTTAATTCGCGATTTAATTTTAGTTATTCGTGCTAGAG 69 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM ATTATGTCGAAGCGACCCGCCGATATAGTCATTTCCACTCCCGCATCCAAGGTGCGTCGCCGGCTGAATTT CGACAGCCCGTATGTCAGCCGTGCTGCTGCCCCCACTGTCCTCGTCACAAACAAAAGGAGGTCATGGGTGA ATCGGCCCATGTACCGAAAGCCCAGGATGTACCGAATGTACAAAAGCCCTGATGTTCCTCGTGGTTGTGAG GGACCATGTAAGGTCCAGTCGTATGAACAGCGTCATGATGTAGCTCACGTAGGTAAGGTCATTTGTGTGTC GGATGTTACTCGTGGTAATGGTTTGACGCATCGAGTCGGTAAGAGGTTTTGTGTTAAATCTGTCTATGTTT TGGGTAAGATATGGATGGATGAGAACATTAAGACCAAGAATCATACCAATACAGTTATGTTTTTTCTAGTT CGTGATAGGAGACCTTTTGGCACTCCCCAGGATTTTGGCCAGGTGTTTAACATGTATGATAATGAGCCGAG TACAGCTACTGTGAAGAATGACAACAGGGATCGTTTTCAAGTTCTCCGCCGTATTCAAGCCACTGTTACTG GTGGCCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTCAGGAAATTCATGAAGGTGAATAACCATGTAACTTAT AACCATCAAGAGGCTGCGAAGTATGATAACCACACAGAAAATGCTTTGTTATTGTATATGGCATGTACTCA TGCTAGTAATCCAGTGTATGCTACTTTGAAGATCAGGATCTATTTCTACGATTCTGTTCAGAATTAATAAA GATTAAATTTTATTATACTTGAATCTTCTGTATCAATTGTGCCTTCTAATACATTGTACAATACATGAGAC ATTGCTCTAATTACATTATTGATGCTAATAACTCCTAAATTGTCTAAATACTTAATACATTGATATTTAAA TACTCTTAAGAAACGCGAGGTCTGAGGATGTAAACGAGTCCAAACTCGGCAGATTAGAAAACATTGGTGTA TCCCCAATGCTTTCCTCAGGTTGTAATTGAATTGGACTTGTATTGTGATGATGTCGTGGTTCGTCAGAAAT GGTCTCTCGTCGTGGCTGGTTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACCGTCCAGATATATACGCCACTCTC TGCTTGAGCTGCAGTGATAGCTTCCCCTGTGCGAGAATCCATGATTGTGACAGCCTAGTGCAATGAAGTAT GAACATCCACAAGGGAGATCAACTCTCCGTCTCCTCGTAGCTTTCTTGGCGTTGCGGTGTTGCACCTTGAT AGGAACCGGAGTAGAGTGTGCCTTGGAGGGTGACGAAGATCGCATTCTTTATTGCCCAGTTTTTAAGTGCG CTGTTTTTTTCTTCGTCCAAGAATTCTTTATAGCTGGAATTGGGGCCAGGATTGCAGAGGAAGATAGTGGG AATACCGCCTTTAATTTGAACAGGTTTCCCGTACTTCGTGTTGCTTTGCCAGTCCCTTTGGGCCCCCATGA ATTCTTTAAAGTGCTTTAGGTAATGCGGATCCACGTCATCGATGACGTTGAACCAGGCATCATTACTGTAC ACCTTTGGACTCAAATCTAAATGACCACATAAATAATTGTGTGGACCCAATGATCGGGCCCACATCGTCTT CCCCGTCCTGCTATCACCCTCTATGACTATACTTACTGGTCTCAAAGGCCGCGCAGCGGCACTGACAACGT TTTCTATAGCCCATTCATCAAGTTCTTCAGGAACCTGGTCAAAAGAAGAAGAAGAAAATGGAGAAATATAT TCCTCTATTGGAGGAGTAAAAATCCTATCTAAATTACTATTTAAATTATGGAATTGTAAAACAAAATCTTT AGGAGCTTTCTCCCTTAATATATTGAGGGCCGATGCTTTGGACCCTGAATTGATTGCCTCGGCATATGCGT CGTTGGCAGATTGGCAACCTCCTCTAGCCGATCTTCCATCGATCTGGAAAACTCCATGATCAAGCACGTCT CCGTCTTTTTCCATGTATGTTTTAACATCTGTTGAGCTTTTAGCTCCCTGAATGTTCGGATGGAAATGTGC TGACCTTGTTTGGGATATGAGGTCGAAGAATCTTTGATTTCTGCATTGGAACTTTCCTTCGAATTGGATGA GGACATGCAAGTGAGGAGACCCATCTTCGTGTAATTCCCTGCAGATTCGAATGAATAATTTATTTGTTGGG GTTTCTAAGGCTTTAATTTGGGAAAGTGCTTCTTCTTTGGTGAGAGAACAGTGTGGGTATGTGAGGAAATA GTTTTTGGCATTTATTCTGAATTTATTGGGAGGAGCCATTGACTGGTCAATCGGTGTCTCTCAAACTTGGC TATGCAATTGGTGTCTGGGGTCTTATTTATATGTGGACACCAAATGGCATTAATGTAATTATGATTATGAA ATTCAAAATTCAAATTCCAAAAGCGGCCATCCGTATAATATT Phụ lục Trình tự DNA – β mẫu Cachua 100, 270nt (Giải trình tự trực tiếp, PCR = BetaFor2 & BetaRev2) TGGGGAGTCGCTCTCTCCTTTCTTGTAGGAGAGAGAATGTTCACTTGGAAGCACTCCCAAACCCTGAATAA CATAAAAGCAGGGGTAGTTTAGTCTTTTTACATTATTAGTCACCAATAGAGGCACCGATATATCGGGGTTC ATTTACCTATGAGAGGAATAAATTATTTACCTCCGAGGTGAAAGTAATTTATTTTTTACTGGGCAGTAAAA AATTGAGTGATTTCTTTTCTTTTTCTTTTTTTGTGGAGGGAAATTGTTTCGTTTGCC 70 TRẦN NGỌC TIỆP ENDLESSLOVE.TNT@GMAIL.COM Phụ lục Trình tự mẫu số (Nga Sơn – Thanh Hóa), 955 nt (Giải trình tự trực tiếp, PCR = BegAaFor1/BegoARev1) TCTTCGTCACCCTCCAAGGCGCACTCTACTCAGGTTCCTATCAAAGTGCAACACCGCAACGCCAAGAAAGC AACGAGGAGACGGAGAGTTGATCTCCCTTGTGGCTGTTCATACTTCACTGCACTAGGCTGTCACAATCATG GATTCTCGCACAGGGGAAGCTATCACTGCAACTCAAGCAGAGAGTGGCGTATATATCTGGACGGTCAAAAA TCCCCTATATTTCAAGATAATCAGCCACGACGAGAGACCATTTCTGATGAACAACGACATCATCACAATAC AAGTCCAATTCAATTACAACCTGAGGAAAGCGTTGGGAATACACCAATGTTTTCTAATCTTCCAGATCTGG ACTCGTTTACGTCCTCAGACTTGGCGTTTCTTAAGAGTATTTAGGGTTCAATGTATGAAATATTTAGATAA TTTGGGTGTAATTAGTATTAACAATGTAATTAGAGCATGTGATCTTGTATTATGGGATGTATTGGAAAAAA CAGAATATGTAACACATTCAAATATAATAAAATTCAATCTTTATTAATTCTGAACAGAATCATAGAAATAG ATTCTGATTTTCAAAGTAGCATACACAGGATTACTAGCATGAGTACATGCCATATACAACAAAAGAGCATT CTCTGTGTGATTGTCATACTTCGCAGCTTCTTGATGATTATACGTCACATGGTTGTTCACCTTCATAAACT TCCTAACTATTGCTTGCTCCTTACTTGCATACTGACCACCAGTAACAGTAGCCTGAAAACGCCGTAGAACT TGAAAGCGATCTCTGTTGTCGTTCTTCACCGTGGCTGTACTTGGCTCGTTATCATACATGTTAAACACCTG ACCAAAATCCTGTTTTTCTTTCACAATGGTCTCCTATAAGGGCAATAAAAAAAAACATCACAGTATTAGTG TGATTCTTGGTCTTAATGTTCTCATCCATCCATATC 71 [...]... thước bộ gien trung bình của begomovirus) của cả 3 virus này Vì danh tính và vị trí phân loại của begomovirus chỉ có thể được xác định chính xác dựa trên toàn bộ trình tự phân tử DNA của begomovirus nên mục tiêu của phần 4.1 của chúng tôi là giải trình tự toàn bộ bộ gen của 3 virus này Ba mẫu virus được chúng tôi ký hiệu là Dudu31, Cachua 89 và Cachua100 dựa trên cây ký chủ và mã mẫu cây bệnh (Bảng... (Lazarowitz, 1992) 2 Đặc điểm của chi Begomovirus 2.1 Lịch sử phát hiện, phân bố và đa dạng của Begomovirus Một vài giả thuyết đã được đề xuất về nguồn gốc của begomovirus có bộ gen đơn như TYLCV Phân tích các trình tự của tất cả các TYLCV đã gợi ý rằng các chủng phân lập từ Israel và Iran có thể có bộ gen khảm (chimeric genomes) xuất hiện do tái tổ hợp giữa tổ tiên của virus TYLCD và ToLCD, cả hai bệnh... chủ yếu do virus được giữa lại trong cơ thể của bọ phấn trắng là môi giới truyền bệnh và đề xuất biện pháp dùng bẫy dính màu vàng để thu hút bọ phấn trắng 2.7 Đặc điểm hình thái và cấu trúc bộ gen của Begomovirus 2.7.1 Hình thái của Begomovirus Cũng như các geminivirus khác begomovirus có cấu trúc phân tử (virion) bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là một tam giác đều với số đơn vị tam... mặt của CoYVV ở Việt Nam đã đưa ra giả thuyết rằng virus giống với cụm Tân thế giới có thể đã có mặt ở Cựu thế giới trước khi bị phân chia ở kỷ Gondwana (Hà Viết Cường và cộng sự, 2008) Hiện nay, việc phân loại begomovirus chủ yếu dựa trên so sánh trình tự của chuỗi phân tử DNA-A Theo Fauquet và cộng sự 2008, việc phân loại loài trong chi begomovirus tuân thủ một số tiêu chuN n sau: - Thành phần của. .. nhiên và kiểu hình của triệu trứng Tên của các loài virus mới được đặt sử dụng tiêu chuN n được đưa ra ICTV Uỷ ban Phân loại Virus Quốc tế (International Committee on Taxonomy of Viruses) nhóm nghiên cứu Geminiviridae (Fauquet và cộng sự, 2003) 2.3 Triệu chứng bệnh do Begomovirus gây ra Một trong những đặc điểm gây bệnh của begomovirus là các bệnh trên một loài cây trồng thường do nhiều loài begomovirus. .. QUAN TÀI LIỆU 1 Đặc điểm của họ Geminiviridae Geminiviridae là họ virus thực vật lớn nhất với 209 thành viên đã được xác định (Fauquet và Stanley, 2005) Các Geminivirus đặc trưng bởi bộ gen DNA vòng đơn (ssDNA) dài khoảng 2.7 kb và được gói trong hạt cầu kép 20 mặt Geminivirus có thể có bộ gen đơn với một phân tử DNA, hoặc bộ gen kép chứa hai phân tử DNA (Stanley và cộng sự, 2005) Geminivirus gây ra nhiều... kết hợp của BC1 trong tính gây bệnh đã được chứng minh thông qua thí nghiệm chuyển gen Thuốc lá và cà chua đã được chuyển gen BC1 của Tomato mottle virus (TMoV) và BDMV, lần lượt những đặc điểm điển hình của virus xâm nhiễm đã được nhận thấy Hình 2.4: Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus (http://www.informaworld.com) 2.7.4 Đặc điểm của vùng IR Các đơn vị sao chép ngược nhau trên phân tử DNA-A và DNA-B... tự amino axit giống nhau) (Briddon và cộng sự, 2004) Các phân tử DNA-1 có thể tái bản độc lập, nhưng chúng vẫn phụ thuộc vào sự giúp đỡ của virus cho việc di chuyển hệ thống vì chúng có thể lắp ráp được trong phân tử begomovirus Tuy nhiên, trái với DNA-β, các phân tử Nanovirus like-DNA 1 không có vai trò trong tính gây bệnh Hình 2.6: Cấu trúc của phân tử vệ tinh Nanovirus-like DNA-1 (http://wcrc.confex.com)... trên cả cây một lá mầm và hai lá mầm trong đó có các cây trồng quan trọng như cây sắn, cây bông, cây đậu và cà chua Các geminivirus được phân thành bốn nhóm, mastrevirus, curtovirus, begomovirus và topocuvirus dựa trên cấu trúc genome, phổ ký chủ và vector truyền bệnh Các geminivirus khác nhau về tổ chức genome, phản ánh sự đa dạng của các geminivirus Tuy nhiên, các geminivirus các đặc trưng chung... cấu trúc các phân tử bao gồm: (1) Một cấu trúc stem-loop gồm một vòng thòng lọng (loop) với một chuỗi bảo thủ ngắn TAGTAATAT (2) Một khung đọc mở trên mạch chính mã hóa cho một protein có kích thước khảng 315 aa và tương đương với protein rep của các nanovirus (3) Một vùng giàu A nắm ở phía dưới của vùng mã hóa (đặc trưng 100-200 nucleotide) (Briddon và cộng sự, 2004) Trình tự Rep của nanovirus-like ... Kết gợi ý nhiều loài begomovirus gây hại cà chua trồng khác Việt Nam cần phải xác định Chính tiến hành đề tài: Xác định đặc trưng phân tử số virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) Mục... trung bình begomovirus) virus Vì danh tính vị trí phân loại begomovirus xác định xác dựa toàn trình tự phân tử DNA begomovirus nên mục tiêu phần 4.1 giải trình tự toàn bộ gen virus Ba mẫu virus ký... ORF phân tử genome, thấy phân tử có nhiều ORF khác xắp xếp chi u Tuy nhiên, phân tử chứa ORF đặc trưng cho gen begomovirus gồm ORF sợi virus (V2, V1, chi u kim đồng hồ) ORF sợi bổ sung với sợi virus