2. Đặc điểm của chi Begomovirus
3.2.2.Chiết tách DNA tổng số từ mẫu mô thực vật
Nghiền khoảng 0.1g mẫu tươi trong 500µl đệm CTAB (đã bổ xung Beta- mercaptalthanol) (theo Sambrock và cộng sự, 1998). Sau đó, dung dịch mẫu được chiết 2 lần bằng hỗn hợp Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1. AND tổng số được tủa bằng Propanol 100%, rửa cặn AND 2 lần bằng 700µl Etanol 70% và để khô cặn AND trong không khí ít nhất 30 phút. Hoà cặn AND trong 100µl nước cất hai lần đã hấp vô trùng, bảo quản AND
3.2.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và điện di sản ph6m PCR
Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích là 25µl chứa: 0,5µl mỗi mồi có nồng độ 20µM; 0,5µl dung dịch dNTPs 10mM; 2,5µl đệm Dream taq 10X; 20,5µl và 0,5µl Taq polymerase (Fermentas). Chu trình phản ứng PCR như sau: 94oC trong 5 phút, sau đó là 35 chu kì: 94oC -30 giây, 50oC-35 giây, 72oC-1 phút 35 giây, cuối cùng là 72oC-5 phút. Sản phNm PCR được điện di trên gel agarose 1 % và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide.
3.2.4. Phương pháp tinh chiết sản ph6m PCR
Sử dụng PureLinhTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) để tiến hành tinh chiết sản phNm PCR từ gel agarose. Các bước tinh chiết thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
3.2.5. Nhân dòng bằng InsTAclone™ PCR Cloning Kit (của Fermentas)
Sử dụng 1,5 µl Vector pTZ57R/T cho 15 µl thể tích nối với 10 µl sản phNm PCR;
3.0 µl đệm 5X ligation và 0.5µl T4 DNA ligase. Ủ hỗn hợp nối ở nhiệt độ phòng (220C) trong 1h hoặc qua đêm ở nhiệt độ 40C.
Để thực hiện việc nhân dòng, chúng tôi sử dụng tế bào vi khuNn E. coli chủng XL- 1 Blue có để làm nguồn tế bào khả biến bằng cách nuôi vi khuNn trong môi trường CM và xử lý tế bào với đệm T sẵn có trong kit InsTAclone™ PCR Cloning. Vector tái tổ hợp ở
trên được biến nạp vào tế bào vi khuNn khả biến bằng cách hỗn hợp chúng với nhau và ủ
trên đá trong 15 phút (không cần sốc nhiệt). Sau khi biến nạp, cây trải đều dung dịch vi khuNn lên môi trường LB agar + Ampicyline 100 µg/ml + X-gal 12.5 µg/ml + IPTG 100 µg/ml đã được ủ ấm. Nuôi cấy qua đêm ở 370C. Kiểm tra, chọn lọc trắng xanh và nuôi lắc trong môi trường LB lỏng + Ampicillin 100 µg/ml để nhân sinh khối (thành phần môi trường LB được trình bày ở phụ lục 1).
3.2.6. Tinh chiết plasmid
Để thu plasmid đã được nhân dòng từ sinh khối tế bào vi khuNn E.coli, chúng tôi sử dụng quy trình chiết của CuPrep Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer). Các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. ADN plasmid được bảo quản trong tủ lạnh -200 C.
3.2.7. Phương pháp giải trình tự Gen
- Phản ứng Sequencing sử dụng BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem).
- Tinh chiết sản phNm Sequencing: Thêm 55 µl Ethanol 100% và 2 µl sodium acetate 3M, pH = 5.2 nhằm kết tủa sản phNm. Sau đó rửa lại sản phNm bằng cồn 70%.
3.2.8. Phương pháp và phần mềm phân tích chuỗi DNA - Sử dụng một số chương trình tin sinh học: - Sử dụng một số chương trình tin sinh học:
Chương trình BLAST ( NCBI ) Chương trình BioEdit 7.0.9
Chương trình DNAstar 7.1 (Lasergene) Chương trình Vecter NTI 9.0 (Invitrogene) Chương trình ClustalX 2.0 và Mega 4.0.
Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nhân dòng và giải trình tự toàn bộ gen của ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89 và Dudu 31
Trong năm 2009, Lê Văn Hải (CNSH50) đã phân lập được 3 begomovirus chưa từng được phát hiện ở Việt Nam gây hại trên cây đu đủ và cà chua. Tác giảđã giải trình tự
trực tiếp khoảng 1.2 kb (~ 40 % kích thước bộ gien trung bình của begomovirus) của cả 3 virus này.
Vì danh tính và vị trí phân loại của begomovirus chỉ có thể được xác định chính xác dựa trên toàn bộ trình tự phân tử DNA của begomovirus nên mục tiêu của phần 4.1 của chúng tôi là giải trình tự toàn bộ bộ gen của 3 virus này. Ba mẫu virus được chúng tôi ký hiệu là Dudu31, Cachua 89 và Cachua100 dựa trên cây ký chủ và mã mẫu cây bệnh (Bảng 4.1).
Bảng 4.1. Nguồn gốc 3 mẫu virus được nghiên cứu trong báo cáo này
Mẫu virus Mã mẫu cây Cây ký chủ Thời gian thu mẫu Địa điểm Triệu chứng
Dudu31 31 Đu đủ 7/2008 Yên Mỹ-Hưng Yên Xoắn lá Cachua89 89 Cà chua 9/2008 Đa tốn-Gia Lâm-Hà Nôi Xoăn vàng lá Cachua100 100 Cà chua 9/2008 Yên Mỹ - Thanh Trì - Hà Nội Xăn vàng lá
Ghi chú: DNA tổng sốđã được chiết từ trước (năm 2009) và bảo quản ở -20 OC
4.1.1. Thiết kế mồi nhân toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus
Begomovirus là các virus có bộ gen DNA dạng vòng, kích thước khoảng 2.7 – 2.8 kb. Để nhân toàn bộ bộ gen của begomovirus, người ta thường sử dụng 1 cặp mồi liền kề
nhưng ngược chiều nhau gọi là mồi “back-to-back”, được thiết kế trên một trình tự đã biết. Dựa trên 3 trình tự thu được khi giải trình tự trực tiếp mẫu virus của Lê Văn Hải (mỗi trình có kích thước 819 nt), chúng tôi thiết kế mồi để nhân toàn bộ DNA của ba mẫu virus. Nhìn chung, đối với mỗi một virus, người ta sẽ sử dụng một cặp mồi liền kề riêng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tuy nhiên, khi căn trình tự đa chuỗi bằng phần mềm Seqman (gói phần mềm Lasergen, hãng DNASTAR), chúng tôi thấy có nhiều vùng bảo thủ của cả 3 chuỗi virus. Dựa trên 1 vùng bảo thủ dài 43 nt (vị trí 559 tới vị trí 601, Hình 4.1), chúng tôi đã thiết kế 1 cặp mồi chung liền kề ký hiêu là Hai50F (xuôi dòng) và Hai50R (ngược dòng) để nhân toàn bộ
genome của 3 virus (Bảng 4.2). Vị trí tương đối của cặp mồi chung liền kề trên genome của begomovirus được trình bày ở Hình 4.2.
Hình 4.1. Vùng bảo thủ dùng để thiết kế mồi chung liền kề nhân toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus Dudu31, Cachua 89 và Cachua100. Vùng thiết kế mồi được bôi đen.
Bảng 4.2: Các mồi liền kề nhân toàn bộ bộ gen của ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89 và Dudu 31 Chuỗi Đặc điểm Đoạn bảo thủ 5’CCTCAGGTTGTAATTGAATTGGACTTGTATTGTGATGATGTCG3’ Trình tự : 5’GGACTTGTATTGTGATGATGTCG3’ Chiều dài: 23nt Hàm lượng GC: 43 % Mồi Hai50F Tm: 51.2 °C Trình tự: 5’CCAATTCAATTACAACCTGAGG3’ Chiều dài: 22nt Hàm lượng GC: 41 % Mồi Hai50R Tm: 50.7 °C
Ghi chú: Hai nucleotid gối nhau của 2 mồi được đóng hộp. Tm của mồi được tính theo phần mềm Oligo Calc (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)
Hình 4.2. Vị trí tương đối của cặp mồi chung liền kề Hai50F/Hai50R trên bộ gen của begomovirus
4.1.2. Nhân toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus bằng PCR
Do đặc điểm bộ gen của virus lớn (khoảng 2.7 kb) và đểđảm bảo trình tự DNA thu
được không bị lỗi cũng như tăng tính đặc hiệu, chúng tôi sử dụng kit Expand Long Template PCR System (hãng Roche) với đệm phản ứng số 3 (chứa thêm chất tNy rửa) để
thực hiện phản ứng. Phản ứng PCR nhân toàn bộ bộ gen của 3 virus đã được thực hiện với cặp mồi liền kề chung Hai50F/Hai50R với DNA tổng số chiết từ mẫu cây nhiễm bệnh năm 2009 và bảo quản từ trước ở -20 OC. Kết quả điện di sản phNm PCR cho thấy cả 3 mẫu đều tạo băng sản phNm PCR kích thước xấp xỉ 2.7 kb chứng tỏ toàn bộ bộ gen của ba mẫu virus đã được nhân dòng thành công (Hình 4.3).
M Dudu 31 Cachua 89 Cachua10
Hình 4.3. PCR nhân toàn bộ DNA-A của ba mẫu virus. M là thang DNA 1 kb (Fermentas).
~2.7 kb
Hai50F Hai50R
3.0 kb 2.5 kb
Sản phNm PCR của 3 mẫu được cắt khỏi agarose gel và được được tinh sạch bằng kít thôi gel Pure LinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.3. Nhân dòng bộ gen của 3 mẫu virus trong vi khu6n E.coli
Để nhân dòng bộ gen của ba mẫu virus, chúng tôi sử dụng bộ kít nhân dòng InsTAclone™ PCR Cloning Kit của hãng Fermentas và nguồn tế bào E. coli dòng XL1- Blue của hãng Stratagen. Toàn bộ qui trình nhân dòng được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Đầu tiên, sản phNm PCR tinh chiết ở trên được nối vào vector nhân dòng pTZ57R/T sẵn có trong kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tiếp theo chúng tôi sử dụng tế bào vi khuNn E. coli chủng XL-1 Blue có để làm nguồn tế bào khả biến bằng cách nuôi vi khuNn trong môi trường CM và xử lý tế bào với đệm T sẵn có trong kit InsTAclone™ PCR Cloning. Vector tái tổ hợp ở trên được biến nạp vào tế bào vi khuNn khả biến bằng cách hỗn hợp chúng với nhau và ủ trên đá trong 15 phút (không cần sốc nhiệt). Ngoài ra, chúng tôi cũng biến nạp vector pTZ57R/T dạng vòng sẵn có trong kít (DNA1 control) làm
đối chứng hiệu quả biến nạp.
Để chọn lọc dòng vi khuNn mang vector tái tổ hợp, các tế bào vi khuNn sau khi biến nạp được cấy trải trên môi trường chọn lọc (môi trường LB agar chứa tetracycline, ampicilline, IPTG và Xgal) và ủ qua đêm ở 37 0C.
Quan sát các đĩa nuôi cấy qua đêm (Hình 4.4) cho thấy:
Ởđĩa đối chứng, xuất hiện rất nhiều khuNn lạc (> 200) khuNn lạc trắng đặc trưng E. coli chứng tỏđiều kiện và hiệu quả biến nạp tốt.
Ở cả ba đĩa thí nghiệm Cachua 100, Cachua 89 và Dudu 31 xuất hiện cả 2 loại khuNn lạc trắng và xanh nhạt với số lương ít hơn nhiều so với đối chứng (<100). Kết quả
Hình 4.4. Các mẫu vi khuNn XL1-blue biến nạp được cấy trải và ủ qua đêm trên môi trường chọn lọc trắng xanh.
(1): Mẫu đối chứng (với DNA1 control); (2): Mẫu biến nạp Cachua 89; (3): Mẫu biến nạp Cachua 100; (4) Mẫu biến nạp Dudu 31
4.1.4. Kiểm tra kết quả biến nạp vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn
Tuy nhiên, không phải tất cả các khuNn lạc trắng đều chứa sản phNm DNA đúng vì nhiều phân tử DNA có thể gẫy hoặc phân hủy từng phần trong quá trình tinh chiết vẫn nối
được vào vector nhân dòng. Vì vậy, để kiểm tra và chọn các dòng vi khuNn mang vector chứa sản phNm nối đúng, chúng tôi chọn 4 khuNn lạc trắng ở mỗi mẫu đĩa vi khuNn biến nạp và cấy đơn khuNn lạc vào ống nghiệm chứa môi trường LB lỏng (4 mL) chứa kháng sinh ampicilline. Các ống nghiệm được nuôi ở nhiệt độ 370C, lắc 250 vòng/phút qua đêm. Tiếp theo, vector tái tổ hợp được tinh chiết từ tế bào vi khuNn dùng kít tinh chiết palasmid là Accuprep Plasmid Mini Extraction Kit (hãng Bioneer). Sự có mặt của DNA virus trong vector tái tổ hợp tinh chiết (miniprep) được kiểm tra bằng hai emzym cắt giới hạn là BamHI và E.coRI. Hai enzyme này sẽ giải phóng sản phNm nối khỏi vector nhân dòng. Kết quả kiểm tra được trình bày ở Bảng 4.3 và Hình 4.5.
Kết quả cho thấy 11/12 dòng kiểm tra đều chứa băng vector (~2.8 kb). Trong số (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(tổng các băng của sản phNm nối ~ 2.7-2.8 kb tương ứng với kích thước bộ gen virus). Các dòng đúng này là 31-1, 31-2, 31-3 (mẫu biến nạp Dudu31), 89-4 (mẫu biến nạp Cachua89), 100-1, 100-2, 100-4 (mẫu biến nạp Cachua100).
Chúng tôi đã chọn các dòng 31-1, 89-4, 100-4 để giải trình tự.
Bảng 4.3. Kiểm tra vector tái tổ hợp (miniprep) bằng BamHI và E.coRI
Sản ph6m nối (kb) Mẫu biến nạp Dòng (clone) Băng vector (kb) Băng Tổng Kết luận sản ph6m nối 31-1 2.8 1.25; 1.1; 0.35 2.7 Đúng 31-2 2.8 1.25; 0.65; 0.4; 0.35 2.75 Đúng 31-3 2.8 1.25; 1.1; 0.35 2.7 Đúng Dudu31 31-4 2.8 1.25; 0.4; 0.3 1.95 Đứt gẫy 89-1 2.8 - Vector tự nối 89-2 2.8 0.6; 0.35 0.95 Đứt gẫy 89-3 2.8 0.3; 0.35 0.65 Đứt gẫy Cachua89 89-4 2.8 1.25; 0.65; 0.4; 0.35 2.75 Đúng 100-1 2.8 1.25; 1.1; 0.35 2.7 Đúng
100-2 - - Nhiễm tạp/tinh chiết? 100-3 2.8 1.25; 1.1; 0.35 2.7 Đúng
Cachua100
100-4 2.8 1.25; 1.1; 0.35 2.7 Đúng
Hình 4.5: Kết quảđiện di sản phNm miniprep đã được cắt bằng BamHI và E.coRI . Các giếng 31-1, -2,-3, -4 là của mẫu Dudu31. Các giếng 89-1, -2,-3, -4 là của mẫu Cachua89. Các
giếng 100-1, -2,-3, -4 là của mẫu Cachua100.
4.1.5. Kết quả giải trình tự gen
Việc giải trình tự toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus được thực hiện trên khuôn vector tái tổ hơp tinh chiết (miniprep). Phản ứng giải trình tự được thực hiện với kit BigDye terminator (hãng A&B). Sau khi thực hiện phản ứng giải trình tự tại TT bệnh cây nhiệt
đới, hỗn hợp phản ứng được làm khô và gửi đọc bằng điện di mao quản tại tại Viện CNSH-Viện Khoa Học Công Nghệ Quốc Gia.
Vì bộ gen của virus khá lớn nên chúng tôi tiến hành giải trình tự hai lần theo cả 2 chiều (Hình 4.6). Lần thứ nhất chúng tôi sử dụng 2 mồi được thiết kế trên vector là SeqF và SeqR. Với trình tự thu được từ lần thứ nhất của ba mẫu virus, chúng tôi thực hiện căn trình tự và thiết kế 2 mồi giải trình tự chung cho cả 3 chuỗi để thực hiện tiếp việc giải trình tự lần 2 cho phần còn lại của bộ gen. Hai mồi cho lần giải trình tự thứ 2 này được ký
hiệu là HaiSeqF (5’GACCTCCTTTTGTTTGTGAC3’) và HaiSeqR
Hình 4.6: Sơđồ giải trình tự bộ gen của 3 mẫu virus được dòng hóa trên vector pTZ57R/T. Kết quả sau khi giải trình tự chúng tôi thu được bốn trình tự cho mỗi mẫu. Tất cả
các trình tựđều có chất lượng tốt (đồ thị trình tự rõ ràng, không nhiễu) với chiều dài đọc
được khoảng 800 bp (Phụ lục 2).
Các trình tự này cùng với trình tự thu được khi giải trình tự trực tiếp (Lê Văn Hải, 2009) được chúng tôi lắp ráp và biên tập bằng chương trình Seqman (Lasergen, DNASTAR). Cuối cùng, chúng tôi thu được một trình tự genome duy nhất cho mỗi virus. Các trình tự này (Phụ lục 3) đã được gửi trên GenBank.
DNA virus
Bộ gen virus
SeqF HaiSeqF HaiSeqR SeqR
pTZ57R/T pTZ57R/T
4.2. Đặc trưng phân tử của ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89 và Dudu 31 4.2.1. Tổ chức bộ gen 4.2.1. Tổ chức bộ gen
Tổ chức bộ gen của ba mẫu virus được thực hiện bằng chương trình Vector NTI Suite 7 và đươc trình bày ở Bảng 4.4 và Hình 4.7.
Bộ gen của cả 3 virus được giải trình tựđều có kích thước và cấu trúc tương tự như
các virus thuộc chi Begomovirus nhóm Cựu thế giới. Toàn bộ bộ gen có kích thước khoảng 2.7 kb (2740 nt - Cachua100; 2743 nt - Cachua 89; 2748 nt – Dudu31). Trình tự
bắt đầu tại vị trí nucleotid thứ 8 (A) của chuỗi bảo thủ TAATATTAC (là vị trí cắt và nối bởi protein Rep trên DNA genome trong quá trình tái bản theo cơ chế vòng lăn).
Sử dụng phần mềm VectorNTI để tìm kiếm các ORF trên cả 3 phân tử genome, chúng tôi thấy trên mỗi phân tử có rất nhiều ORF khác nhau xắp xếp trên cả 2 chiều. Tuy nhiên, mỗi phân tử đều chứa 6 ORF đặc trưng cho bộ gen của các begomovirus gồm 2 ORF trên sợi virus (V2, V1, cùng chiều kim đồng hồ) và 4 ORF trên sợi bổ sung với sợi virus (C4, C1, C2, C3, ngược chiều kim đồng hồ) (Hình 4.7).
Trên sợi virus, ORF V2 (mã hóa protein V2) của cả 3 virus đều có kích thước 348 nt (116 aa). Phía đầu 3’ của ORF V2 là ORF V1 (mã hóa cho protein vỏ CP). ORF V1 của cả 3 virus đều có kích thước 771 nt (257 aa). Tương tự như của các begomovirus khác, 2 ORF này gối lên nhau 187 nt.
Trên sợi bổ sung, ORF lớn nhất là ORF C1 (mã hóa protein Rep), đều có kích thước bằng 1083 nt (361 aa) cho cả 3 virus. ORF nhỏ nhất là ORF C4 (mã hóa protein C4) nằm gọn trong đầu 5’ của ORF C1 với kích thước giống nhau cho cả 3 virus là 291 nt (97 aa) (Hình 4.7). Hai ORF còn lại là C2 (mã hóa protein TrAP) và C3 (mã hóa protein REn) đều có kích thước bằng nhau là 402 nt (134 aa). Như một qui luật chung đối với tất cả các beomovirus, ORF C4 và ORF C2 luôn nằm trên một khung đọc mã (c1, c2, c3 lần lượt đối với Dudu31, Cachua89 và Cachua100). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bộ gen của 3 virus đều có một vùng liên gen không phiên mã (IR, Intergenic Region) kích thước khoảng 270 nt có vị trí tính từđầu 5’ của ORF C1 tới đầu 5’ của ORF V2 tương tự như IR của các begomovirus khác. IR có chứa nguồn gốc tái bản (ori, origin of replication) với nhiều dấu hiệu quan trọng như trình bày ở phần 4.2.2.1.
Bảng 4.4.Đặc điểm bộ gen của 3 mẫu begomovirus
Genome/ORF Chỉ tiêu Đu đủ31 Cà chua89 Cà chua100
DNA genome Kích thước (nt) 2748 2743 2740