2. Đặc điểm của chi Begomovirus
4.3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của ToLCVV và TYLCVNV bằng mồi đặc hiệu
Hiện nay, tại miền Bắc Việt Nam mới chỉ phát hiện sự có mặt của 2 begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua là ToLCVV và TYLCVNV. Để kiểm tra sự có mặt của 2 virus này trên 8 mẫu cà chua nhiễm begomovirus, chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu cho mỗi virus.
Kết quả sử dụng cặp mồi ToLCVV-sp-F2/ToLCVV-sp-R2 (đặc hiệu ToLCVV) cho thấy 5/8 mẫu thử tạo các băng đơn và rõ với kích thước khoảng 0.45 kb (Hình 4.15 Bảng 4.11), xác nhận sự có mặt của ToLCVV.
Kết quả sử dụng cặp mồi TYLCVNV-sp-R1/TYLCVNV-sp-F1 (đặc hiệu TYLCVNV) cho thấy 3/8 mẫu tạo ra tạo các băng đơn và rõ với kích thước ~ 1.4 kb (Hình 4.15 , Bảng 4.11 ), xác nhận sự có mặt của TYLCVNV.
Kết quả kiểm tra PCR đã phát hiện thấy mẫu số 6 (mẫu thu ở Ba Đình, Bỉm Sơn, Thanh Hóa) có kết quả (+) với cả hai cặp mồi chứng tỏ mẫu này đã nhiễm cả 2 virus
ToLCVV và TYLCVNV. Nhiễm bệnh hỗn hợp 2 hay nhiều begomovirus trên cùng một cây là hiện tượng khá phổ biến đối với begomovirus (Fauquet và cộng sự, 2005). Nhiễm bệnh hỗn hợp có thể gây hậu quả lớn về tiến hóa của begomovirus vì chúng có thể tái sinh thông qua cơ chế phụ thuộc tái tổ hợp (Jeske và cộng sự, 2001) dẫn tới hình thành các begomovirus mới.
Hình 4.15. Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus, ToLCVVV và TYLCVNV trên 8 mẫu cà chua. M là thang DNA (GeneRuler 1 kb, Fermentas) giếng số 1 đến giếng số 8 tương ứng là các mẫu từ
mẫu số 1 đến mẫu số 8 (Bảng 4.11). Băng sản phNm PCR đúng được chỉ rõ bằng mũi tên. M ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 M ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8 ToLCVV TYLCVNV Begomovirus
Bảng 4.11. Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus, TYLCVNV và ToLCVV trên các mẫu cà chua
PCR
Mẫu Địa điểm thu mẫu
Begomovirus TYLCVNV ToLCVNV
1 Nga Thành, Nga Sơn, Thanh Hóa + – +
2 Nga Thành, Nga Sơn, Thanh Hóa + – +
3 Nga Thành, Nga Sơn, Thanh Hóa + + -
4 Nga Mĩ, Nga Sơn, Thanh Hóa + – -
5 Nga Mĩ, Nga Sơn, Thanh Hóa + + -
6 Ba Đình, Bỉm Sơn, Thanh Hóa + + +
7 Ba Đình, Bỉm Sơn, Thanh Hóa + – +
8 Hồ, Thuận Thành, Bắc Ninh + – +
Kết quả kiểm tra PCR cũng đã phát hiện thấy mẫu số 4 (mẫu thu ở Nga Mĩ, Nga Sơn, Thanh Hóa) có kết quả (-) đối với cả hai cặp mồi này, có thể mẫu số 4 đã không nhiễm cả 2 virus ToLCVV và TYLCVNVmà đã nhiễm một virus khác hoặc nhiễm một loài virus mới. Để xác định danh tính của virus này, chúng tôi đã giải trình tự trực tiếp sản phNm PCR bằng mồi PCR.
Kết quả giải trình tự cả 2 chiều cho thấy chất lượng trình tự rất kém vì mồi giải trình tự là mồi chung. Tuy nhiên chúng tôi cũng thu được 1 đoạn khoảng 960 nt có thểđọc được (Phụ lục 5).
So sánh trình tự (kể cả tìm kiếm BLAST) thấy đoạn này đồng nhất khoảng 95 % với đoạn tương ứng của ToLCHV gợi ý mẫu virus số 4 thu tại Thanh Hóa thuộc loài này. Tuy nhiên danh tính chính xác của virus chỉđược xác định dựa trên toàn bộ bộ gen.
Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHN