2. Đặc điểm của chi Begomovirus
4.3. Phát hiện các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua trên đồng ruộng
Cho tới nay, có khoảng 60 begomovirus khác nhau gây hại cà chua khắp thế giới. Phần lớn các virus này gây bệnh xoăn vàng lá với triệu chứng không thể phân biệt được.
Ở Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá là bệnh virus nguy hiểm nhất trên cà chua và có thể xem là bệnh do begomovirus quan trọng nhất trên cây trồng. Vì Việt Nam là một trong các trung tâm đa dạng của begomovirus (Ha và cộng sự, 2008; Nawaz-ul-Rehman & Fauquet, 2009) nên nhiều begomovirus có thểđang gây hại trên cà chua của Việt Nam.
Mục tiêu của phần thí nghiệm này là xác định begomovirus gây hại trên cà chua tại Việt Nam. Chúng tôi đã tiến hành thu các mẫu cà chua có triệu chứng đặc trưng của bệnh xoăn vàng lá (Hình 4.14) tại một số huyện của Thanh Hóa và Bắc Ninh. Kết quả chúng tôi thu được 8 mẫu cà chua.
Hình 4.14: Triệu chứng của các mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá. Mẫu 1- 7 thu tại Nga Sơn và Bỉm Sơn (Thanh Hóa) còn mẫu 8 thu tại Thuận Thành (Bắc Ninh)
Toàn bộ mẫu sau khi thu vềđược chúng tôi ký hiệu cNn thận để tránh nhầm lẫn và cho vào tủ sấy với nhiệt độ 40oC trong khoảng 24 - 36 giờ, đến khi kiểm tra thấy mẫu khô giòn sẽ cho vào túi nilon dày có chứa silicagel để bảo quản. Kết quả, chúng tôi đã thu thập và xử lý 8 mẫu cà chua, tất cảđều được bảo quản cNn thận.
4.3.2. Xác định begomovirus bằng PCR và giải trình tự
4.3.2.1. Kiểm tra sự có mặt của begomovirus bằng cặp mồi chung (degenerate primers)
DNA tổng số từ các mẫu cà chua được chiết bằng CTAB. Tiếp theo, sự có mặt của begomovirus được kiểm tra bằng PCR dùng cặp mồi chung đặc hiệu cho DNA-A của các begomovirrus là BegoAFor1 & BegoAReV1 (sản phNm ~ 1.2 kb).
Kết quả kiểm tra PCR (Hình 4.15) cho thấy tất cả các mẫu PCR dùng cặp mồi BegoAFoR1 & BegoAReV1 đều tạo ra một băng DNA có cùng kích thước xấp xỉ 1.2 kb chứng tỏ chúng bị nhiễm begomovirus.
4.3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của ToLCVV và TYLCVNV bằng mồi đặc hiệu
Hiện nay, tại miền Bắc Việt Nam mới chỉ phát hiện sự có mặt của 2 begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua là ToLCVV và TYLCVNV. Để kiểm tra sự có mặt của 2 virus này trên 8 mẫu cà chua nhiễm begomovirus, chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu cho mỗi virus.
Kết quả sử dụng cặp mồi ToLCVV-sp-F2/ToLCVV-sp-R2 (đặc hiệu ToLCVV) cho thấy 5/8 mẫu thử tạo các băng đơn và rõ với kích thước khoảng 0.45 kb (Hình 4.15 Bảng 4.11), xác nhận sự có mặt của ToLCVV.
Kết quả sử dụng cặp mồi TYLCVNV-sp-R1/TYLCVNV-sp-F1 (đặc hiệu TYLCVNV) cho thấy 3/8 mẫu tạo ra tạo các băng đơn và rõ với kích thước ~ 1.4 kb (Hình 4.15 , Bảng 4.11 ), xác nhận sự có mặt của TYLCVNV.
Kết quả kiểm tra PCR đã phát hiện thấy mẫu số 6 (mẫu thu ở Ba Đình, Bỉm Sơn, Thanh Hóa) có kết quả (+) với cả hai cặp mồi chứng tỏ mẫu này đã nhiễm cả 2 virus
ToLCVV và TYLCVNV. Nhiễm bệnh hỗn hợp 2 hay nhiều begomovirus trên cùng một cây là hiện tượng khá phổ biến đối với begomovirus (Fauquet và cộng sự, 2005). Nhiễm bệnh hỗn hợp có thể gây hậu quả lớn về tiến hóa của begomovirus vì chúng có thể tái sinh thông qua cơ chế phụ thuộc tái tổ hợp (Jeske và cộng sự, 2001) dẫn tới hình thành các begomovirus mới.
Hình 4.15. Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus, ToLCVVV và TYLCVNV trên 8 mẫu cà chua. M là thang DNA (GeneRuler 1 kb, Fermentas) giếng số 1 đến giếng số 8 tương ứng là các mẫu từ
mẫu số 1 đến mẫu số 8 (Bảng 4.11). Băng sản phNm PCR đúng được chỉ rõ bằng mũi tên. M ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 M ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8 ToLCVV TYLCVNV Begomovirus
Bảng 4.11. Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus, TYLCVNV và ToLCVV trên các mẫu cà chua
PCR
Mẫu Địa điểm thu mẫu
Begomovirus TYLCVNV ToLCVNV
1 Nga Thành, Nga Sơn, Thanh Hóa + – +
2 Nga Thành, Nga Sơn, Thanh Hóa + – +
3 Nga Thành, Nga Sơn, Thanh Hóa + + -
4 Nga Mĩ, Nga Sơn, Thanh Hóa + – -
5 Nga Mĩ, Nga Sơn, Thanh Hóa + + -
6 Ba Đình, Bỉm Sơn, Thanh Hóa + + +
7 Ba Đình, Bỉm Sơn, Thanh Hóa + – +
8 Hồ, Thuận Thành, Bắc Ninh + – +
Kết quả kiểm tra PCR cũng đã phát hiện thấy mẫu số 4 (mẫu thu ở Nga Mĩ, Nga Sơn, Thanh Hóa) có kết quả (-) đối với cả hai cặp mồi này, có thể mẫu số 4 đã không nhiễm cả 2 virus ToLCVV và TYLCVNVmà đã nhiễm một virus khác hoặc nhiễm một loài virus mới. Để xác định danh tính của virus này, chúng tôi đã giải trình tự trực tiếp sản phNm PCR bằng mồi PCR.
Kết quả giải trình tự cả 2 chiều cho thấy chất lượng trình tự rất kém vì mồi giải trình tự là mồi chung. Tuy nhiên chúng tôi cũng thu được 1 đoạn khoảng 960 nt có thểđọc được (Phụ lục 5).
So sánh trình tự (kể cả tìm kiếm BLAST) thấy đoạn này đồng nhất khoảng 95 % với đoạn tương ứng của ToLCHV gợi ý mẫu virus số 4 thu tại Thanh Hóa thuộc loài này. Tuy nhiên danh tính chính xác của virus chỉđược xác định dựa trên toàn bộ bộ gen.
Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHN
5.1. Kết luận
1. Đã sử dụng phản ứng PCR để nhân toàn bộ bộ gen của 3 mẫu begomovirus là Dudu31 (gây bệnh xoăn lá đu đủ tại Hưng Yên), Cachua89 và Cachua100 (gây bệnh xoăn vàng lá cà chua thu tại Hà Nội). Từ sản phNm PCR, toàn bộ bộ gen của 3 mẫu begomovirus
đã được nhân dòng thành công vào tế bào E.coli chủng XL1-Blue.
2. Đã giải trình tự toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus. Toàn bộ bộ gen có kích thước khoảng 2.7 kb (2740 nt - Cachua100; 2743 nt - Cachua 89; 2748 nt – Dudu31) giống như của các begomovirrus khác.
3. Các phân tích phân tử dựa trên bộ gien được giải trình tự của 3 virus cho thấy: chúng có tổ chức bộ gien tương tự như các virus thuộc chi Begomovirus nhóm Cựu thế giới. Mỗi bộ gien đều chứa 6 ORF đặc trưng gồm 2 ORF trên sợi virus (V2, V1, cùng chiều kim đồng hồ) và 4 ORF trên sợi bổ sung với sợi virus (C4, C1, C2, C3, ngược chiều kim đồng hồ). Các ORF này đều mã hóa cho các protein chức năng đặc trưng của begomovirus. Trên sợi virus, ORF V2 mã hóa protein V2, ORF V1 mã hóa protein vỏ
CP. Trên sợi bổ sung, ORF lớn nhất là ORF C1 mã hóa protein Rep, ORF nhỏ nhất là ORF C4 mã hóa protein C4; hai ORF còn lại là C2 (mã hóa protein TrAP) và C3 (mã hóa protein Ren). Bộ gen của 3 virus đều có một vùng liên gen không phiên mã (IR, Intergenic Region) kích thước khoảng 270 nt có vị trí tính từ đầu 5’ của ORF C1 tới
đầu 5’ của ORF V2 tương tự như IR của các begomovirus khác. Phân tích các vùng gen quan trọng của cả 3 virus là IR, protein Rep và protein CP thấy chúng đều chứa các trình tự, motif và dấu hiệu quan trọng cho các chức năng sống chủ chốt của virus như tái sinh, vận chuyển, đặc hiệu vector và lắp ráp phân tử virus (virion).
4. So sánhh trình tự bộ gen của 3 virus với các begomovirus đã công bố thấy mẫu Dudu31 và Cachua89 giống nhất với Tobacco leaf curl Hainan virus (ToLCHV) với
mức đồng nhất nucleotid đều >90% khi so sánh toàn bộ bộ gien hay các vùng gen quan trọng như IR, ORF V1 (CP), ORF C1 (Rep). Đối với mẫu Cachua100, virus này giống nhất với ToLCHV trên toàn bộ bộ gien (với mức đồng nhất 87.6 %), nhưng lại giống nhất Papaya leaf curl China virus (PaLCuCNV) ở vùng IR (92 %), giống nhất Ageratum leaf curl virus (ALCV) ở ORF V1 (97.4 %), giống nhất Tomato yellow leaf curl Thailand virus (TYLCTHV) và ToLCHV ở ORF C1 (lần lượt 92.5 và 92.2 %). 5. Các phân tích phả hệ cho thấy hai mẫu virus Dudu31 và Cachua89 cùng với 2 mẫu
ToLCHV từ Trung Quốc hình thành 1 cụm loài (ToLCHV) rõ rệt. Phân tích cũng cho thấy mẫu Cachua100 hình thành 1 nhánh độc lập nhưng gần gũi với cụm ToLCHV và cụm chứa các mẫu PaLCuCNV.
6. Các phân tích tái tổ hợp đã phát hiện 2 đoạn tái tổ hợp liên quan đến mẫu Cachua100.
Đoạn tái tổ hợp thức nhất là 1 đoạn lớn dài 1574 nt, có nguồn gốc từ PaLCuCNV, bao phủ một vùng từ khoảng giữa của ORF C1 qua vùng IR tới gần hết đầu 3’ của ORF V1. Đoạn tái tổ hợp thứ 2, có nguồn gốc từ ALCV, có kích thước 1157 nts, bao trùm toàn bộ ORF V2, ORF V1 và phần đầu của ORF C3.
7. Các phân tích phân tử và phả hệđã chứng minh 2 mẫu virus Dudu31 và Cachua89 là thành viên của loài Tomato leaf curl Hainan virus mới được phát hiện gần đây (năm 2010) từ Trung Quốc. Đây là lần đầu tiên virus này được phát hiện và đặc trưng tại Việt nam.
8. Đối với mẫu Cachua100, các phân tích phân tử và phả hệ cho thấy đây là một virus thuộc một loài mới của chi Begomovirus. Danh pháp virus được đề xuất là :
• Tên virus: Tomato leaf curl Hanoi virus
• Loài virus: Tomato leaf curl Hanoi virus
• Viết tắt: ToLCHanV
9. Kiểm tra 8 mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá thu thu thập tại Thanh Hóa và Bắc Ninh bằng PCR thấy tất cả chúng đều nhiễm begommovirus. Dùng mồi đặc hiệu để kiểm tra PCR thấy 5/8 mẫu nhiễm Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV), 3/8 mẫu nhiễm Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV), trong đó có 1 mẫu nhiễm hỗn hợp cả 2 virus. Giải trình tự trực tiếp một mẫu (thu tại Thanh Hóa) nhiễm begomovirus nhưng PCR âm tính với ToLCVV và TYLCVNV thấy mẫu này có thể
nhiễm ToLCHV.
5.2. Kiến nghị
1. Tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm sinh học như tính gây bệnh, khả năng lan truyền, phổ ký chủ cũng như điều tra để xác định mức độ phổ biến của ToLCHanV và ToLCHV.
2. Tiếp tục giải trình tự toàn bộ bộ gen của mẫu ToLCHV thu thập được ở Thanh Hóa. 3. Tiếp tục điều tra, thu thập và phát hiện các begomovirus khác gây hại trên cà chua
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Lương Tề - Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuNn và virus hại cây trồng. NXB Giáo dục, Tr178 – 183.
2. Lê Văn Hải (2009). Xác định các virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) trên cây cà chua và các cây khác khu vực Hà Nội và vùng phụ cận. Báo cáo thực tập tốp nghiệp, chuyên ngành CNSH.
3. Nguyễn Văn Viên (1999). Nghiên cứu tình hình phát sinh phát triển và biện pháp phòng trừ
một số bệnh nghiên cứu và bệnh xoăn lá hại cà chua vùng Hà Nội và phụ cận. Luận án TS nông nghiệp.
4. Phạm Thị Nhất (2000), Sâu bệnh chính hại một số cây thực phNm và biện pháp quản lý. NXB Nông Nghiệp Hà Nội, Tr34 – 54.
5. Vũ Triệu Mân – Lê Lương Tề chủ biên (2001). Giáo trình Bệnh cây Nông Nghiệp. NXB Nông Nghiệp.
6. Vũ Văn Hải (2007). Điều tra nghiên cứu bệnh xoăn vàng ngọn cà chua Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) hại cà chua vụ thu đông sớm 2006 tại Hà Nội và phụ cận. Báo cáo thực tập tốt nghiệp, chuyên ngành BVTV.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
7. Accotto, G. P., NavasCastillo, J., Noris, E., Moriones, E. & Louro, D. (2000). Typing of Tomato yellow leaf curl viruses in Europe. European Journal of Plant Pathology 106, 179-186. 8. Alberter, B., Ali Rezaian, M., and Jeske, H. (2005). Replicative intermediates of Tomato leaf curl virus and its staellite DNAs.
9. Argüello-Astorga & Ruiz-Medrano, (2001). An iteron-related domain is associated to Motif 1 in the replication proteins of geminiviruses: identification of potential interacting amino acid- base pairs by a comparative approach.
10. Arguello-Astorga, G. R., Guevara-Gonzalez, R. G., Herrera-Estrella, L. R. & Rivera- Bustamante, R. F. (1994). Geminivirus replication origins have a group specific organization of iteractive elements: amodel for replication. Virology 203, 90-100.
11. Briddon, R. W. (2003). Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus complex. Molecular Plant Pathology 4, 427-434.
12. Cohen, S. & Antignus, Y. (1994). Tomato yellow leaf curl virus, a whitefly-borne geminivirus of tomatoes. Advances in Disease Vector Research 10, 259-288.
13. Cohen, S., Duffus, J. E., Perry, R. & Dawson, R. (1989). A collection and marking system suitable for epidemiological studies on whitefly -borne viruses. Plant Dis. 73, 765-768.
14. Czosnek, H. & Laterrot, H. (1997). A worldwide survey of tomato yellow leaf curl viruses. Archives of Virology 142, 1391-1406.
15. Czosnek, H., Ghanim, M. & Ghanim, M. (2002). The cicurlative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci - insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Annals of Applied Biology 140, 215-231.
16. Czosnek, H., Navot, N. & Laterrot, H. (1990). Geographical distribution of Tomato yellow leaf curl virus. A first survey using a specific DNA probe. Phytopathology Mediterranean 29, 1-6
17. Desbiez, C., David, C., Mettouchi, A., Laufs, J., and Gronenborn, b. (1995). Rep protein of tomato yellow leaf curl geminivirus has an ATPase activity required for viral DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America 92, 5640-4. 18. D'Hondt, M. & Russo, M. (1985). Tomato yellow leaf curl in Senegal. Plant Pathol 112, 153-160.
19. Faria J.C., Bezerra I.C., Zerbini F.M., Ribeiro S.G., Lima M.F. (2000). Situação atual das geminiviroses no Brasil. Fitopatologia Brasileira 25: 125-137
20. Fauquet, C. M. & Stanley, J. (2003). Geminivirus classification and nomenclature: progress and problems. Annals of Applied Biology 142, 165-189.
21. Fauquet, C. M. and Stanley, J. (2005). Revising the way we conceive and name viruses below the species level: A review of geminivirus taxonomy calls for new standardized isolate descriptors. Archives of Virology 150(10), 2151-2179.
22. Fauquet, C. M., and Stanley, J. (2005). Revising the way we conceive and name virus below the species level: A review ò geminivirus taxonomy calls for new standardized isolate descriptors. Archives of Virology 150, 2151-2179.
23. Fauquet, C.M., Briddon, R., Brown, J.K., Moriones, E., Stanley, J., Zerbini, M. & Zhou, X. (2008). Geminivirus strain demarcation and nomenclature. Archives of Virology 153:783–821 24. Fauquet, M. C. & Mayo, M. A. (1999). Abbreviations for plant virus names. Archives of Virology 144, 1249-73.
25. Fontes, E. P., Gladfelter, H. J., Schaffer, R. L., Petty, I. T., and Hanley-Bowdoin, L. (1994b). Geminivirus replication origins have a modular orgnization. Plant Cell 6, 405-16. 26. Fontes, E., Eagle, P., Sipe, P., Luckow, V., and Hanley-Bowdoin, L. (1994a). Interaction between a geminivirus replication protein and origin DNA is essential for viral replication. Juornal of Biological Chemistry 269, 8459-8465.
27. G. R. Argüello-Astorga1, R. Ruiz-Medrano. (2001). An iteron-related domain is associated to Motif 1 in the replication proteins of geminiviruses: identification of potential interacting amino acid-base pairs by a comparative approach.
28. Gafni, Y., and Epel, B. L. (2002). The role of host and viral proteins in intra-and inter- cellular trafficking of geminiviruses.
29. Gennadius, P. (1889). Disease of tobacco plantations in the Trikonia. The aleyrodid of tobacco. Ellenike Georgia 5, 1-13.
30. Green, S. K., Tsai, W. S., Shih, S. L., Black, L. L., Rezaian, A., Rashid, M. H., Roff, M. M. N., Myint, Y. Y. & Hong, L. T. A. (2001). Molecular characterization of begomoviruses associated with leafcurl diseases of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia, Myanmar, and Vietnam. Plant Dis 85, 1286.
31. Guerra-Peraza, O., Kirk, D., Seltzer, V., Veluthambi, K., Schmit, A. C., Hohn, T. & Herzog, E. (2005). Coat proteins of Rice tungro bacilliform virus and Mungbean yellow mosaic virus contain multiple nuclear-localization signals and interact with importin a. J Gen Virol 86, 1815–1826.
32. Ha, C. (2007). Detection and indentification of potyviruses and geminiviruses in VietNam. 33. Ha, C., Coombs, S., Revill, P., Harding, R., Vu, M. & Dale, J. (2008). Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation. Journal of General Virology. 89: 312-326.
34. Hanley-Bowdoin L, Settlage SB, Orozco BM, Nagar S, Robertson D (1999) Gemi- niviruses: models for plant DNA replication, transcription and cell cycle regulation. Crit Rev Plant Sci 18: 71–106.
35. HanleyBowdoin, L., Settlage, S. B., Orozco, B. M., Nagar, S. & Robertson, D. (2000). Geminiviruses: Models for plant DNA replication, transcription, and cell cycle regulation. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 35, 105-140.
36. Harrison, B. D., Swanson, M. M. & Fargette, D. (2002). Begomovirus coat protein: serology, variation and functions. Physiol Mol Pl Path 60, 257-271.
37. Howarth, A. J. & Vandemark, G. J. (1989). Phylogeny of geminiviruses. Journal of General Virology 70, 2717-2727.
38. Hui Zhang, Gaojie Hu and Xueping Zhou, (2009). Molecular Characterization of Tomato Leaf Curl Hainan Virus, a New Begomovirus, and Evidence for Recombination.
39. Hussain A., A. Saleem, W.S. han, H. Tariq, (1991). Vector, whitefly (B.tabaci) in: Cotton leaf curl viruses, the problem, disease situation, rescarch update and control. Publ. Directorate of Agric. Information, Lahore:7.
40. Jeske, H., Lutgemeier, M., and Preiss, W. (2001). DNA forms indicate rolling circle and