2. Đặc điểm của chi Begomovirus
4.2.3. So sánh trình tự và phân tích phả hệ của 3 mẫu virus
Sử dụng phần mềm BLAST trên NCBI, chúng tôi đã tìm kiếm chuỗi gần gũi trên Genbank đối với 3 virus Dudu31, Cachua90 và Cachua 100 dựa trên toàn bộ bộ gen.
Kết quả tìm kiếm cho thấy các virus trên GenBank gần gũi nhất với các virus này là các virus phân lập từ cà chua hoặc đu đủ tại Việt Nam hoặc phía Nam Trung Quốc. Virus được công bố sẵn có trên GenBank gần gũi nhất với cả 3 virus đều là Tomato leaf curl Hainan virus (ToLCHV) gồm 2 isolate là HaNHK7 (FN256261) và HaNHK8 (FN434083) (Bảng 4.5). Cả 2 isolate này đều mới được phân lập gần đây tại đảo Hải Nam (Trung Quốc) (Zhang và cộng sự, 2010).
Bảng 4.5: Virus được công bố sẵn có trên GenBank gần gũi nhất với 3 mẫu virus.
Tên mẫu Virus đã công bố trên GenBank Genbank Mã số score Max Query Coverage
Max Identity
Tomato leaf curl Hainan virus isolate HaNHK7 FN256261 4549 100% 96% Dudu
31 Tomato leaf curl Hainan virus isolate HaNHK8 FN434083 4538 100% 96% Tomato leaf curl Hainan virus isolate HaNHK7 FN256261 4205 100% 94% Cachua
89 Tomato leaf curl Hainan virus isolate HaNHK8 FN434083 4194 100% 94% Tomato leaf curl Hainan virus isolate HaNHK7 FN256261 3507 96% 90% Cachua
100 Tomato leaf curl Hainan virus isolate HaNHK8 FN434083 3496 96% 90%
Ghi chú: Max score là điểm tìm kiếm, Query covery là % đoạn so sánh, Max identity là mức
đồng nhất dựa vào tìm kiếm BLAST.
4.2.3.2. So sánh trình tự 3 virus với các begomovirus đã công bố
Vì cả 3 mẫu virus Dudu31, Cachua89 và Cà chua100 gần gũi nhất với ToLCHV trong tìm kiếm BLAST nên chúng tôi đã so sánh chúng với nhau. Ngoài ra, các virus có khả năng hình thành các sự kiện tái tổ hợp với 3 virus này cũng được so sánh.
Các trình tự so sánh bao gồm toàn bộ bộ gen, vùng IR, ORF V1/ CP và ORF C1/ Rep. Các trình tự được căn trình tự đa chuỗi dùng tùy chọn ClustalV (MegAlign, Lasergen) theo hướng dẫn của Fauquet và cộng sự (2008). Kết quả so sánh được trình bày ở Bảng 4.6.
Bảng 4.6. So sánh trình tự của 3 virus Dudu31, Cachua89 và Cachua100 với một số begomovirus
Mức đồng nhất/tương đồng (%) Virus trên GenBank
Genome (nt) IR (nt) CP (nt) CP (Pr) Rep (nt) Rep (Pr) Dudu31 ToLCHV[HaNHK8]-FN434083 95.9 91.8 95.3 96.5 96.6 97.8 Cachua89 93.7 83.3 98.4 97.3 90.8 92 Cachua100 86.3 64.3 91.3 96.5 88.6 91.7 ToLCVV-AF264063 83.1 68.6 92.1 95.3 86.2 87 AGLCV[G52]-AJ851005 82.9 77.2 90.9 96.5 77.2 83.1 TYLCVNVDQ641697, 82.4 69.7 92.7 95.3 76.6 82.8 PaLCuCNV[G43]-AJ876548 82.3 61.7 92 96.9 80.7 84.5 TYLCTHV-AY514630 77.4 67.5 72.5 78.1 85.3 87.5 Cachua89 Dudu31 93.7 83.3 98.4 97.3 90.8 92 ToLCHV(HaNHK8)-FN434083 93 82.2 96.5 99.2 91.2 92.2 Cachua100 87.7 71 92 99.2 89.6 92 ToLCVV-AF264063 86.3 83.2 93.1 98.1 89.4 90.6 PaLCuCNV(G43)-AJ876548 84.6 72 92.7 99.6 81.9 85 AGLCV(G52)-AJ851005 83.4 79 91.7 99.2 78.9 83.4 TYLCVNV-DQ641697, 83.3 71.9 93.6 98.1 77.6 81.7 TYLCTHV-AY514630 78.9 73.1 73.2 80.5 87.9 90.3 Cachua100 Cachua89 87.7 71 92 99.2 89.6 92 ToLCHV(HaNHK8)-FN434083 87.6 65.1 91.3 98.4 90.4 92.2 PaLCuCNV(G43)-AJ876548 87 92 95.7 99.6 84.5 86.7 Dudu 31 86.3 64.3 91.3 96.5 88.6 91.7 AGLCV(G52)-AJ851005 84.9 60.3 97.4 99.2 77.3 82.8 ToLCVV-AF264063 82.6 73.5 90.5 97.7 86.1 87.5 TYLCTHV-AY514630 80 76.5 71.2 80.1 89.4 92.5 TYLCVNV- DQ641697 78.9 64 90.1 98.1 74.5 80.6
Ghi chú: nt: mức nucleotide; Pr: mức protein. Về thuật ngữ, “mức đồng nhất (identity)” dùng để
so sánh trình tự nucleotide còn “mức tương đồng (similarity)” dùng để so sánh trình tự amino acid.
So sánh toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus với nhau thấy mẫu Dudu31 và Cachua89
đồng nhất 93.7 % chứng tỏ chúng là thành viên của cùng 1 loài (ngưỡng loài là 89 %
đồng nhất trên toàn bộ gen). Mẫu Cachua100 có mức đồng nhất nucleotide với mẫu Dudu31 và Cachua89 lần lượt là 86.3 và 87.7 % chứng tỏ mẫu Cacchua100 thuộc 1 loài khác.
So sánh mẫu Dudu31 và Cachua89 với 6 virus gần gũi đã công bố sẵn có trên GenBank thấy 2 mẫu này có mức đồng nhất rất cao trên toàn bộ bộ gien (lần lượt 95.9 và 93 %) với cùng một virus ToLCHV (isolate HaNHK8, FN434083) phân lập từ cà chua tại
đảo Hải Nam (Trung Quốc) mới được công bố gần đây (Zhang và cộng sự, 2010). Mức
độ đồng nhất cao này vượt xa ngưỡng phân biệt loài (89 %) chứng tỏ 2 mẫu virus Dudu31 và Cachua89 là thành viên của loài Tomato leaf curl Hainan virus. Với các virus còn lại, 2 virus này có mức đồng nhất trình tự trên toàn bộ bộ gen <87 %.
So sánh trình tự gen CP thấy Dudu31 và Cachua89 có mức đồng nhất nucleotide và mức tương đồng amino acid rất cao với với các virus khác, cao nhất với ToLCH- HaNHK8 (95.3 – 98.4 % ở mức nucleotide và 96.5 – 97.3 ở mức amino acid). Thậm chí, khi so sánh với 4 virus thuộc các loài khác là ToLCVV, AGLCV, TYLCVNV và PaLCuCNV thì các giá trịđồng nhất/tương đồng của gen CP của 2 mẫu virus cũng rất cao (đều > 90 % ở cả 2 mức nucleotide và amino acid, Bảng 4.6).
So sánh trình tự gen Rep cho thấy Dudu31 và Cachua 89 có mứa đồng nhất/tương
đồng cao với ToLCH-HaNHK8 (91.2-96.6 % ở mức nucleotide và 92.0 – 97.8 % ở mức amino acid). Tuy nhiên, khi so với các virus khác không cùng loài thì các giá trị so sánh nhìn chung <90 % ở cả 2 mức.
So sánh trình tự IR thấy cả 2 mẫu Dudu31 và Cachua 89 có mức đồng nhất với các virus khác thấp hơn nhiều. Ngoại trừ Dudu31 có mức đồng nhất IR bằng 91.8 % với ToLCH-HaNHK8 thì tất cả các giá trị còn lại của cả 2 virus đều <83.3 % khi so với các virus khác
Đối với mẫu Cachua100, quyết định vị trí phân loại của mẫu này là không dễ vì nó có mức đồng nhất nucleotide trên toàn bộ bộ gen gần xấp xỉ ngưỡng 89 % (87.7 % với mẫu Cachua89 và 87.6 % với mẫu ToLCHV-HaNHK8 và 87 % với PaLCuCNV-G43).
So sánh gen CP thấy mẫu Cachua100 cũng có mức đồng nhất/ tương đồng rất cao với nhiều virus GenBank. Ngoại trừ đối với TYLCVNV thì CP của Cachua100 đồng nhất/tương đồng > 90 % so với các virus còn lại (Bảng 4.6). Đáng chú ý, Cachua100 có mức đồng nhất/tương đồng CP cực kỳ cao với AGLCV(G52) (lần lượt 97.4 % và 99.2 %, Bảng 4.6), trong khi chỉ có mức đồng nhất 84.9 % trên cả bộ gen. Kết quả này gợi ý đã có một sự kiện tái tổ hợp ở gen CP liên quan đến 2 virus.
So sánh gen Rep thấy Cachua100 có mức đồng nhất/tương đồng cao nhất với Cachua89 (89.6 và 92 %), ToLCHV-HaNHK8 (90.4 và 92.2 %), và TYLCTHV (89.4
và 92 %). Đáng chú ý là mức đồng nhất trên toàn bộ bộ gen giữa Cachua100 và TYLCTHV khá thấp, chỉ 80 %. Sự không tương xứng này gợi ý có tái tổ hợp liên quan
đến 2 virus.
So sánh trình tự IR thấy mức đồng nhất của Cachua100 cũng thấp so với các virus khác. Ngoại trừđối vớiPaLCuCNV(G43) có mức đồng nhất IR bằng 92 % thì đối với các virus khác, giá trị này của Cachua100 chỉ tối đa 76.5 % (với TYLTHV).).
Nhìn chung so sánh các vùng gen thấy 1 xu thế chung là vùng IR có mức độ đồng nhất thấp hơn nhiều so với 2 vùng mã hóa CP và Rep thậm chí của các loài khác nhau.
Điều này phản ánh một thực tế là CP và Rep là các protein đa chức năng, chịu trách nhiệm cho các chức năng sinh học quan trọng của begomovirus như tái sinh, vận chuyển, lắp ráp virion, tương tác với protein ký chủ, lan truyền qua vector. Hậu quả là các đột biến có ý nghĩa (làm thay đổi trình tự amino acid) trên 2 gen này phần lớn là các đột biến gây chết, làm mất ưu thế thích nghi của virus. Nói cách khác đây là 2 gen của begomovirus chịu áp lực chọn lọc rất cao (Rojas và cộng sự, 2005). Trái lại, ở vùng IR, ngoài đoạn chứa ori (chiếm khoảng 40 % kích thước) cần cho chức năng tái sinh của virus thì các
vùng còn lại dường như chịu áp lực chọn lọc thấp. Đặc điểm “mềm dẻo” này của vùng IR làm tăng khả năng thích nghi của begomovirus vì nhóm virus này có 2 kiểu tái sinh: kiểu 1 là theo cơ chế vòng lăn truyền thống (RCR, rolling circular replication) và kiểu 2 mới
được chứng minh gần đây (Alberter và cộng sự, 2005; Jeske và cộng sự, 2001; Preiss and Jeske, 2003) là theo cơ chế phụ thuộc tái tổ hợp (RDR, recombination dependent replication). Nhiều bằng chứng cho thấy các vùng nằm 2 đầu của IR là các điểm nóng “hot pot” cho quá trình tái sinh theo cơ chế phụ thuộc tái tổ hợp xảy ra và các đột biến ở 2
đầu vùng IR cho phép các virus khác nhau có thể dễ dàng tái tổ hợp nếu chúng cùng nhiễm trong tế bào (Rojas và cộng sự, 2005).
4.2.3.3. So sánh iteron và IRD của 3 virus với các begomovirus đã công bố
Nhưđã trình bày ở phần 4.2.2.1 và 4.2.2.2, vùng ori (nằm trong vùng liên gen IR) chứa các chuỗi lặp iteron mà trình tự, số lượng, cách xắp xếp và vị trí tương đối với nhau của chúng nhìn chung đặc hiệu cho mỗi begomovirus và tương ứng với trình tự chuỗi IRD ở phần đầu amin của protein Rep (Arguello-Astorga, 1994; Argüello-Astorga và Ruiz- Medrano, 2001).
Vì mối quan hệ iteron/IRD phản ánh tính đặc hiệu loài trong quá trình tái sinh virus – một trong các chỉ tiêu phân loại của begomovirus, đặc biệt khi các virus có mức
độ đồng nhất nucleotide gần ngưỡng phân chia loài nên chúng tôi đã so sánh 2 motif này của 3 mẫu Dudu31, Cachua89, Cachua100 và một số virus có quan hệ gần gũi. Vùng ori chứa các chuỗi iteron và chuỗi IRD tương ứng của các virus trong phân tích được trình bày ở Bảng 4.7.
So sánh cho thấy mẫu Dudu31 và Cachua89, mặc dù được xem là cùng loài với ToLCHV dựa trên mức độ đồng nhất toàn bộ bộ gen, nhưng có đặc điểm iteron và IRD khác hẳn nhau. Mẫu Dudu31 có trình tự đoạn chứa iteron đồng nhất 100 % với đoạn tương ứng của ToLCHV. Hậu quả là cả 2 virus này có trình tự iteron (GGTGT), số lượng iteron (2), cách xắp xếp, vị trí iteron và trình tự IRD (MPPPKKFLIN) đồng nhất (Bảng 4.7). Trái lại, mẫu Cachua89, mặc dù có trình tự iteron (GGTGT) giống như của Dudu31
và ToLCHV, lại có 3 iteron phía đầu 5’ và 1 iteron đảo phía đầu 3’ của hộp TATA. Trình tự IRD của Cachua89 cũng sai khác tới 3 amno acid (MAPPNKFRIN) so với trình tự IRD của Dudu31 và ToLCHV.
Như trình bày ở Bảng 4.7, đặc điểm iteron/IRD của Cachua89 gần như đồng nhất 100 % với đặc điểm tương ứng của 2 virus thuộc 2 loài khác là ToLCVV và TYLCTHV.
Đối với mẫu Cachua100, đặc điểm iteron/IRD của virus này đồng nhất 100 % với của PaLCuCNV. Hai virus này có đặc điểm iteron/IRD giống như của nhóm Cachua89, ToLCVV và TYLCTHV ở trên, ngoại trừ rằng chúng chỉ có 2 iteron.
Argüello-Astorga và Ruiz-Medrano (2001) đã chia quan hệ iteron/IRD của các geminivirus thành 7 nhóm. Trong 7 nhóm này, nhóm iv có 2 nhóm phụ iv-3 với quan hệ
iteron/IRD là GG(T/G)GT / PXXF(K/R)L*N và nhóm phụ iv-5 là GGGT(C/A) / K(K/R)FL*L*N (trong đó X là bất kỳ amino acid còn L* là I, L hay V). Đối chiếu có thể
thấy Dudu31 và ToLCHV thuộc nhóm phụ iv-5 còn Cahua89, ToLCVV, TYLCTHV, Cachua100 và PaLCuCNV thuộc nhóm phụ iv-3.
Bảng 4.7: So sánh iteron và IRD của 3 virus Dudu31, Cachua89 và Cachua100 với một số
begomovirus
Virus Đoạn chứa iteron của ori IRD
Dudu31 ATCGGGTCCTCTCAAACTTAGCTATGCAATCGGGGAATGGGTCCTTATTTATATGTGAGGACCTAA MPPPKKFLIN
ToLCHV-FN434083 ATCGGGTCCTCTCAAACTTAGCTATGCAATCGGGGAATGGGTCCTTATTTATATGTGAGGACCTAA MPPPKKFLIN
Cachua89 ATCGGTGTCTCTCAAACTTGGCTATGCAATTGGTGTCTGGTGTCTTATTTATATGTGGACACCAA MAPPNKFRIN
ToLCVV-AF264063 ATCGGTGTCTCTTAAACTTGGCTATGCAATTGGTGTCTGGTGTCTTATTTATATGTGGACACCAA MAPPNKFRIN
TYLCTHVAY514630 ATCGGTGTCTCTCAAACTTGGCTATGCAATCGGTGTCTGGTGTCTTATTTATACCTAGACACCAA
MAPPNKFRIN
Cachua100 ATCGGTGTCTCTCAAACTTGGCTATGCAATTGGTGTCTGGGGTCTTATTTATATGTGGACACCAA MAPPNKFRIN PaLCuCNV-AJ876548 ATCGGTGTCTCTCAAACTTGGCTATGCAATTGGTGTCTGGGGTCTTATTTATATGTGGACACCAA MAPPNKFRIN
AGLCV-AJ851005 ATCGGTACTCAGCAACCTTGGCTATGCAATCGGTGATTGGTACTCAATATATAGTGAGTACCAA MAPPKRFQIY
4.2.3.4. Phân tích phả hệ
Để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa 3 mẫu virus trong nghiên cứu này và các begomovirrus khác, chúng tôi tiến hành xây dựng phả hệ dựa trên toàn bộ bộ gen (của các begomovirus có bộ gen đơn và DNA-A của các virus có bộ gen kép).
Tổng số mẫu GenBank dùng trong phân tích là 40 mẫu virus đại diện cho 31 loài thuộc chi Begomovirus. Các virus được chọn để phân tích có mức tương đồng cao với 3 mẫu virus trong tìm kiếm Blast, đại diện cho khu vực địa lý (lân cận Việt Nam, châu Á, châu Phi, và Mỹ (Tân Thế Giới)). Danh tính của các virus này được trình bày ở Bảng 4.8. Trong số này, chỉ có 1 đại diện cho các begomovirus nhóm Tân Thế Giới là TGMV còn tất cả các virus còn lại đều thuộc nhóm Cựu Thế Giới, trong đó 19 virus phân lập từ Việt Nam.
Trước khi xây dựng quan hệ phả hệ, các virus được căn trình tự đa chuỗi bằng phần mềm ClustalX. Khoảng cách di truyền giữa các trình tự virus được xác định dựa trên mô hình thay thế Kimura 2-Parameter (phần mềm MEGA 4.0). Cây phả hệ được xây dựng bằng phương pháp Neighbor-Joining và độ tin cậy của các mối quan hệ phả hệđược tính toán bằng kỹ thuật “boostrap” với 1000 lặp. Cây phả hệđược trình bày ở Hình 4.11.
Như trình bày trên Hình 4.11, hai mẫu virus Dudu31 và Cachua89 trong nghiên cứu của chúng tôi, cùng với 2 mẫu ToLCHV-HaNHK7 và ToLCHV-HaNHK7 từ Trung Quốc, đã hình thành 1 cụm loài (ToLCHV) rõ rệt với giá trị thống kê bootrap tới 100%. Cụm phả hệ này phản ánh mức đồng nhất trình tự nucleotide rất cao giữa chúng (>93 %) và do đó khẳng định rằng chúng đều là các thành viên của cùng một loài. Về quan hệ tiến hóa, có thể thấy trong cụm loài này, mẫu Cachua 89 có vị trí ở gốc của cụm và do đó, mẫu này có thể xem là cổ hơn 3 mẫu còn lại. Mặc dù 2 mẫu ToLCHV-HaNHK7 và ToLCHV-HaNHK7 được phân lập từ Trung Quốc nhưng địa điểm lại là ở đảo Hải Nam – rất gần với đồng bằng Bắc Bộ của Việt Nam. Vì các begomovirus không truyền qua hạt giống, trong khi đó cả cây cà chua và đu đủ đều được gieo/trồng từ hạt nên sự xuất hiện của virus ToLCHV tại 2 khu vực chắc chắn liên quan đến sự di truyển của vector bọ phấn, có lẽ nhờ gió.
Bảng 4.8. Các virus sẵn có trên GenBank dùng trong phân tích phả hệ
Stt Genbank Mã Tên virus Viết tắt Nguồn gốc
1 DQ641695 Mimosa yellow leaf curl virus MiYLCV Việt Nam
2 DQ641694 Spilanthes yellow vein virus SpYVV Việt Nam
3 DQ641703 Alternanthera yellow vein virus[Zin] AlYVV-Zin Việt Nam
4 DQ641704 Alternanthera yellow vein virus[Ecl] AlYVV-Ecl Việt Nam
5 DQ641698 Erectites yellow mosaic virus ErYMV Việt Nam
6 DQ641690 Kudzu mosaic virus KuMV Việt Nam
7 DQ641688 Corchorus golden mosaic virus CoGMV Việt Nam
8 DQ641701 Lindernia anagallis yellow vein virus LaYVV Việt Nam
9 DQ641692 Clerodendrum golden mosaic virus ClGMV Việt Nam
10 DQ641708 Ludwigia yellow vein virus LuYVV Việt Nam
11 DQ641699 Ludwigia yellow vein Vietnam virus LuYVVNV Việt Nam
12 AF126802 African cassava mosaic virus ACMV Uganda
13 AJ002459 Cotton leaf curl Multan virus CLCuMV Pakistan
14 AF126806 East African cassava mosaic virus EACMV Uganda
15 AJ314739 Indian cassava mosaic virus ICMV Ấn Độ
16 AF509739 Loofa yellow mosaic virus LYMV Việt Nam
17 AY271893 Mungbean yellow mosaic India virus MYMIV Ấn Độ
18 AF155806 South African cassava mosaic virus SACMV Nam Phi
19 DQ641696 Sida yellow vein Vietnam virus SiYVVNV Việt Nam
20 AJ132575 Mungbean yellow mosaic virus MYMV Ấn Độ
21 DQ641700 Papaya leaf curl China virus [VN] PaLCuCNV-VN Việt Nam
22 AJ558125 Papaya leaf curl China virus [G10] PaLCuCNV-G10 Trung Quốc
23 AJ876548 Papaya leaf curl China virus [G43] PaLCuCNV-G43 Trung Quốc
24 FN297834 Papaya leaf curl China virus [GX4] PaLCuCNV-GX4 Trung Quốc
25 AJ811914 Papaya leaf curl China virus [G4] PaLCuCNV-G4 Trung Quốc
26 AJ558117 Papaya leaf curl China virus [G30] PaLCuCNV-G30 Trung Quốc
27 S53251 Tomato leaf curl virus ToLCV Australia
28 AJ566744 Tobacco leaf curl Yunnan virus TbLCYNV Trung Quốc
29 FN256261 Tomato leaf curl Hainan virus [HaNHK7] ToLCHV-HaNHK7 Trung Quốc 30 FN434083 Tomato leaf curl Hainan virus [HaNHK8] ToLCHV-HaNHK8 Trung Quốc
31 AF195782 Tomato leaf curl Laos virus ToLCLV Lào
32 AF264063 Tomato leaf curl Vietnam virus [Han] ToLCVV-Han Việt Nam
33 DQ641705 Tomato leaf curl Vietnam virus [HUA] ToLCVV-HUA Việt Nam
34 DQ641697 Tomato yellow leaf curl Vietnam virus TYLCVNV Việt Nam
35 DQ169054 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus [VN] TYLCKaV-VN Việt Nam 36 AF511529 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus [TL] TYLCKaV-TL Thái Lan
37 AY514630 Tomato yellow leaf curl Thailand virus TYLCTHV Thái Lan
38 EU189150 Tomato yellow leaf curl Vietnam virus [DX1] TYLCVNV-DX1 Việt Nam
39 K02029 Tomato golden mosaic virus TGMV NewWorld
Hình 4.11: Cây phả hệ dựa trên toàn bộ bộ gen của begomovirus. Giá trị bootrap (%) với 1000 lần lặp lại được chỉ rõ ở gốc các nhánh. Thanh bar thể hiện khoảng cách di truyền.
PaLCuCNV-G30 PaLCuCNV-G4 PaLCuCNV-VN PaLCuCNV-G43 PaLCuCNV-G10 PaLCuCNV-GX4 Cachua100 Cachua89 Dudu31 ToLCHV-HaNHK7 ToLCHV-HaNHK8 ToLCVV-Hua ToLCVV-Han TYLCVNV-DX1 ErYMV TYLCTHV TbLCYNV-Y161 Sida-SiYVVNV ToLCLV MiYLCV TYLCVNV ALCuV- ToLCV LYMV CLCuMV-Okra ICMV-DNA-A ACMV SACMV EACMV LaYVV SpYVV LuYVV LuYVVNV AlYVV-Zin AlYVV-Ecl ClGMV TYLCKaV-TL TYLCKaV-VN KuMV MYMV MYMIV CoGMV TGMV 100 100 100 100 100 100 100 52 100 100 100