2. Đặc điểm của chi Begomovirus
4.2.2.2. Phân tích protein Rep của 3 mẫu virus
Protein Rep (Replication associated protein) là một protein lớn nhất của begomovirus và là một protein đa chức năng, trong đó các chức năng quan trọng nhất đều liên quan đến quá trình tái bản.
Nhận biết và liên kết DNA. Để khởi đầu quá trình tái bản, protein Rep cần phải nhận biết và liên kết với vùng ori. Tính đặc hiệu của Rep trong quá trình trình nhận biết và liên kết đã được chứng minh liên quan tới các chuỗi iteron như trình bày ở phần 4.2.2.1 và đầu N của Rep. Đầu N của protein Rep chứa một chuỗi X-nX-2X-1FX1X2X3
(với X-n là aa đầu tiên của protein còn F là aa bất biến) gọi là chuỗi nhận biết iteron IRD (Interon-Related Domain) (Argüello-Astorga & Ruiz-Medrano, 2001).
Phân tích chuỗi IRD của cả 3 mẫu virus thấy có sự khác nhau rõ rệt. Chuỗi IRD của Dudu31 là MPPPKKFLIN còn của 2 mẫu Cachua89 và Cachua100 đều giống nhau với trình tự là MAPPNKFRIN (Hình 4.9.C). Đối chiếu thấy trình tự của các chuỗi IRD này phù hợp với trình tự của các chuỗi iteron và tương ứng với phân loại trình tự
IRD/iteron của Argüello-Astorga & Ruiz-Medrano (2001).
Cắt và nối DNA. Protein Rep không phải là một polymerase nhưng có hoạt tính endonuclease và ligase và đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình tái bản bộ gen begomovirus. Sau khi liên kết vào vùng ori, Rep sẽ cắt giữa nucleotides số 7 và 8 trên chuỗi bất biến (TAATATT7OH-PA8C) để khởi đầu quá trình tổng hợp liên tục sợi virus theo cơ chế vòng lăn. Sợi virus hình thành sẽ được cắt và nối lại để tạo bộ gen virus hoàn chỉnh. Vùng liên quan đến chức năng này là phần đầu N (khoảng 1/3 – 1/2 chiều dài). Ba motif chức năng bảo thủ cao ở vùng này là motif I (FLTY), motif II (HLH) và motif III (DVKAYMDKD). Trong 3 motif này, motif I và II là bất biến còn motif III chứa gốc Y bất biến cần cho cả hoạt tính cắt và nối (Laufs và cộng sự, 1995; Orozco và cộng sự, 1997) (Hình 4.9. A, B).
Hình 4.9. (A) Sơđồ các vùng chức năng của begomovirus (Hanley-Bowdoin và cộng sự, 1999). (B) Bốn motif liên quan đến hoạt tính cắt – nối DNA và liên kết ATP của protein Rep của begomovirus (Laufs và cộng sự, 1995). (C) là protein Rep của 3 virus Dudu31, Cachua89 và Cachua100 với các chuỗi chức năng được đánh dấu mầu và các gốc aa bất biến được đóng hộp.
Như trình bày ở Hình 4.9.C, phần đầu N của protein Rep của 3 virus đều chứa 3 motif I, II và III giống như của các begomovirus khác.
A B
IRD Motif I Motif II
Dudu31 MPPPKKFLINAKNYFLTYPHCSLSKEEALSQLLALTTPTNKLFIRICRELHEDGSPHLHV 60 Cachua89 MAPPNKFRINAKKYFLTYPHCSLTKEEALSQLKNLETPVNKLFIRICREFHEDGTPHLHV 60 Cachua100 MAPPNKFRINAKNYFLTYPHCSLTKEEALSQIKALETPTNKLFIRICRELHEDGSPHLHV 60 Motif III Dudu31 LIQFEGKFKCQNNRFFDLVSPTRSAHFHPNIQSAKSSTDVKAYMDKDGGVIDHGVFQIDG 120 Cachua89 LIQFEGKFQCKNQRFFDLTSPSRSAHFHPNIQAAKSSTDVKSYMDKDGDVLDHGLFQIDG 120 Cachua100 LIQFEGKFQCRNQRFFDLISQTRSAHFHPNIQGAKSSTDVKTYMEKDGDVLDHGVFQIDG 120 α Helix 4 Dudu31 RSARGGCQSANDAYAEAINSGSKATALNILREKAPKDFVLQFHNLNSNLDRIFTPPMEVY 180 Cachua89 RSARGGCQSANDAYAEAINSGSKTSALNILREKAPKDYVLQFHNLNNNLDRIFTPPMEVY 180 Cachua100 RSARGGCQSANDAYAEAINSGSKASALNILREKAPKDFVLQFHNLNSNLDRIFTPPIEEY 180 (P-loop) Dudu31 VSPFSSSSFDRVPEELEEWAAENVVSAAARPLRPVSIVIEGDSRTGKTMWARSLGPHNYL 240 Cachua89 VSPFSSSSFDRVPEELEEWAAENVVSAAARPLRPISIVIEGDSRTGKTMWARSLGPHNYL 240 Cachua100 ISPFSSSSFDQVPEELDEWAIENVVSAAARPLRPVSIVIEGDSRTGKTMWARSLGPHNYL 240 Dudu31 CGHLDLSPKVYSNDAWYNVIDDVDPHYLKHFKEFMGAQRDWQSNTKYGKPVQIKGGIPTI 300 Cachua89 CGHLDLSPKVYNNDAWYNVIDDVDPHYLKHFKEFMGAQRDWQSNTKYGKPVQIKGGIPTI 300 Cachua100 CGHLDLSPKVYSNDAWFNVIDDVDPHYLKHFKEFMGAQRDWQSNTKYGKPVQIKGGIPTI 300 Dudu31 FLCNPGPNSSYKEFLEEEKNSALKNWAIKNAIFVTLQVALYSGSYQGATPQRRESNEETES 361 Cachua89 FLCNPGPNSSYKEFLEEEKNSALKNWAIKNAIFVTLQGALYSGSYQGATPQRQESNEETES 361 Cachua100 FLCNPGPNSSYKEFLDEEKNSALKNWAIKNAIFVTLQGTLYSGSYQGATPQRQESYEETES 361 C
Tương tác với các yếu tố ký chủ liên quan đến bộ máy tái bản. Quá trình tái bản của begomovirus xảy ra trong nhân tế bào, kể cảở các tế bào không phân chia. Do vậy, sau khi nhiễm vào tế bào, begomovirus phải khởi động bộ máy tái sinh của tế bào. Một trong các protein của tế bào ký chủ thực vật điều khiển chu kỳ tế bào là pRBR (plant retinoblastoma-related protein) - chịu trách nhiệm chuyển chu kỳ tế bào từ pha G1 sang pha S (pha tổng hợp). Protein Rep của TYLCV đã được chứng minh tương tác với pRBR thông qua 1 motif xoắn α (α helix) nằm ở phần đầu N có trình tự 11 nt KEEALQIIREKI (Argüello-Astorga và cộng sự, 2004).
Dùng phương pháp Chou-Fasman (phần mềm Protean, Lasergen), chúng tôi đã tìm
được chuỗi xoắn α tương tự nhau ở cả 3 virus là KATALNILREKA (Dudu31), KTSALNILREKA (Cachua90) và KATALNILREKA (Cachua100) trong đó gốc A (đóng hộp) là bất biến đối với nhiều begomovirus khác còn 2 gốc gạch chân là khác nhau trong 3 virus này (Hình 4.9.C).
Hoạt tính ATPase. Trong qua trình tái bản, Rep của begomovirrus cũng cần năng lượng. Ở phần đầu C của Rep có một motif tương tự motif P-loop của các protein thủy phân NTP. Desbiez và cộng sự (1995) đã chứng minh motif P-loop (GXXXXGKT230) giúp Rep của Tomato Golden mosaic virus (TGMV) liên kết và thủy phân ATP của tế bào ký chủ.
Phân tích phần đầu C của Rep đã phát hiện một chuỗi P-loop giống nhau ở cả 3 virus với trình tự GDSRTGKT và nằm ở vị trí 221-228 tính từ đầu N của Rep (Hình 4.9.C)