36 VNP574 Phấn Mễ Phú Lương Thái Nguyên Nhăn (Nhện ?) 37 VNP951 An Dương Hải Phòng Khảm, biến vàng +
3.2.2. Nhân toàn bộ bộ gene của 4m ẫu KuMV bằng RCA
Từ DNA tổng số của 4 mẫu VNP134, VNP335, VNP951 và VNP963, được chiết bằng CTAB, phản ứng RCA được thực hiện để nhân toàn bộ bộ gene của virus sử dụng kít TempliPhi (hãng Amersham) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tiếp theo, sản phẩm của phản ứng RCA được cắt bằng enzyme cắt giới hạn BamHI trong điều kiện không triệt để để tạo ra nhiều sản phẩm monomer (1 bộ gene), dimer (2 bộ gene) và multimer (nhiều bộ gene). Điều kiện của phản ứng cắt không hoàn toàn đối với mỗi sản phẩm RCA là khác nhau phụ thuộc vào nồng độ DNA trong sản phẩm RCA, số vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn, nồng độ enzyme và thời gian cắt. Dựa vào những thực nghiệm đã được tiến hành khi cắt không hoàn toàn sản phẩm RCA của các begomovirus khác tại TT BC nhiệt đới cho thấy ở hai mức nồng độ, nhiệt độ và thời gian là: (i) xử lý sản phẩm RCA với nồng độ enzyme BamHI là 0,025U/µl ủ 250C trong 15 phút, (ii) xử lý
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
sản phẩm RCA với nồng độ enzyme BamHI là 0,01U/µl ủ 370C trong 3 phút, cho ra các băng dimer nhiều và ổn định nhất.
Trong lần cắt không triệt để đầu tiên, chúng tôi tiến hành xử lý sản phẩm RCA của 4 mẫu virus với nồng độ enzyme BamHI là 0,025U/µl ủ 250C trong thời gian 15 phút nhưng chỉ có mẫu VNP335 cho băng kích thước ~5,4 kb (Hình 3.4A) và vạch băng không được rõ (ít sản phẩm). Trong lần cắt tiếp theo chúng tôi sử dụng nồng enzyme BamHI là 0,01U/µl ủ 370C trong thời gian 3 phút. Kết quả 3 mẫu VNP134, VNP951 và VNP963 cho băng ~5,4kb rất đậm (Hình 3.4B), trong khi mẫu VNP335 không cho băng sản phẩm nào.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm RCA được cắt không hoàn toàn bằng enzyme cắt giới hạn BamHI.
Ghi chú: A. Cắt không hoàn toàn sản phấm RCA của VNP335 (0,025U/µl BamHI, 250C/15 phút); B. Cắt không hoàn toàn sản phẩm RCA của VNP963 (0,01U/µl BamHI, 370C/3 phút).
3.2.3. Dòng hóa cấu trúc xâm nhiễm của 4 virus trong vi khuẩn E.coli
Tiếp theo, sản phẩm DNA tinh chiết gel agarose ~ 5,4 kb (dimer) của 4 mẫu VNP134, VNP335, VNP951 và VNP963 được nối vào vector pCAMBIA 2300 đã dephosphoryl hóa và được biến nạp vào tế bào E. coli khả biến dòng XL1 blue bằng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
phương pháp sốc nhiệt. Vi khuẩn biến nạp được cấy trải trên đĩa môi trường LB agar có bổ sung Kanamycin và Tetracylin. Sau 24 giờủ ở 370C, các đĩa nuôi cấy sẽ được kiểm tra sự hình thành khuẩn lạc.
Trong lần biến nạp đầu tiên, chúng tôi thực hiện biến nạp plasmid tái tổ hợp chứa sản phẩm nối ~5,4kb của mẫu VNP335. Tuy nhiên lần biến nạp này không thành công, không có khuẩn lạc nào hình thành trên đĩa nuôi cấy. Nối sản phẩm có kích thước lớn vào plasmid và biến nạp một plasmid tái tổ hợp có kích thước lớn (tổng kích thước plasmid và đoạn nối ~14kb) vào E.coli là rất khó và yêu cầu nồng độ DNA của sản phẩm nối là rất cao. Nồng độ sản phẩm 5,4 kb quá thấp của mẫu VNP335 có thể là nguyên nhân dẫn đến quá trình nối đạt hiệu quả thấp và biến nạp không thành công. Do băng sản phẩm dimer của phản ứng cắt RCA khá mờ, biến nạp không thành công nên chúng tôi chỉ nhân dòng sản phẩm monomer của mẫu VNP335. Kết quả biến nạp cho thấy có hơn 100 khuẩn lạc mọc, các khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc và kích thước đặc trưng cho
E.coli, chứng tỏ biến nạp đã thành công (Hình 3.5A). Tiếp theo, chúng tôi chọn 18 khuẩn lạc đơn để kiểm tra multiplex-PCR nhằm phát hiện dòng vi khuẩn có chứa bộ gene của virus. Phản ứng multiplex-PCR được thực hiện với 2 cặp mồi: (i) cặp mồi KuA- For1/KuA-Rev1 phát hiện DNA-A của KuMV, tạo băng sản phẩm với kích thước ~565 bp; (ii) cặp mồi KuB-F1/KuB-R1 phát hiện DNA-B của KuMV, tạo ra băng sản phẩm với kích thước ~267 bp. Kết quả multiplex-PCR cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn kiểm tra cho băng có kích thước ~565 bp nên các dòng vi khuẩn này chỉ có plasmid mang DNA-A của virus (Hình 3.5B).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
Hình 3.5. Kết quả nhân dòng sản phẩm monomer (~2,7kb) của mẫu VNP335.
Ghi chú: A. Kết quả biến nạp mẫu VNP335 (đoạn 2,7kb) vào vi khuẩn XL1-blue trên đĩa môi trường LB; B. Kết quả Multiplex-PCR kiểm tra 18 khuẩn lạc đơn của mẫu VNP335, băng sản phẩm phát hiện DNA-A có kích thước ~565bp và DNA-B có kích thước ~267 bp. Các giếng từ 1 – 18 lần lượt là các dòng vi khuẩn 1 – 18;ĐC(-) là H2O; M là ladder 1kb (Fermantas).
Trong lần biến nạp tiếp theo, chúng tôi tiến hành biến nạp sản phẩm dimer của hai mẫu VNP134 và VNP951. Kết quả hơn 50 khuẩn lạc hình thành trên mỗi đĩa nuôi cấy (Hình 3.6 A,B). Chúng tôi chọn 10 khuẩn lạc đơn của mỗi mẫu virus để kiểm tra multiplex-PCR. Kết quả multiplex-PCR phát hiện được: (i) 2/10 khuẩn lạc của mẫu VNP134 và 6/10 khuẩn lạc của mẫu VNP951 mang plasmid tái tổ hợp chứa DNA-A của KuMV; (ii) 6/10 khuẩn lạc của mẫu VNP134 và 3/10 khuẩn lạc của mẫu VNP951 mang plasmid tái tổ hợp chứa DNA-B của KuMV (Hình 3.6C).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
Hình 3.6. Kết quả nhân dòng sản phẩm dimer (~5,4kb) của mẫu VNP134 và VNP951.
Ghi chú: A, B lần lượt là kết quả biến nạp mẫu VNP134 và VNP951 vào vi khuẩn XL1-blue trên đĩa môi trường LB; C: Kết quả Multiplex-PCR kiểm tra 10 khuẩn lạc
đơn của VNP134 và VNP951, băng sản phẩm phát hiện DNA-A có kích thước ~565bp và DNA-B có kích thước ~267 bp. Các giếng từ 1 – 10 lần lượt là các dòng vi khuẩn 1 – 10; M là ladder 1kb (Fermantas).
Đối với mẫu VNP963, chúng tôi tiến hành biến nạp 2 lần. Lần biến nạp đầu tiên chỉ có 9 khuẩn lạc được hình thành và 9 khuẩn lạc này đều được kiểm tra multiplex-PCR (Hình 3.7C). Kết quả kiểm tra multiplex-PCR cho thấy 6/9 khuẩn lạc (clone-1, 2, 5, 6, 8 và 9) mang plasmid tái tổ hợp chứa DNA-B của KuMV, 1 khuẩn lạc dương với DNA-A (clone-3, vạch băng hơi mờ) và 1 khuẩn lạc dương với cả DNA-A và DNA-B (clone-7, kích thước bằng sản phẩm DNA-A cao hơn so với kích của mẫu đối chứng (+) (Hình 3.7C). Chúng tôi chọn các dòng vi khuẩn 8, 9, 3 và 7 nhân sinh khối trong môi trường LB lỏng. Sau đó miniprep thu plasmid tái tổ hợp (ký hiệu tương ứng với dòng vi khuẩn là VNP963-8, VNP963-9, VNP963-7 và VNP963-3) và cắt hoàn toàn plasmid tái tổ hợp bằng enzyme BamHI để kiểm tra
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
chính xác sự có mặt của virus trong plasmid tái tổ hợp. Kết quả kiểm tra cho thấy chỉ có hai dòng plasmid tái tổ hợp 8 và 9 cho hai vạch băng đúng kích thước một ~8.7kb (vector) và một ~2.7kb (virus). Hai dòng plasmid tái tổ hợp 7 và 3 cũng cho ra hai vạch băng nhưng không đúng kích thước của vector và virus (Hình 3.7D). Như vậy trong lần biến nạp thứ 1 chỉ tạo được dòng plamid tái tổ hợp mang DNA-B của virus nên chúng tôi tiến hành biến nạp lần thứ 2. Kết quả lần biến nạp này tạo ra 8 khuẩn lạc (đánh thứ tự từ 10-15) (Hình 3.7C). Kiểm tra multiplex-PCR cho thấy các dòng vi khuẩn 13, 15 và 16 chứa plasmid tái tổ hợp mang DNA-B và dòng vi khuẩn 17 mang DNA-A (Hình 3.7C).
Hình 3.7. Kết quả nhân dòng sản phẩm dimer (~5,4kb) của mẫu VNP963.
Ghi chú: A, B là kết quả 2 lần biến nạp mẫu VNP963 vào vi khuẩn XL1-blue trên
đĩa môi trường LB; C. Kết quả Multiplex-PCR kiểm tra 17 khuẩn lạc đơn của VNP963, băng sản phẩm phát hiện DNA-A có kích thước ~565bp và DNA-B có kích thước ~267 bp. Các giếng từ 1 – 17 lần lượt là các dòng vi khuẩn 1 – 17; ĐC+: đối chứng là DNA tổng số chiết từ mô lá cây nhiễm KuMV; M là ladder 1kb (Fermantas); D. kết quả điện di cắt hoàn toàn các plasmid tái tổ hợp VNP963-8, VNP963-9, VNP963-7 và VNP963-3 bằng BamHI.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
Như vậy, chúng tôi đã nhân dòng thành công dimer của cả DNA-A và DNA- B của 3 mẫu virus VNP134, VNP951 và VNP963 (Bảng 3.2). Đối với mẫu VNP335 chúng tôi cũng đã nhân dòng được monomer của DNA-A. Để chuẩn bị các plasmid tái tổ hợp cho giải trình tự, chúng tôi nhân sinh khối các dòng vi khuẩn: 7 và 8 của mẫu VNP134; 4 và 8 của VNP951; 16 và 17 của VNP963 và 1 của VNP335 nhân sinh khối trong môi trường LB lỏng (chứa 2 kháng sinh Kanamycin và Tetracylin). Sau đó plasmid tái tổ hợp được tinh chiết bằng kít AccuprepPlasmid Mini Extraction Kit (Bioneer).
Bảng 3.2. Kết quả dòng hóa 4 mẫu KuMV (VNP134, VNP335, VNP951 và VNP963) trên vector pCambia 2300.
Mẫu Dòng vi khuẩn trên đĩa petri Dòng plasmid tái tổ hợp (đã miniprep) Sản phẩm cắt bằng BamHI (kb) Multiplex-PCR Kết luận KuA- For1/Ku A-Rev1 KuB- F1/KuB- R1 VNP335 (~2,7kb)
VNP335-1 VNP335-1 Không thử + - pCambia + DNA-A
VNP335-2 đến VNP335-18
Không nuôi cấy
và miniprep Không thử + - pCambia + DNA-A
VNP134 (~5,4kb) (~5,4kb)
VNP134-1 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử - + pCambia + DNA-B VNP134-2 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử ? ? VNP134-3 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử - + pCambia + DNA-B VNP134-4 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử - + pCambia + DNA-B VNP134-5 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử ? ? VNP134-6 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử - + pCambia + DNA-B
VNP134-7 VNP134-7 Không thử + - pCambia + DNA-A
VNP134-8 VNP134-8 Không thử - + pCambia + DNA-B
VNP134-9 VNP134-9 Không thử - + pCambia + DNA-B VNP134-10 VNP134-10 Không thử + - pCambia + DNA-A
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33 Mẫu Dòng vi khuẩn trên đĩa petri Dòng plasmid tái tổ hợp (đã miniprep) Sản phẩm cắt bằng BamHI (kb) Multiplex-PCR Kết luận KuA- For1/Ku A-Rev1 KuB- F1/KuB- R1 VNP951 (~5,4kb)
VNP951-1 VNP951-1 Không thử + - pCambia + DNA-A VNP951-2 VNP951-2 Không thử + - pCambia + DNA-A VNP951-3 VNP951-3 Không thử - + pCambia + DNA-B
VNP951-4 VNP951-4 Không thử + - pCambia + DNA-A
VNP951-5 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử ? ? VNP951-6 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử + - pCambia + DNA-A VNP951-7 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử + - pCambia + DNA-A
VNP951-8 VNP951-8 Không thử - + pCambia + DNA-B
VNP951-9 VNP951-9 Không thử + - pCambia + DNA-A VNP951-10 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử - + pCambia + DNA-B
VNP963 (~5,4kb) (~5,4kb)
VNP963-1 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử - + pCambia + DNA-B VNP963-2 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử - + pCambia + DNA-B VNP963-3 VNP963-3 ? ? ?
VNP963-4 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử - + pCambia + DNA-B VNP963-5 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử - + pCambia + DNA-B VNP963-6 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử - + pCambia + DNA-B VNP963-7 VNP963-7 ? ? ?
VNP963-8 VNP963-8 ~8.7;~2.7 - + pCambia + DNA-B VNP963-9 VNP963-9 ~8.7;~2.7 - + pCambia + DNA-B VNP963-10 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử ? ? VNP963-11 Không nuôi cấy Không thử ? ?
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 Mẫu Dòng vi khuẩn trên đĩa petri Dòng plasmid tái tổ hợp (đã miniprep) Sản phẩm cắt bằng BamHI (kb) Multiplex-PCR Kết luận KuA- For1/Ku A-Rev1 KuB- F1/KuB- R1 và miniprep VNP963-12 Không nuôi cấy và miniprep Không thử ? ? VNP963-13 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử - + pCambia + DNA-B VNP963-14 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử ? ? VNP963-15 Không nuôi cấy
và miniprep Không thử - + pCambia + DNA-B
VNP963-16 VNP963-16 Không thử - + pCambia + DNA-B
VNP963-17 VNP963-17 Không thử + - pCambia + DNA-A