16 Macroptilium mosaic Puerto Rico virus MaMPRV AF449192 Puerto Rico
3.4.4. Đánh giá khả năng phát hiện KuMV của kỹ thuật LAMP đối với các mẫu DNA chiết từ cây
DNA chiết từ cây
Một trong những thí nghiệm quan trọng là phải đánh giá được tính đặc hiệu của phản ứng LAMP trên các mẫu DNA tổng số chiết từ mô lá cây. Đây là thí nghiệm quyết định xem LAMP có thể ứng dụng để phát hiện KuMV trên đồng ruộng không. Để đánh giá khả năng phát hiện KuMV của kỹ thuật LAMP đối với các mẫu DNA tổng số chiết từ cây, chúng tôi tiến hành phản ứng LAMP trên 3 mẫu cây đậu tương đã được xác định và giải trình tự là nhiễm KuMV. Đối chứng trong thí nghiệm này là 3 cây đậu tương khỏe và đối chứng nước. Các mẫu đậu tương được chiết DNA tổng số tử mô lá sử dụng phương pháp chiết bằng CTAB (Doyle, 1987).
Kết quả diện di cho thấy, phản ứng LAMP dương tính ở cả 3 mẫu cây đậu tương bệnh và âm tính ở các mẫu cây đậu tương khỏe (Hình 3.17 và Bảng 3.10). Như vậy kỹ thuật LAMP hoàn toàn có thể sử dụng để chẩn đoán bệnh KuMV hại đậu tương trên đồng ruộng.
Hình 3.17. Kết quả điện di đánh giá khả năng phát hiện KuMV của kỹ thuật LAMP với mồi LAMP Primer-REP với các mẫu DNA chiết từ cây.
Ghi chú: Từ giếng số 1-3: các mẫu cây nhiễm KuMV; 4-6: các cây khỏe; ĐC+: plasmid pCAMBIA+DNA-A KuMV; ĐC(-): H2O. M là ladder 1kb (Fermantas).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60
Bảng 3.10. Kết quả đánh giá khả năng phát hiện KuMV của kỹ thuật LAMP với mồi LAMP Primer-REP với các mẫu DNA chiết từ cây.
STT Mẫu Kiểm tra
LAMP
1 ĐC(+) (Plasmid pCAMBIA + VNP134-clone 7 (DNA-A) (KuMV) +
2 VNP134 (Cây nhiễm KuMV, mẫu lá khô) +
3 VNP 951(Cây nhiễm KuMV, mẫu lá khô) +
4 VNP 963(Cây nhiễm KuMV, mẫu lá khô) +
5 Cây đậu tương khỏe 1 (Mẫu lá tươi) -
6 Cây đậu tương khỏe 2 (Mẫu lá tươi) -
7 Cây đậu tương khỏe 3 (Mẫu lá tươi) -
8 ĐC(-) H2O -
Nhận xét và kết luận: Từ kết quả đánh giá tính đặc hiệu, độ nhạy khả năng phát hiện KuMV của bộ mồi LAMP Primer-REP ở trên cho thấy kỹ thuật LAMP hoàn toàn có khả năng ứng dụng để chẩn đoán bệnh virus KuMV. Kỹ thuật LAMP cũng cho thấy tính ưu việt hơn PCR với phản ứng diễn ra trong thời gian ngắn, độ nhạy cao. Đặc biệt nếu sử dụng thêm các chất phát hiện màu hoặc máy Loopamp Realtime Turbidimeter có thể cho kết quả phản ứng sớm hơn (Goto et al., 2009; Almasi et al., 2013). Độđặc hiệu và tốc độ của phản ứng LAMP cũng có thể được tăng lên nếu sử dụng thêm các mồi stem và loop (Nagamine et al., 2002; Gandelman et al., 2011). Tuy nhiên, trong quá trình thực hiện các phản ứng LAMP chúng tôi có bắt gặp hiện tượng phản ứng “giả dương tính”. Đây là hiện tượng có thể bắt gặp khá phổ biến do phản ứng LAMP có độ nhạy rất cao và kiểm soát không tốt nguồn nhiễm tạp. Do đó tốt nhất nên thực hiện phản ứng LAMP trong điều kiện sạch, tránh lẫn tạp DNA, các dụng cụ chuẩn bị master mix và chuẩn bị mẫu cần riêng biệt.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61