16 Macroptilium mosaic Puerto Rico virus MaMPRV AF449192 Puerto Rico
3.4.1. Thiết kế mồi LAMP chẩn đoán KuM
Phản ứng LAMP yêu cầu 4 mồi khác nhau dựa theo 6 đoạn riêng biệt trên đoạn gene quan tâm: đoạn F3c, F2c và F1c ởđầu 3' và đoạn B1, B2 và B3 ởđầu 5' (Hình 3.13). Hai cặp mồi nằm phía bên ngoài là F3 (mồi xuôi) bao gồm đoạn F3 bổ sung cho đoạn F3c và B3 (mồi ngược) bao gồm đoạn B3 bổ sung cho đoạn B3c. Hai cặp mồi nằm phía bên trong là FIP và BIP: mồi FIP (Forward Inner Primer) bao gồm đoạn F2 (ở đầu 3') bổ sung cho đoạn F2c, và đoạn giống như đoạn F1c ởđầu 5'; mồi BIP (Backward Inner Primer) bao gồm đoạn B2 (ởđầu 3’) bổ sung cho đoạn B2c và đoạn giống như B1c ởđầu 5’.
Hình 3.13. Vị trí các mồi LAMP trên vùng gene mục tiêu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54
Mồi LAMP được thiết kế dựa trên các tiêu chuẩn sau:
a) Tính duy nhất: vị trí bắt cặp của mồi là duy nhất trên toàn trình tự, điều này sẽđảm bảo cho kích thước đoạn gene cần nhân theo mong muốn.
b) Khoảng cách giữa các mồi: Khoảng cách giữa đầu 5’ của F2 và B2 khoảng 120-180bp, và khoảng cách giữa F2 và F3 cũng như giữa B2 và B3 là 0 - 20bp. Khoảng cách cho các vùng hình thành thòng lọng (Loop) (đầu 5' của F2 đến đầu 3' của F1, đầu 5' của B2 đến đầu 3' B1) là 40 - 60bp.
c) Nhiệt độ gắn mồi (Tm): Khoảng 65°C (64 - 66°C) đối với F1c và B1c, 60°C (59 - 61°C) cho F2, B2, F3, và B3.
d)Hàm lượng GC: Nằm trong khoảng 40-65%, hàm lượng GC nằm trong khoàng 50-60% thường cho ra những mồi có chất lượng tốt.
e)Hạn chế sự hình thành cấu trúc thứ cấp của mồi.
Dựa trên những tiêu chuẩn trên chúng tôi lựa chọn 2 vùng mã hóa cho gene CP và Rep của DNA-A để thiết kế mồi cho phản ứng LAMP phát hiện KuMV. Đây là hai gene lớn nhất của phân tử DNA-A của KuMV, hai vùng gene này cũng khá bảo thủ giữa các loài begomovirus. Sau đó, chúng tôi sử dụng phần mềm Primer Explorer V4 với các thông sốđiều chỉnh thích hợp để thiết kế mồi.
Kết quả phần mềm cho ra 1 bộ mồi đối với vùng gene CP và 4 bộ mồi đối với vùng gene REP (Hình 3.14). Chúng tôi chọn 1 bộ mồi cho vùng gene CP (được đặt tên là LAMP Primer-CP) và 1 bộ mồi cho vùng gene REP (được đặt tên là LAMP Primer-REP) với các thông số mồi tốt nhất để tiến hành thử nghiệm phản ứng LAMP. Trình tự của 2 bộ mồi này được trình bày ở Bảng 3.7.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55
Hình 3.14. Kết quả thiết kế mồi LAMP trên 2 vùng gene CP và Rep sử dụng phần mềm Primer Explorer V4.
Bảng 3.7. Trình tự của 2 bộ mồi LAMP Primer-CP và LAMP Primer-REP. Bộ mồi Tên mồi Trình tự mồi (5'-->3') LAMP Primer-CP F3-KuMV-CP CATTCTCAAGTCCGATATCCTCG B3-KuMV-CP CCAACATGGGAAATATCATGCCT FIP-KuMV-CP GTCGTCTTCGGGTGCCTTGGGTTACGGAACCCC GTTAGC BIP-KuMV-CP CGTCCGATGTACAGGAAGCCTCCTTACAGGGGC CCTCACA LAMP Primer- REP F3-KuMV-REP TTTGAGTGGGCTTTCCGTATT B3-KuMV-REP TGGTTGAGGGTGAGTCACG FIP-KuMV-REP CGATGACGTCGATCCGCATTATCTACGTTGCTTT GCCAGTCC BIP-KuMV-REP TGGCGCTTAGATCCAAATGGCCAAAACCATGTG GGCGAGG
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56