Điện di agarose: Sản phẩm PCR (hoặc RCA) được điện di trên gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đệm TAE và chứ a 0,5 mg/mL ethidium bromide.

Một phần của tài liệu kỹ thuật chẩn đoán và đặc trưng phân tử của kudzu mosaic virus (kumv) hại đậu tương (Trang 27)

Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm TAE ở điện thế 100 V trong 30 - 40 phút. Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chụp bằng máy ảnh số.

6.Tinh chiết gel: DNA được tinh chiết từ gel agarose dùng các kít chiết thương mại PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) hoặc AccuPrepTM thương mại PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) hoặc AccuPrepTM

Gel Purification Kit (Bioneer) hoặc High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

7.Chuẩn bị tế bào khả biến (Escherichia coli): Tế bào vi khuẩn E.coli

chủng XL1-Blue (Stratagen) được sử dụng để chuẩn bị tế bào khả biến theo phương pháp của Inoue et al. (1990). Tế bào vi khuẩn bảo quản ở - 800C được tan đông, cấy trên môi trường LB agar (không kháng sinh) và ủ qua đêm ở 370C. Ba khuẩn lạc được cấy sang 4 ml môi trường LB lỏng chứa tetracycline (12,5 µg/mL) và ủ qua đêm ở 370C. Dịch vi khuẩn (~2 ml) được cấy vào bình cấy 1 - 2 L chứa 250 mL môi trường SOB và nuôi tới OD ở A600 ~ 0.6 ở ~ 250C (200-250 rpm). Dịch vi khuẩn đươc ly tâm ở 2500 g trong 10 phút ở 40C. Tế bào vi khuẩn được rửa trong 80 mL đệm TB lạnh, ủ trên đá 10 phút và được ly tâm như trên. Tiếp theo, cặn vi khuẩn được hòa trong 20 mL đệm TB lạnh. Bổ sung DMSO tới nồng độ 7 %. Dịch tế bào vi khuẩn khả biến được phân phối vào tube 1,5 mL và bảo quản ở -800C.

8.Dòng hóa bộ gene virus trong tế bào vi khuẩn E.coli: Bộ gene hoàn chỉnh (gồm DNA-A và DNA-B) của mẫu KuMV từ đậu tương sẽ được nhân bằng

Một phần của tài liệu kỹ thuật chẩn đoán và đặc trưng phân tử của kudzu mosaic virus (kumv) hại đậu tương (Trang 27)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(92 trang)