36 VNP574 Phấn Mễ Phú Lương Thái Nguyên Nhăn (Nhện ?) 37 VNP951 An Dương Hải Phòng Khảm, biến vàng +
3.2.1. Chuẩn bị vector pCAMBIA
Vector nhị nguyên được sửđể thiết kế cấu trúc xâm nhiễm là vector pCAMBIA 2300 có nguồn gốc từ vector pPZP (http://www.cambia.org/daisy/bios/585.html). Vector nhị nguyên này có các đặc điểm thích hợp cho thiết kế cấu trúc xâm nhiễm như: (i) số lượng bản copy trong E.coli cao, (ii) đơn vị sao chép pVS1 bền vững trong Agrobacterium, (iii) kích thước nhỏ (~8,7kb), (iv) chứa MSC (multiple cloning sites).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
Hình 3.2. Sơ đồ vector pCAMBIA 2300.
(http://www.cambia.org/daisy/cambia/585)
Để chuẩn bị plasmid pCAMBIA 2300 cho biến nạp, dòng vi khuẩn E.coli có chứa plasmid pCAMBIA 2300 (bảo quản ở -800C) được cấy ba chiều trên đĩa môi trường LB agar có bổ sung Kanamycin và Tetracylin để chọn lọc các khuẩn lạc đơn. Sau 24 giờ ủở 370C, trên đĩa môi trường LB agar có các khuẩn lạc đơn hình thành với những đặc điểm điển hình của E.coli (các khuẩn lạc màu trắng sữa, bề mặt có rãnh nhỏ, đổ dọc từđỉnh xuống). Những khuẩn lạc đơn này được nuôi cấy lắc trong môi trường LB lỏng chứa kháng sinh Kanamycin và Tetracylin ở 370C và vận tốc ~220 vòng/phút. Plasmid được tinh chiết bằng kít Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer). Các plasmid pCAMBIA 2300 được ủ với enzyme BamHI trong điều kiện chuẩn (cắt hoàn toàn) để mở vòng. Tiếp theo, plasmid được tinh chiết bằng kít GenJet PCR purification kit (Fermantas) và dephosphoryl hóa bằng Alkaline phosphatase. Kết thúc phản ứng dephosphoryl hóa, plasmid được tinh chiết lại bằng kít GenJet PCR purification kit và bảo quản ở -200C.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
Hình 3.3. Kết quả chuẩn bị vector pCAMBIA 2300 cho biến nạp.
Ghi chú: A. Phục hồi dòng vi khuẩn E.coli có chứa plasmid pCAMBIA 2300; B. Kiểm tra plasmid pCAMBIA 2300 chưa mở vòng và sản phẩm mở vòng bằng BamHI sau khi tinh chiết. Giếng 1: pCAMBIA 2300 vòng; Giếng 2: pCAMBIA 2300 mở vòng bằng BamHI; M là ladder 1kb (Fermantas).