ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ LĂNG CHẤM (Hemibagrus guttatus Lacepède, 1803) SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ LĂNG CHẤM (Hemibagrus guttatus Lacepède, 1803) SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE. Cá lăng chấm là loại cá có giá trị kinh tế. Ứng dụng công nghệ sinh học trong thủy sản

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ LĂNG CHẤM (Hemibagrus guttatus Lacepède, 1803) SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE HÀ NỘI, 12/2016 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ LĂNG CHẤM (Hemibagrus guttatus Lacepède, 1803) SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE Sinh viên : Bùi Hà My Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Trần Thị Thúy Hà Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản TS Nguyễn Hữu Đức Học viện Nông nghiệp Việt Nam HÀ NỘI, 12/2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn kết luận văn trực tiếp thực Các số liệu kết công bố luận văn hoàn toàn trung thực, xác chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Bùi Hà My LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Thúy Hà, Giám đốc Trung tâm Công nghệ sinh học Thủy sản, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I TS Nguyễn Hữu Đức – Trưởng môn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Cảm ơn Thầy Cô hướng dẫn, dạy dỗ, bảo tận tình truyền đạt kinh nghiệm quí báu chuyên môn lẫn sống, suốt trình em thực Khóa luận Tốt nghiệp Tiếp theo, em gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn nhân viên Trung tâm Công nghệ sinh học Thủy sản, Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1, đặc biệt CN Nguyễn Thị Hương tận tình bảo, dạy dỗ giúp đỡ em không công việc mà sống Đồng thời, em xin cảm ơn toàn thể Thầy Cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, truyền dạy kiến thức quí báu suốt thời gian em học tập trường Cuối cùng, từ tận đáy lòng, em gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành tới gia đình, bạn bè – người thân yêu bên cạnh động viên ủng hộ em suốt trình học tập Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Bùi Hà My năm 2016 MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Việt Nam với hệ thống sông ngòi dày đặc có điều kiện vô thuận lợi cho phát triển khai thác nuôi trồng thủy sản Hơn nữa, chất lượng đời sống người dân ngày cải thiện dẫn đến tăng nhu cầu tiêu thụ sản phẩm thủy hải sản chất lượng Vì vậy, việc lựa chọn đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao để khai thác nuôi trồng ngày trở nên quan trọng người sản xuất Cá Lăng Chấm Hemibagrus gutattus (Lacepède, 1803) loài cá hoang dã có giá trị kinh tế cao hệ thống sông Hồng Thịt cá thơm, ngon, xương dăm coi đặc sản nước hàng đầu miền Bắc Loài cá chiếm tỉ lệ lớn sản lượng cá đánh bắt tự nhiên số tỉnh miền núi năm 1960 – 1970 (Mai Đình Yên, 1983) Tuy nhiên, năm gần đây, khai thác ạt mức người, sản lượng cá Lăng Chấm suy giảm đáng kể Hiện nay, cá Lăng Chấm xếp vào Sách đỏ Việt Nam mức nguy cấp bậc V (Bộ Khoa học – Công nghệ môi trường, 1992) Đối diện với thực trạng cần bảo vệ gấp cá Lăng Chấm thực tế nhu cầu thị trường với sản phẩm thủy sản chất lượng cao, việc nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá Lăng Chấm trở thành biện pháp hữu hiệu để bảo tồn đồng thời phát huy giá trị kinh tế loài Lựa chọn cá giống tốt yếu tố quan trọng định thành công việc nghiên cứu sinh sản nhân tạo Xét mặt di truyền, giao phối cận huyết nguyên nhân gây số tác động tiêu cực tăng tỉ lệ đồng hợp tử dẫn đến hội biểu gene lặn gây chết gia tăng, suy thoái cận huyết giảm biến dị di truyền (Falconer, 1989) Tất biểu dẫn đến sụt giảm chất lượng giống (Mair, 1997) Vì vậy, tiến hành đánh giá đa dạng di truyền cho cá Lăng Chấm góp phần cung cấp nguồn thông tin hữu hiệu mặt di truyền cho công tác chọn giống loài cá Theo Ferguson (1994), biến dị di truyền nguồn gốc sở đem lại thành công lớn cho chương trình nuôi chọn giống Trong đó, thị phân tử DNA cho phép theo dõi khai thác biến dị di truyền toàn bộ gene (Liu Cordes 2004) Vì vậy, kỹ thuật sử dụng thị phân tử DNA (DNA-based markes) công cụ hữu ích để đánh giá đa dạng di truyền đối tượng thủy sản nói chung cá Lăng Chấm nói riêng Là thị sử dụng phổ biến nay, thị microsatellite cho thấy hiệu cao việc nghiên cứu cấu trúc di truyền sinh vật, trình tiến hóa, cung cấp thông tin làm rõ độ vật liệu lai tạo giống Do đó, nhiều nghiên cứu sử dụng microsatellite để đánh giá đa dạng di truyền đối tượng thủy sản công bố nước giới Tại Việt Nam nay, nghiên cứu cá Lăng Chấm nghiên cứu sinh sản nhân tạo hay nuôi thương phẩm mà chưa có công trình đánh giá đa dạng di truyền loài thủy sản Xuất phát từ tình hình thực tế đó, tiến hành nghiên cứu “Đánh giá đa dạng di truyền cá Lăng Chấm (Hemibagrus guttatus Lacepède, 1803) thị phân tử Microsatellite” 1.2 Mục đích • Đánh giá đa dạng di truyền quần đàn cá Lăng Chấm • Xác định mối quan hệ di truyền quần đàn cá Lăng Chấm, góp phần phục vụ công tác bảo tồn lai tạo loài cá quý 1.3 Nội dung nghiên cứu • Tách chiết DNA tổng số quần đàn cá Lăng Chấm • Lựa chọn tối ưu cặp thị microsatellite cho cá Lăng Chấm • Tiến hành PCR đoạn gene cần quan tâm • Điện di hệ thống GeXP • Đọc kết phân tích số liệu sau thí nghiệm để xác định mối quan hệ di truyền quần đàn cá Lăng Chấm PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Cá Lăng Chấm 2.1.1 Phân loại học Hình 2.1 Cá Lăng chấm Hemibagrus guttatus (Lacepède, 1803) (Nguồn: https://sokhcn.vinhphuc.gov.vn/) Cá Lăng Chấm Hemibagrus guttatus (Lacepède, 1803) thuộc: Bộ cá Hồng nhung Characiformes Họ cá Lăng Bagridae Giống cá Lăng Hemibagrus Loài Cá Lăng Chấm Hemibagrus guttatus (Lacépède, 1803) Tên địa phương: cá Lăng cá Quất 2.1.2 Phân bố Trên giới nay, cá Lăng Chấm phân bố tập trung Trung Quốc, Thái Lan Việt Nam Campuchia (Chu xin lua, 1990; Robert Tyson, 1995; Mai Đình Yên 1978) Ở Việt Nam, cá Lăng Chấm phân bố chủ yếu sông lớn tỉnh phía Bắc hệ thống sông Hồng, sông Đà, sông Thao, hạ lưu sông Hồng, sông Chảy, Họ Cá Lăng Bagridae Việt Nam có giống thuộc18 loài giống Hemibagrus có loài (Nguyễn Văn Hảo, 1993 ; Mai Đình Yên, 1978 ; Mai Đình Yên, 1983), cá Lăng Chấm H.guttatus loài có kích thước lớn Theo Mai Đình Yên, 1963, cá Lăng cỡ lớn tối đa tới 40kg 10 Bảng 2.1 Mối tương quan kích thước đoạn DNA phân tích nồng độ gel Nồng độ Kích thước agarose (%) gel 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2,0 DNA mạch thẳng (kb) 60 – 20 – 10 – 0,8 – 0,5 – 0,4 – 0,2 – 0,1 (http://123doc.org/document/) Qua việc chạy điện di phân tách DNA quan sát cách định tính nồng độ độ nguyên vẹn DNA Khi tách chiết DNA tổng số, yêu cầu băng điện di có kích thước lớn, biểu thị DNA mẫu bị đứt gãy 2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.5.1 Nguyên lý Kĩ thuật PCR hay gọi phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase Kary Mullis phát minh vào năm 1983 Một cách ngắn gọn, PCR định nghĩa kĩ thuật cho phép nhân nhanh in vitro tạo số lượng lớn đọan DNA Nguyên lý phản ứng PCR sử dụng DNA polymerase kết hợp cặp mồi đặc hiệu chu trình nhiệt hợp lý để khuếch đại đoạn gene quan tâm Đầu tiên, phân tử DNA biến tính thành sợi đơn để mồi gắn vào, sau DNA polymerase kéo dài mồi, tổng hợp mạch DNA bổ sung với mạch khuôn Sự biến tính, gắn mồi kéo dài phân tử DNA có mẫu thực lặp lặp lại suốt thời gian thực phản ứng Kết số lượng đoạn gene quan tâm tăng lên nhanh chóng kết thúc phản ứng khuếch đại (S.B Primrose, 2006) 20 Hình 2.2 Phản ứng PCR (Nguồn: http://missinglink.ucsf.edu/lm/molecularmethods/pcr.htm) 2.5.2 Thành phần phản ứng PCR Một phản ứng PCR gồm thành phần sau: DNA mạch khuôn DNA mạch khuôn sử dụng phản ứng PCR phải có độ nguyên vẹn cao đạt độ tinh định Lượng DNA khuôn thường sử dụng 20 – 100 ng thể tích phản ứng 20 – 100 μl Việc bổ sung lượng DNA khuôn ban đầu lớn thường dẫn đến việc tổng hợp sản phẩm không đặc hiệu Phản ứng PCR thường dùng để khuếch đại đoạn DNA ngắn, có chiều dài từ 200 – 2000 bp khoảng 30 – 40 chu kỳ dNTPs dNTPs nguồn nguyên liệu để xây dựng mạch DNA Nồng độ loại dNTP (ATP, GTP, TTP, CTP) hỗn hợp phản ứng thường dùng 200 mM Nếu sử dụng dNTP với nồng độ cao dẫn tới tương tác với Mg 2+ gây ảnh hưởng xấu tới phản ứng Bên cạnh đó, cân thành phần dNTP tăng tỉ lệ lỗi chép DNA polymerase Ion Mg2+ Ion Mg2+ có vai trò quan trọng phản ứng PCR Chúng hình thành phức chất dạng hòa tan với dNTP, giúp dNTP liên kết lại với Đồng thời, Mg2+ tăng cường hoạt tính trùng hợp polymerase Vì vậy, nồng độ 21 Mg2+ thấp hiệu suất phản ứng PCR giảm Tuy nhiên nồng độ cao dẫn đến tích lũy sản phẩm không đặc hiệu Nồng độ Mg2+ thường sử dụng mM, nhiên phụ thuộc vào loại enzyme, DNA mẫu dung dịch đệm sử dụng Taq polymerase Taq polymerase tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus Khả chịu nhiệt DNA polymerase sở để áp dụng chu trình nhiệt phản ứng PCR Thông thường, sử dụng – đơn vị enzyme/ 25 μl thể tích PCR Nếu nồng độ enzyme ít, không tạo đủ lượng sản phẩm cần thiết Ngược lại, nồng độ enzyme cao dẫn đến xuất sản không chuyên Hàm lượng enzyme sử dụng phụ thuộc vào DNA khuôn số chu kỳ phản ứng Hiện số hạn chế Taq polymerase (như thiếu chức sửa lỗi mạch DNA mới, ghép nhầm dNTP ) người ta phát triển số loại DNA polymerase sử dụng phản ứng PCR Tli – Pfu – polymerase recombinant Taq polymerase Mồi Mồi đoạn oligonucleotide ngắn, thường có chiều dài từ 18 – 25 nucleotide có khả bắt cặp bổ sung với DNA mạch khuôn, có chức làm mồi khởi động để DNA polymerase thực phản ứng chép Cặp mồi thiết kết cần có đủ đặc trưng sau: - Tính đặc hiệu (Specificity): đặc hiệu cho trình tự mục tiêu nhân lên, tránh gây tượng lai không đặc hiệu Nên có 45 – 60% G/C không nên chứa poly G poly C, vị trí đầu 3’ nên kết thúc G C để tránh tượng bắt cặp nhầm Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép (ví dụ CACACA) chuỗi lặp đơn (TTTT) để tránh bắt cặp nhầm - Tính ổn định (Stabililty): hình thành dạng sợi đôi bền vững với DNA khuôn Nhiệt độ nóng chảy mồi xuôi mồi ngược không nên chênh 5oC Nhiệt độ gắn mồi nên gần tiến sát tới nhiệt độ nóng chảy để có liên kết tốt mồi DNA khuôn 22 - Tính tương thích (Compatibility): mồi dùng cặp cần hoạt động điều kiện PCR Thời gian gắn mồi dao động 30 – 60 giây với nồng độ mồi sử dụng khoảng từ 100 đến 500 nM Nước Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải nước sạch, loại bỏ ion để tránh gây tạp nhiễm cho phản ứng 2.5.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR Mỗi chu kỳ nhiệt phản ứng PCR gồm có giai đoạn sau: biến tính, gắn mồi kéo dài Giai đoạn biến tính (Denaturation): hai sợi chuỗi xoắn kép duỗi xoắn tách tác động nhiệt độ cao (94 – 95oC) Giai đoạn gắn mồi (Annealing): nhiệt độ phản ứng giảm xuống (55 – 60oC), mồi gắn vào sợi DNA tương ứng theo nguyên tắc bổ sung Giai đoạn kéo dài (Extension): phản ứng trùng hợp phân tử DNA thực nhờ DNA polymerase khoảng 72oC để kéo dài mạch tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn 23 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Khóa luận tiến hành từ 8/2016 – 12/2016 Trung tâm Công nghệ sinh học Thủy sản (Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I) Khoa Công nghệ sinh học (Học viện Nông nghiệp Việt Nam) 3.2 Đối tượng nghiên cứu Cá Lăng Chấm (Hemibagrus guttatus Lacepède, 1803) 3.3 Nội dung nghiên cứu • Tách chiết DNA tổng số quần đàn cá Lăng Chấm • Lựa chọn tối ưu cặp thị microsatellite cho cá Lăng Chấm • Tiến hành PCR đoạn gene cần quan tâm • Điện di hệ thống GeXP • Đọc kết phân tích số liệu sau thí nghiệm để xác định mối quan hệ di truyền quần đàn cá Lăng Chấm 3.4 Vật liệu nghiên cứu 3.4.1 Vật liệu Mẫu vây ngực bốn quần thể cá Lăng Chấm có nguồn gốc khác thu nhận từ Tuyên Quang, Phú Thọ, Hà Giang Trung tâm Quốc gia Giống thủy sản nước Miền Bắc 3.4.2 Dụng cụ, hóa chất Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng để tiến hành thí nghiệm đề tài trình bày bảng đây: 24 STT Tên thiết bị Xuất xứ Pipette Ống eppendorf Đức Đầu côn Đức Panh, kéo Việt Nam Máy voltex Mỹ Máy khuấy từ Đức Hệ thống máy điện di Anh Hệ thống buồng chụp UV Anh Máy ly tâm lạnh 5804R Đức 10 Máy ly tâm thường Đức 11 Máy đo Nanodrop Đức 12 Cân phân tích Mỹ 13 Lò vi sóng Trung Quốc 14 Bể ổn nhiệt Đức 15 Hệ thống máy giải trình tự genBộ gen Lab GeXP Mỹ 16 Tủ hút khí độc Esco ADC-4B1 Đức 17 Tủ lạnh sâu –25 ºC Tủ lạnh 4ºC 18 Phần Lan Nhật Bản PCR tốc độ cao Eppendorf Đức Bảng 3.1 Trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm Bảng 3.2 Các dung dịch hóa chất sử dụng STT Dung dịch Solution (100 ml) Solution (Amonium axetat 7,5M) Protein K (20 mg/ml) Đệm TAE 1X (100 ml) Ethanol 70% (100 ml) Gel agarose 0,8% (70 ml) Gel agarose 2% (70ml) Thành phần H2O cất hai lần + 0,121 (g) Tris HCl 10mM + 3,72 (g) EDTA 100mM + (g) SDS 2%; pH = 8,0 56,25g Amonium axetat + 100ml H2O 0,01g Protein K + 500µl nước deion ml TAE 50X + 90 ml H2O cất hai lần 30 ml H2O cất hai lần + 70 ml Ethanol 100% 0,56 g agarose + 70 ml TAE 1X 1,4 g agarose + 70 ml TAE 1X 25 3.5 Tách chiết DNA DNA tổng số tách chiết từ mẫu vây cá theo phương pháp kết tủa muối Sambrook Russell (2001) có cải tiến Bảng 3.3 Vai trò hóa chất sử dụng trình tách chiết Hóa chất Tris - HCl Solution EDTA SDS Proteinase K Amomium axetat 7,5M Ethanol 100% Ethanol 70% Solution Nước khử ion Vai trò Tương tác với lipopolysaccharides trền bề mặt màng tế bào làm trình thẩm thấu diễn thuận lợi Kết hợp EDTA để trì pH dung dịch tách chiết Tương tác với ion Mg2+, qua ngăn chặn hoạt động DNAse Là chất tẩy rửa tích điện âm có khả loại bỏ ảnh hưởng ion dương có protein, làm protein biến tính Do đó, SDS hỗ trợ cho trình giải phóng DNA histone protein khác Là enzyme thủy phân protein, giúp phân giải loại bỏ protein khỏi mẫu tách chiết Tủa protein Tủa DNA Rửa tủa DNA Tái hòa tan DNA 3.5.1 Quy trình tách chiết DNA tổng số Mẫu vây thấm khô cồn, cắt 100mg mẫu cho vào ống eppendorf Tiếp tục cắt nhỏ mẫu, thêm vào ống ống eppendorf 1000 µl dung dịch Cell Lysis Solution (10 mM Tris, 100 mM; EDTA, 2% SDS pH 8,0); µl proteinase K (20 mg/ml) Ủ mẫu qua đêm 60oC Đem voltex mẫu sau thủy phân qua đêm Bổ sung 250 µl dung dịch CH¬¬3COONH¬¬4 7,5 M, sau để tủa 40C khoảng 60 – 75 phút Ly tâm lạnh 40C, 14000 vòng/phút 15 phút Sau thu dịch (khoảng 800-1000 µl) sang ống eppendorf Lặp lại bước Bổ sung vào dịch khoảng 1000 µl cồn 100%, giữ -20oC qua đêm Ly tâm lạnh 40C, 14000 vòng/phút 15 phút, loại dịch thu tủa 26 Rửa tủa 500 µl ethanol 70% Nếu tủa bẩn rửa tủa nhiều lần Ly tâm lạnh 40C với tốc độ 14000 vòng/phút 10 phút, loại dịch thu tủa 10 Lặp lại bước 11 Để khô tủa DNA sau hòa tan tủa 50 – 200 µl H2O, bảo quản -200C để sử dụng thí nghiệm 12 Kiểm tra DNA tổng số điện di gel agarose 1% (1g agarose + 100ml dung dịch đệm TAE 1X) 3.5.2 Kiểm tra nồng độ chất lượng mẫu DNA Sử dụng máy Nanodrop 2000C để kiểm tra nồng độ độ tinh DNA tách chiết Lượng DNA lần đo μl DNA coi protein RNA có số sau: OD260/280 = 1,8 - 2; OD260/230 = 1,8 – 2,2 Tiến hành điện di DNA gel agarose 0,8% dung dịch đệm TAE hiệu điện 120V, 60mA, 20 phút Mẫu DNA nhuộm với CSL-runSafe (Cleaver) trước tra mẫu Sản phẩm DNA phân tách soi, kiểm tra chụp ảnh ánh sáng tia UV 3.6 Chọn lọc điều kiện cho phản ứng PCR 3.6.1 Chọn lọc mồi cho phản ứng PCR Trước thực khuếch đại phản ứng PCR với tất cá thể thuộc bốn quần đàn cá Lăng Chấm để phục vụ cho việc phân tích đoạn, cần phải tiến hành chọn lọc điều kiện khuếch đại phản ứng PCR với cặp mồi HM1, HM2, HM4, HM7, HM15, HM17 (Jiawen Ba, 2015) Sau đó, cặp mồi tối ưu điều kiện phản ứng lựa chọn để đánh dấu huỳnh quang thực PCR tất cá thể cá Lăng Chấm Mẫu DNA sử dụng thí nghiệm chọn lọc mẫu DNA tách chiết thành công từ quần đàn cá Lăng Chấm Phú Thọ: PT2, PT5 27 Bảng 3.4 Thông tin mồi sử dụng Mồi Nhiệt độ gắn mồi (oC) Trình tự mồi (5’-3’) Motif lặp Kích thước đoạn DNA HM1 F: CTCAGGCTGTCAATTAAACTAAGCA R: TTGACTTGGCTTGCTAGTGTAACAT 60 (GT)9 192 – 216 HM2 F: GGCCACACATGTAATATGTGGACT R: CTTCTTTCGCTCCAGTTCTCTCTT 60 (TC)19 302 – 348 HM4 F: GTAACTTTAAGACTTCAACGGTCCA R: TGCACGAGTGAGACACGTGAT 61 (CT)16 16 – 192 HM7 F: ATGGATCCTGAGTAAATTAAGAAGAATGT R: GTCCTGAGTAACGCGAGGTTGA 61 (CA)15 432 – 456 HM15 F: CATCTGGAATGAATCCAGAAGGT R: AGGAGTTTCAGGCTCTTTATCCT 61 (CA)13 291 – 313 HM17 F: ACTTTAACGGCTGAGGACGCTT R: AGTAAATATCACACACTCACTCGAGAC 60 (GT)35 156 – 218 * PCR thí nghiệm Thực phản ứng PCR đơn mồi mồi HM1, HM2, HM4 hai mẫu DNA lựa chọn Bảng 3.5 Thành phần phản ứng chu trình nhiệt sử dụng PCR thí nghiệm ST T Thành phần phản ứng Thể tích Chu kỳ nhiệt (µl) H2 O 14,25 5X Standard Buffer 5,0 dNTP 2.5 mM 2,0 Mồi xuôi 100 nM 0,8 Mồi ngược 100 nM 0,8 28 OneTaq polymerase 0,15 DNA khuôn 2,0 Tổng thể tích 25,0 Dung dịch ống trộn ly tâm nhanh nhằm đảm bảo nguyên liệu cho phản ứng PCR phân bố đủ Sau đó, ống PCR đưa vào máy thực phản ứng theo chu trình nhiệt * PCR thí nghiệm Thực phản ứng PCR đơn mồi với HM1, HM2, HM4 thay đổi thành phần nhờ sử dụng OneTaq 2X Master Mix kit Bảng 3.6 Thành phần chu trình nhiệt để tối ưu mồi HM1, HM2, HM4 PCR thí nghiệm Thành phần phản ứng STT Thể tích Chu kỳ nhiệt (µl) H2O 3,0 OneTaq 2X Master Mix 5,0 Mồi xuôi 100 nM 0,5 Mồi ngược 100 nM 0,5 DNA khuôn 1,0 Tổng thể tích 10,0 Đồng thời, tiến hành chọn lọc điều kiện phản ứng cho HM7, HM15, HM17 với thành phần chu trình bảng 29 Dung dịch ống trộn ly tâm nhanh nhằm đảm bảo nguyên liệu cho phản ứng PCR phân bố đủ Sau đó, ống PCR đưa vào máy thực phản ứng theo chu trình nhiệt * PCR thí nghiệm Thực phản ứng PCR đơn mồi với HM4, HM7 với thành phần PCR thí nghiệm tăng nhiệt độ gắn mồi lên 52oC Hình 3.1 Chu trình nhiệt cho mồi HM4, HM7 PCR thí nghiệm Mồi HM1, HM2, HM15, HM17: thành phần hóa chất giữ nguyên; giảm nhiệt độ gắn mồi xuống 48 oC Hình 3.2 Chu trình nhiệt cho mồi HM1, HM2, HM15, HM17 PCR thí nghiệm 3.6.2 Kiểm tra sản phẩm PCR Sau tiến hành phản ứng PCR, dung dịch sau phản ứng cần đưa vào phân tích kiểm tra Nếu sản phẩm hàm lượng sản phẩm thấp 30 - Giữ nguyên nhiệt độ gắn mồi, tăng thêm 10 chu kỳ nhiệt kiểm tra lại - Pha loãng sản phẩm PCR 10 lần, cố định nhiệt độ gắn mồi PCR lại - Tăng lượng DNA khuôn kiểm tra có mặt chất ức chế trình chuẩn bị mẫu cách sử dụng đối chứng dương - Tăng thời gian nhiệt độ bước biến tính mạch DNA khuôn - Thay đổi nồng độ thành phần (pH, Taq, dNTPs, mồi) - Tăng thể tích hỗn hợp phản ứng - Nếu thay đổi (3 – lần) yếu tố liên quan đến phản ứng PCR đơn mà kết loại bỏ mồi sử dụng Nếu xuất nhiều vạch băng sản phẩm: - Tăng nhiệt độ gắn mồi - Giảm số chu kỳ nhiệt cố định nhiệt độ - Thay đổi nồng độ thành phần (pH, Taq, dNTPs, mồi) Nếu thay đổi (3 – lần) yếu tố liên quan mà kết loại bỏ mồi sử dụng Cuối cùng, sau chọn lọc mồi với điều kiện phản ứng khuếch đại thích hợp, tiến hành PCR với tất cá cá Lăng Chấm thuộc quần đàn nghiên cứu để chuẩn bị nguyên liệu cho bước phân tích đoạn 3.7 Phân tích đoạn Sản phẩm PCR sử dụng để phân tích đoạn theo phần mềm máy GenomeLab GeXP Mẫu PCR chuẩn bị sau: Pha loãng sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1:3 nước tinh khiết Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp cho mẫu bao gồm • 240µl SLS (Solution Loading Sample) • 2µl SS (Size Standard 600) • Dung dịch hỗn hợp trộn Nhỏ 29µl dung dịch hỗn hợp vào giếng đĩa mẫu Bổ sung 1µl sản phẩm PCR pha loãng vào giếng đĩa mẫu Thêm giọt dầu lên giếng chứa mẫu Tiến hành đọc phân tích đoạn máy GenomeLab GeXP theo phần mềm GenomeLab System Genemarker V.2.2.0 31 3.8 Phân tích số liệu Các số liệu thu từ kết phân tích đoạn mã hóa thành liệu đầu vào cho phần mềm GenAlEx – Genetic Analysis in Excel (Peakall, Smouse., 2006) để tính toán: - Tần số allele - Mức dị hợp tử quan sát (Ho) - Mức dị hợp tử kì vọng (He) - Hệ số sai khác di truyền (Fst): Fst = (Ho – He)/Ho Hệ số dùng để xác định mối quan hệ alelle quần thể • Nếu Fst < 0.05 sai khác di truyền nhỏ • Nếu 0.05 < Fst < 0.15 sai khác di truyền trung bình • Nếu Fst > 0.15 sai khác di truyền lớn (Nie., 1978) - Hệ số cận huyết (Fis) Kiểm tra độ lệch từ trạng thái cân Hardy-Weinberg dựa thuật toán Markov chain (Guo Thompson, 1992) phần mềm Genepop 4.2 TÀI LIỆU THAM KHẢO A TIẾNG VIỆT Mai Đình Yên (1983) Các loài cá kinh tế miền Bắc Việt Nam NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Bộ Khoa học – Công nghệ môi trường (1992) Sách đỏ Việt Nam NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Đa dạng sinh học bảo tồn Việt Nam (2014) Phương pháp tiêu chí đánh giá đa dạng di truyền http://www.biodivn.com/2014/05/phuong-phap-tieu-chi-danhgia-dddt.html Trung tâm Quốc gia giống Thủy sản nước miền Bắc Cá Lăng Chấm B TIẾNG ANH Frankham R, Ballou J.D, Briscoe D.A (2002) Introduction to conservation genetics Cambridge University Press Toro, M and A Caballero (2005) Characterization and conservation of genetic diversity in subdivided populations Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360(1459): 1367-1378 Nei M (1987) Molecular evolutionary genetics Columbia University Press; New York 32 Hedrick P.W (2001) Conservation genetics: where are we now? TREE (16): 629–636 Nei M (1973) Analysis of gene diversity in subdivided populations Proc Natl Acad Sci USA (70):3321–3323 Ba, J., Li, Y., Jia, X et al (2015) Characterization and cross-species amplification of 19 polymorphic microsatellite loci of Hemibagrus macropterus (Bleeker) in the Yangtze River Conservation Genet Resour (2015) 7: doi:10.1007/s12686-0140295-4 Dowling T.E., Moritz C et al (1996) Nucleic acids III: analysis of fragments and restriction sites Molecular systematics: 249-320 Crawford AM., Dodds KG., Ede AJ et al (1995) An autosomal genetic linkage map of the sheep genome Genetics 140:703–724 Bruford, M.W., Bradley, D.G., and Luikart, G (2003) DNA markers reveal the complexity of livestock domestication Nat Rev Genet 4: 900-910 10 Ronan T Loftus, David E MacHugh et al (1994) Evidence for two independent domestications of cattle Proc Natl Acad Sci USA (91): 2757–2761 11 FAO (1989) Plant Genetic Resources Conceptual framework 12 Tóth, G., Gáspáriz, Z., Jurka, J., (2000) Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis Genome Research (10): 967-981 13 Cyprinus carpio A review Review, Aquatic living Resources, (16): 399-407 14 Weber, J L., (1990) Informativeness polymorphisms Genomics 7(4): 524-30 of human (dC-dA)n.(dG-dT)n 15 Jeffreys, A J., Royle, N J., Wilson, V., and Wong, Z., (1988) Spontaneous mutation rates to new length alleles at tandem-repetitive hypervariable loci in human ADN Nature 332(6161): 278-81 16 Vaiman, D., Schibler, L., Bourgeois, F., Oustry, A., Amigues, Y., and Cribiu, E P., (1996) A genetic linkage map of the male goat genome Genetics 144(1): 279-305 17 Vaiman, D., Schibler, L., Bourgeois, F., Oustry, A., Amigues, Y., and Cribiu, E P., (1996) A genetic linkage map of the male goat genome Genetics 144(1): 279305 18 Bruford, M W., and Wayne, R K., (1993) Microsatellites and their application to population genetic studies Curr Opin Genet Dev 3(6): 939-43 19 Schlötterer, C., Pemberton, J., (1994) The use of microsatellites for genetic analysis of natural population EXS, (69): 203-214 20 Takezaki, N., and Nei, M., (1996) Genetic distances and reconstruction of phylogenetic trees from microsatellite ADN Genetics 144(1): 389-99 21 Georges, M., Dietz, A B., Mishra, A., et al(1993) Microsatellite mapping of the gene causing weaver disease in cattle will allow the study of an associated quantitative trait locus Proc Natl Acad Sci USA 90(3): 1058-62 22 Gottelli, D., Sillero-Zubiri, C., Applebaum, G D et al (1994) Molecular genetics of the most endangered canid: the Ethiopian wolf Canis simensis Mol Ecol 3(4): 301-12 33 23 Chistiakov, D., Hellemans, B and Volckaert, F., (2005) Microsatellites and their genomic distribution, evolution, function and applications: A review with special reference to fish genetics Review, Aquaculture: 10-1016 24 Nicholl, D S T (2008) An Introduction to Genetic Engineering Cambridge University Press: 34 – 38 25 S.B Primrose, R M T (2006) Principles of Gene Manipulation and Genomics Blackwell Publishing 26 Tian, H., Y Que, N Zhao, F Chen, B Zhu, D Huang, J Chang and X Liao (2016) The complete mitochondrial genome of the spotted longbarbel catfish, Hemibagrus guttatus (Siluriformes, Bagridae) Mitochondrial DNA A DNA Mapp Seq Anal 27(1): 467-468 27 Toro, M and A Caballero (2005) Characterization and conservation of genetic diversity in subdivided populations Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360(1459): 1367-1378 34 [...]... chọn lọc các dòng được cải tiến về mặt di truyền, làm giảm giao phối cận huyết, tăng hiệu quả trong chọn giống (Chistiakov, 2005) Một số loài cá như cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar), cá bơn (Maximus scophthalmus), và tôm (Penaeus monodon) là các đối tượng đã được đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị microsatellite Tại Việt Nam, microsatellite được sử dụng nhiều trong đánh giá di truyền trên các đối... tượng nghiên cứu Cá Lăng Chấm (Hemibagrus guttatus Lacepède, 1803) 3.3 Nội dung nghiên cứu • Tách chiết DNA tổng số 4 quần đàn cá Lăng Chấm • Lựa chọn và tối ưu 3 cặp chỉ thị microsatellite cho cá Lăng Chấm • Tiến hành PCR đoạn gene cần quan tâm • Điện di trên hệ thống GeXP • Đọc kết quả và phân tích số liệu sau thí nghiệm để xác định mối quan hệ di truyền của các quần đàn cá Lăng Chấm 3.4 Vật liệu... được đánh giá dựa trên khoảng cách di truyền giữa chúng (Nei, 1987; Laval và cộng sự, 2002) và hệ số sai khác di truyền FST của Wright (1969) Bên cạnh đó, tiêu chuẩn được sử dụng phổ biến nhất để đánh giá đa dạng di truyền trong các quần thể là mức hợp tử kì vọng, hay sự đa dạng gene Đó là khả năng chọn được ngẫu nhiên hai alleles khác nhau trong các quần thể (Nei, 1973) Sự duy trì đa dạng di truyền là... đế đang được quan tâm nhất hiện nay, đặc biệt là khi các loài tự nhiên và cả các dòng, giống sản xuất đang dần biến mất ở mức độ báo động, do nhu cầu sử dụng nguồn thực phẩm động vật ngày càng tăng 2.2.2 Các kỹ thuật phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền Từ những năm 1990, nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ, chỉ thị phân tử đã trở thành công cụ hàng đầu để mô tả các đặc điểm của đa. .. định các locus quy định tính trạng số lượng ở nhiều loài gia súc (Georges và cộng sự, 1993) Ngoài ra, sự phân bố của các alen được sử dụng trong các nghiên cứu dòng chảy gen (Gottelli và cộng sự, 1994) 17 Trong lĩnh vực thủy sản, microsatellite là một trong những chỉ thị phân tử được lựa chọn để đánh giá di truyền các dòng thuộc các chương trình chọn giống Chúng cho phép phân tích biến dị di truyền. .. mới chỉ tiến hành việc giải trình tự gene ti thể của loài cá này (Tian và cộng sự, 2016) Tại Việt Nam, cá Lăng Chấm mới chỉ được nghiên cứu nhằm mục đích sinh sản nhân tạo và sản xuất giống thương phẩm mà chưa có các đề tài nghiên cứu sâu về đặc điểm di truyn của loài cá này 2.2 Đa dạng di truyền Đa dạng di truyền là khái niệm đề cập tới những biến dị của các alleles và kiểu gene bên trong các cá thể... gian Các đoạn cắt được phân tách bằng điện di và tiến hành lai theo phương pháp Southern Blot với một mẫu dò DNA đã đánh dấu tại một vị trí locus đặc hiệu Từ kết quả lai, có thể đánh giá được sự đa hình của locus quan tâm trên các phân tử DNA của các cá thể khác nhau Sự đa hình trong locus gene của một loài có thể được sử dụng để phân biệt các cá thể, quần thể, loài 13 RFLP có ưu điểm là một chỉ thị. .. nhau 2.3.3 Ưu điểm và nhược điểm Ưu điểm - Microsatellite là chỉ thị đồng trội, cho phép phân biệt cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử giữa các cá thể trong quần thể Tính đồng trội của microsatellite sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền - quần thể dựa trên chỉ thị này so với những chỉ thị khác như AFLP và RAPD Chỉ thị có tính đa hình cao do tỷ lệ đột biến cao (Jeffreys... 1994) Trong phân tích vị trí cắt giới hạn, DNA ty thể được cắt bởi enzym giới hạn, sau đó các đoạn phân cắt được phân tách bằng điện di trên gel Kết quả này có thể được sử dụng để đánh giá khác biệt di truyền và lịch sử tiến hóa của các quần thể và loài Về phân tích trình tự DNA, các gene ty thể được giải trình tự trực tiếp sử dụng các mồi phổ quát hay mồi đặc hiệu loài cho phép khuếch đại các trình... của các ribosome thường được sử dụng RNA 16S (16S là tiểu đơn vị của phân tử RNA ribosome) - cấu trúc được quan tâm đặc biệt(http://www.biodivn.com/2014/05/phuong-phap-tieuchi-danh-gia-ddt.html) Ở cấp độ phân tử, đa dạng di truyền thường được định lượng bằng: - Tần số kiểu gene và kiểu hình Tỉ lệ locus đa hình Mức dị hợp tử quan sát và kì vọng 12 Sự khác biệt về di truyền các quần thể thường được đánh