“Nghiên cứu tạo sunfate betaglucan từ nấm mem saccharomyces serevisae làm nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư”

“Nghiên cứu tạo sunfate betaglucan từ nấm mem saccharomyces serevisae làm nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư” “Nghiên cứu tạo sunfate betaglucan từ nấm mem saccharomyces serevisae làm nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư” “Nghiên cứu tạo sunfate betaglucan từ nấm mem saccharomyces serevisae làm nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư”

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu tạo sunfate beta-glucan từ nấm mem saccharomyces serevisae làm nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư” Sinh viên thực Ngành Giảng viên hướng dẫn : Trần Thị Hồng : Công nghệ sinh học : TS Lã Thị Huyền Trưởng phòng công nghệ TB động vật Viện Công nghệ sinh học TS Nguyễn Hữu Đức Khoa Công nghệ sinh học Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội “Khóa luận đệ trình khoa Công nghệ sinh học, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội phần yêu cầu trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học, năm học 2015 – 2016.” HÀ NỘI, 2016 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn kết khóa luận trực tiếp thực Các số liệu kết công bố khóa luận hoàn toàn trung thực, xác chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày Trần Thị Hồng tháng năm 2016 TÓM TẮT LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến người hướng dẫn, giúp đỡ tận tịnh hoàn thành luận văn này: TS Lã Thị Huyền, trưởng phòng Công nghệ TB động vật sinh học – Viện Công nghệ sinh học, hướng dẫn hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài ThS Nguyễn Thị Hạnh, kĩ thuật viên phòng Công nghệ TB động vật – Viện Công nghệ sinh học, người cô, người chị trực tiếp hướng dẫn, theo sát thí nghiệm để đưa lời khuyên bổ íchvà cán phòng Công nghệ tế bào thực vật giúp đỡ, bảo tận tình chuyên môn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Đức – Phó trưởng khoa Công nghệ sinh học, Trưởng môn Công nghệ sinh học động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội bên cạnh, bảo, hướng dẫn động viên suốt trình hoàn thành khóa luận Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tận tình bảo cho suốt trình học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến Bố, Mẹ toàn thể người thân gia đình bạn bè hỗ trợ, động viên, khuyến khích suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Trần Thị Hồng Phần I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Thực tại, hàng năm giới từ nhà máy chế biến rượu, bia, thực phẩm ủ chua thải lượng bã thải khổng lồ Hầu hết sản phẩm lên men dùng để chế biến thức ăn cho động vật, làm phân cải tạo đất để xử lý nước thải tạo khí sinh học hay dùng nguồn vật liệu rẻ tiền để sản xuất dịch chiết nấm men tự phân Trong đó, nguồn bã thải men bia cung cấp lượng lớn nấm men Saccharomyces cerevisiae giàu dinh dưỡng cần tận dụng cho mục đích khác tách beta-glucan, peptids có hoạt tính sinh học hay làm thức ăn chăn nuôi,…(Nguyễn Mạnh khải, 2012; Vương Thị Việt Hoa cs, 2006) Trong thành tế bào nấm men beta-glucan chiếm 50-60% trọng lượng khô, nguồn chất rắn bán làm thức ăn bổ sung chăn nuôi với giá thành rẻ Chính mà việc sẳn xuất sản phẩm phụ có giá trị kinh tế beta-glucan mang lại lợi nhuận cao cho nhà máy, xí nghiệp, đồng thời góp phần làm giảm thiểu tác động mặt môi trường từ khu công nghiệp Nhiều nước giới Hàn Quốc, Mỹ, Nhật Bản tiến hành tách chiết betaglucan từ tế bào nấm men để sử dụng yếu tố kích thích miễn dịch tiềm ẩn tác động tích cực đến hệ thống bảo vệ vật chủ, tăng tính đè kháng vật chủ phần lớn loại bệnh nhiễm khuẩn, nấm,virus Ngoài ra, beta-glucan chứng minh có khả điều hòa miễn dịch thay đổi tiến triển bệnh ung thư thực nghiệm Những quan sát kích thích nghiên cứu ứng dụng y sinh học tiềm polymer beta glucan Một trở ngại lớn cho việc sử dụng lâm sàng beta glucan khả hòa tan nước Các hạt beta glucan từ nấm men không hòa tan nước Do năm 1991, William D.L cộng công bố phương pháp phosphoryl hóa glucan tạo glucan hòa tan nước với hiệu suất gắn nhóm phosphate 70% Năm 1992, ông công bố tạp chí Carbonhydrate research phương pháp tạo sulfate glucan hòa tan với hiệu suất đạt 98% Sau nhiều nghiên cứu hoạt tính sinh học sulfate glucan áp dụng phương pháp tạo sulfate glucan Williams (được liệt kê đây) Năm 2012, nhà khoa học Trung Quốc công bố phát minh sáng chế số CN102633903A nêu phương pháp khác tạo sulfate beta-glucan Nhận thấy hướng hoàn toàn Việt Nam có khả ứng dụng cao nên tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu tạo sunfate beta-glucan từ nấm mem saccharomyces serevisae làm nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư” 1.2 Mục đích nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích - Tách chiết thành công beta-glucan từ thành tế bào nấm men bia - Tạo thành công sunfate beta-glucan từ beta-glucan, đồng thời tìm phương - pháp xác định hàm lượng sunfate hóa sau phản ứng Kiểm tra tác động sunfate beta-glucan tới phát triển tế bào ung thu nhằm góp phần tạo nguồn nguyên liệu cho điều trị ung thư 1.2.2 Nội dung - Tách chiết hợp chất beta-glucan từ nấm men bia sacchromyces serevise - Sunfate hóa beta-glucan tạo sunfate beta-glucan - Nuôi cấy tế bào ung thư dày, ung thư vú - Bổ sung hợp chất sunfate beta-glucan với nồng độ khác vào môi trường nuôi cấy tế bào ung thư để theo dõi tác động Phần II Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chủng nấm men sacchromyces cerevisiae 2.1.1 Định nghĩa Saccharomyces cerevisiae loài nấm men biết đến nhiều có bánh mì nên thường gọi men bánh mì loại vi sinh vật thuộc chiSaccharomyceslớpAscomycetesngànhnấm Loài xem loài nấm hữu dụng đời sống người từ hàng ngàn năm trước đến Nó dùng rộng rãi trình lên men làm bánh mì, rượu, bia(Feldmann, Horst, 2010) 2.2.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm men sacchromyces cerevisiae Tế bàonấm menSaccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng (Hình 1), có kích thuớc nhỏ, từ 5-6 đến 10-14 µm, sinh sản cách tạo chồi tạo bào tử Nguồn dinh dưỡng chủ yếu chúng sử dụng đường glucose, galactose, saccharose, maltose nguồn cacbon, chúng sử dụng axit amin muối amon nguồn nitơ Hình Hình ảnh tế bào nấm men từ bã men bia soi kính hiển vi vật kính 40X, thị kính 10X 2.2 Giới thiệu hợp chất beta-glucan 2.1.2 Tổng quan loại beta-glucan từ nấm men bia saccharomyces cerevisiae - β-Glucanlà polysaccharide tạo nên từ đơn phân tử D-glucose gắn với qua liên kết β-glycoside 1,2; 1,3; 1,4 1,6, - Các số 1-6 số thứ tự nguyên tử Cacbon (C) phân tử glucose C nhóm aldehyt CHO Dạng đồng phân D L dạng không gian “tuyệt đối” - Căn vào vị trí H OH C bất đối mang số thứ tự lớn (nhóm OH bên tay phải cấu hình D) Các đường D-glucose dung dịch chúng tồn chủ yếu cấu trúc vòng, cấu trúc hình thành phản ứng nhóm aldehyt (C-1) với nhóm OH vị trí C5 tạo thành vòng cạnh Khi tạo vòng, vị trí C-1 glucose có thêm nhóm OH, gọi OH glucosid, C trở thành cacbon bất đối, có thêm đồng phân α β Gọi α OH-glucosid phía vòng (cùng phía với OH C-5), gọi β OH-glucosid phía vòng (khác phía với OH C5) (Hình 2) Nhóm OH-β-glucosid C-1 kết hợp với OH C-3/C4/C-6 phân tử β-D-glucose khác tạo nên liên kết β-D-1,3/1,4/1,6glycosid (Hình 3) Hình Cấu trúc dạng đồng phân Glucose A B Hình Cấu tạo β-glucan A: Cấu tạo (1,3/1,4) β-Glucan, glucan tìm thấy vỏ ngũ cốc, lúa mỳ, yến mạch B: Cấu tạo (1,3/1,6) β-Glucan, loại glucan có nhiều nấm men loại nấm ăn Hình Các dạng cấu trúc khác β-glucan Hình Tổng hợp dạng cấu trúc glucan khác nhau: bao gồm β-(1,3)-D-glucan mạch thẳng, β-(1,3;1,4)-D-glucan mạch thẳng, mạch nhánh β-(1,3;1,2)-D-glucan, mạch nhánh β-(1,4;1,6)-D-glucan, mạch nhánh β-(1,3;1,6)-D-glucan, mạch nhánh nhánh β-(1,3;1,6)-D-glucan, β-(1,2)-D-glucan mạch vòng, β-(1,3;1,6)-Dglucan mạch vòng (Laura Barsanti et al., 2011) Beta glucan từ nấm men nấm dược liệu ý khả kích thích tăng cường miễn dịch chúng 2.2.2 Cấu tạo chức β-glucan thành tế bào nấm men a Cấu tạo hợp chất beta-glucan β-glucan thành tế bào nấm men β-(1,3/1,6)-D-glucan, có cấu trúc mạch (1,3)-β-D-glucan mạch nhánh (1,6)-β-D-glucan Các nhánh gắn vào vòng glucopyranose C-6 mạch tạo thành cấu trúc (Lessage & Bussey, 2006) (Hình 1.9) Các phân tử (1,3)-β-D-glucan hình thành cấu trúc chuỗi xoắn ba (tridimension) với đặc điểm đàn hồi, đảm bảo sức mạnh thành tế bào nấm men (Klis et al., 2002) khả hấp thụ chất độc (Yiannikouris et al., 2004) (1,6)-β-D-glucan cầu nối (linker) (1,3)-β-D-glucan, chitin mannoprotein (Kaptein et al, 1999; Kollar et al, 1997) đảm bảo ổn định toàn cấu trúc tế bào nguyên nhân thành tế bào nấm men không tan Ngoài ra, nấm men chứa hỗn hợp (1,4)-α-(1,3)-β-D-glucan, loại glycogen giống tinh bột, hòa tan kiềm, polysaccharid dự trữ lượng tế bào chất tế bào, khó hòa tan axit, chúng mắc kẹt thành tế bào (Hình 6) b Chức beta-glucan thành tế bào nấm men saccharomyces serevisiae Với cấu trúc phân nhánh β-(1,3/1,6)-D-glucan, β-glucan thành tế bào nấm men cho có khả kích thích tăng cường miễn dịch mạnh Có nhiều thụ thể chúng tế bào có thẩm quyền miễn dịch trình bày trên, vào thể chúng kích hoạt tế bào tăng số lượng mà làm cho tế bào hoạt động mạnh mẽ đáp ứng lại tác nhân nguy hại cho thể Bên cạnh đó, β-(1,3/1,6)-D-glucan chứng minh có khả kích thích hoạt động hệ miễn dịch, hấp thụ gốc tự do, chất độc giúp giải độc cho thể da β-(1,3/1,6)-Dglucan chứng minh làm giảm hàm lượng cholesterol máu,… Với chức đó, β-(1,3/1,6)-D-glucan ứng dụng nhiều lĩnh vực: làm thực phẩm tăng cường miễn dịch, kem dưỡng da, thực phẩm hỗ trợ điều trị mỡ máu, tiểu đường, tá dược cho vaccine,… 2.2.3.Các quy trình phân tách β-glucan từ nấm men Saccharomyces serevisiae Trong số cácβ-glucan,Saccharomyces serevisiae nghiên cứu nhiều với nhiều quy trình công nghệ tách chiết khác Do β-glucan định vị thành tế bào nấm men nên để tách chiết β-glucan bước cần phải ly giải tế bào để tách phần thành tế bào không hòa tan khỏi tế bào chất; bước thứ hai tách chiết β-glucan từ thành tế bào không hòa tan Có vài phương pháp để phân giải tế bào nấm men bao gồm phương pháp hóa học, vật lý phương pháp sử dụng enzyme Các chất hóa học thường sử dụng NaOH, HCl, acetic acid, citric acid… Hầu hết trường hợp sử dụng chất hóa học xử lý nhiệt độ cao (Pelizon et al., 2005; Hunter et al., 2002) Phương pháp vật lý sử dụng siêu âm, đồng với áp suất cao… (Shokri et al., 2008; Boonraeng et al., 2000) Nhóm phương pháp cuối để phá hủy tế bào nấm men sử dụng enzyme tự nhiên, enzyme phá hủy thành tế bào nấm men, mà phần hòa tan tế bào chất chui qua lỗ hổng bề mặt tế bào Phương pháp sử dụng enzyme chia làm nhóm: thứ tự phân giải thông qua hoạt động enzyme nội sinh, trình thủy phân polymer sinh học nội bào tác dụng enzyme thủy phân liên quan đến chết tế bào Quá trình tự phân giải bắt đầu lysosome giải phóng enzyme phân cắt vào tế bào chất, kéo dài vài ngày (Vosti et al., 1954) Thứ hai dùng vi sinh vật có khả sử dụng polymer sinh học thành tế bào nấm men nguồn cung cấp dinh dưỡng, đồng thời chúng sản xuất enzyme để đồng hóa thành tế bào nấm men (Ferrer, 2006; Adamisch et al., 2003) Arturas Javmen cộng (2012) sử dụng dịch nuôi cấy chủng Actinomyces rutgersensis 88 tạo phức hợp enzyme để phân giải thành tế bào Trong dịch nuôi cấy Actinomyces rutgersensis 88 có enzymes laminarinase (β-1,3), licheninase (β-1,3; 1,4), gentibiosinase (β-1,6), β-glucanase (β-1,3; 1,6), mannanase (α-1,6; 1,2; 1,3), galactomannanase (β-1,4), chitinase (β-1,4), proteinase (-CO-NH-) (Гуреева, 1983) Cụ thể, Hojjatollah Shokri cộng (2008) phát triển quy trình tối ưu để tách chiết tinh chế beta-glucan Lúc đầu, tế bào nấm men phát triển môi trường thạch dextrose sabouraud sau nuôi môi trường chứa dịch chiết nấm men, peptone, glucose (YPG) Sau ủ, tế bào thu hoạch, rửa bị phá vỡ phương pháp siêu âm Thành tế bào thu được dùng để thu nhận beta-glucan hòa tan phương pháp xử lý với kiềm/axit Về vấn đề này, 2% sodium hydroxide (NaOH) axit axetic 3% sử dụng chiết xuất axit kiềm, tương ứng Kết sản phẩm chứa 2,4% protein Trong bước tiếp theo, DEAE sephacel sắc ký sử dụng để loại bỏ protein lại Sau tiếp tục cho lên cột concanavalin A-Sepharose để loại bỏ mannan Khác với Hojjatollah Shokri, Bahl cộng (2009) chọn phương pháp tách chiết tạo β-glucan trọng lượng phân tử thấp hòa tan thông qua việc xử lý tế bào nấm men với kiềm axit nhiệt độ cao để thu β-glucan tổng số, sau thủy phân chúng với enzyme endoglucanase dùng phương pháp lọc thu nhận phân tử β-glucan trọng lượng nhỏ (Patent 7550584) Xiao-YongLiu cộng (2006) đưa phương pháp tách chiết β-D-glucan từ thành tế bào S cerevisiae bao gồm bước tự phân giải, xử lý với nước dung môi hữu cơ, đồng thủy phân protease So với phương pháp truyền thống, phương pháp làm tăng hiệu suất, độ tinh giữ cấu trúc tự nhiên β-D-glucan Hơn phương pháp không làm ô nhiễm môi trường dễ thực quy mô công nghiệp Kết thu hiệu suất 91% thành tế bào nấm men ban đầu với độ tinh 93% (W/W) Cho đến nghiên cứu beta-glucan nấm men tiếp diễn xu hướng tập trung vào vấn đề kích thước glucan độ hòa tan nước chúng Sulfate beta-glucan hòa tan nước nhà khoa học quan tâm 2.3.Sulfate beta-glucan từ nấm men Saccharomyces serevisiae 2.3.1.Tổng quan Sulfate beta-glucan Beta glucan phân tách từ tế bào Saccharomyces cerevisiae trình bày chúng có nhiều tác dụng có lợi việc điều trị bệnh vi khuẩn, virus nấm gây Glucan chứng minh có khả điều hòa miễn dịch thay đổi tiến triển bệnh ung thư thực nghiệm Những quan sát kích thích nghiên cứu ứng dụng y sinh học tiềm polymer beta glucan Một trở ngại lớn cho việc sử dụng lâm sàng beta glucan khả hòa tan nước Các hạt beta glucan từ nấm men không hòa tan nước Do năm 1991, William D.L cộng công bố phương pháp phosphoryl hóa glucan tạo glucan hòa tan nước với hiệu suất gắn nhóm phosphate 70% Năm 1992, ông công bố tạp chí Carbonhydrate research phương pháp tạo sulfate glucan hòa tan với hiệu suất đạt 98% Sau nhiều nghiên cứu hoạt tính sinh học sulfate glucan áp dụng phương pháp tạo sulfate glucan Williams (được liệt kê đây) Năm 2012, nhà khoa học Trung Quốc công bố phát minh sáng chế số CN102633903A nêu phương pháp khác tạo sulfate beta-glucan Vậy sulfate glucan có tác dụng nào? Sulfate beta-glucan (1,3/1,6)-β-D-glucan gắn thêm nhóm sulfate vào vị trí C2, C4, C6 (Hình 6) Sau gắn nhóm sulfate chúng trở nên hòa tan nước thể hoạt tính riêng Hình Cấu trúc β-glucantrong thành tế bào nấm men (Godfrey C.C et al., 2009) 2.3.2 Hoạt tính sinh học ứng dụng sulfate betaglucan a Hoạt tính kháng đông tụ máu kháng huyết khối Sulfate beta-glucan có phổ hoạt tính sinh học rộng đa dạng, hoạt tính chống đông máu chúng nghiên cứu sớm nhất.Hoạt tính chống huyết khối sulfate beta-glucan thử nghiệm in vivo theo mô hình nghẽn tĩnh mạch động mạch động vật thí nghiệm (Alban S cộng sự, 1995) Sulfate -1,3-glucan thể hoạt tính chống đông máu thấp heparin số thử nghiệm in vitro Tuy nhiên, lại thể hoạt tính kháng huyết khối mạnh heparin thực thí nghiệm in vivo, điều giải thích ảnh hưởng yếu tố thời gian đến hoạt tính kháng huyết khối Sulfate-1,3-glucan Susanne Alban Gerhard Franz(2001)đã nghiên cứu sử dụng sunfat glucan với hy vọng chúng có tiềm thay heparin Kết sunfat glucan thể hiệu ứng chống đông rõ rệt; số hoạt động heparin Theo nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc hoạt động, khối lượng phân tử (MW), hàm lượng sulfate (DS), mô hình sulfate cấu trúc polysaccharide thông số quan trọng cho hiệu lực chống đông Hàm lượng sulfate có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính kháng đông tụ máu sulfate beta-glucan, hàm lượng sulfate cao hoạt tính kháng đông tụ lớn Vị trí nhóm sulfate gốc đường quan trọng với hoạt tính kháng đông tụ sulfate beta-glucan Theo nghiên cứu beta-glucan sulfate hóa vị trí C-2 C-4 có hoạt tính kháng đông tụ Trọng lượng phân tử sulfate betaglucan có ảnh hưởng lên hoạt tính kháng đông tụ máu chúng Với beta-1,3-glucan với DS>1 trọng lượng phân tử tử 18 50 kDa chứng minh giải pháp phù hợp cho kết giống heparin (Susanne Alban Gerhard Franz, 2001) Như vậy, thấy sulfate betaglucan có tiềm lớn để sử dụng làm thuốc chống đông máu, thuốc chống huyết khối thực phẩm chức dược liệu mà tác dụng phụ b Hoạt tính chống virus Trong năm gần đây, thử nghiệm hoạt tính kháng virus sulfate beta-glucan thực “in vitro” “in vivo” yếu tố gây độc tế bào thấp chúng so với thuốc kháng virus khác quan tâm xem xét sử dụng y học lâm sàng Sulfate beta-glucan từ Pleurotus tuberregium cho thấy hoạt tính kháng virus HSV-1 HSV-2, RSV, virus cúm A mà không gây độc cho tế bào (Zhang cộng sự., 2004) Các tác dụng ức chế virus suy giảm miễn dịch người (virus HIV) thử nghiệm in vitro sulfate (1,3)-β-D-glucan nghiên cứu (1,3)-β-Dglucan, sulfate acid piperidin-N-sulfonic dimethyl sulfoxide cho sulfate (1,3)-β-D-glucan với nhiều kích thước phân tử nhóm lưu huỳnh khác Sulfate (1,3)-β-D-glucan với hàm lượng lưu huỳnh 14,4% ức chế hoàn toàn việc lây nhiễm HIV nồng độ thuốc thấp 3,3 µg/ml Nhóm sulfate đưa vào vị trí C6, C4 C2 tương ứng Đây polysaccharide chống virus AIDS mạnh (Takashi Yoshida cộng sự, 1990) Ngoài ra, sulfate beta-glucan có khả ức chế sinh sản virus H1N1 SIV hoạt động neuraminidase(Sun Ying-feng cộng sự, 2015) c Hoạt tính kháng u điều hòa miễn dịch Hoạt tính kháng u nhiều polysacaride công bố năm gần Những thử nghiệm in vitro in vivo sulfate (1,3)-beta-D-glucan Poria cocos cho thấy dẫn xuất có tác dụng chống u báng 180 (S-180) làm biến dạng tế bào ung thư biểu mô dày (MKN-45 SGC-7901), tác dụng kháng u không xuất (1,3)-beta-D-glucan tự nhiên (Wang Y cộng sự, 2004) Sulfate glucan có tác dụng khóa chặt tế bào ung thư vú MDA-MB231 ngăn kết dính với tiểu cầu, tác dụng có ý nghĩa quan trọng trình di khối u Khả phục hồi chức miễn dịch sulfate glucan thử nghiệm in vivo Các nghiên cứu sulfate glucan từ S.cerevisia kích thích tăng sinh tủy xương chuột sau tiêm tĩnh mạch (Williams DL cộng sự, 1992) Ngoài rasulfate glucanở liều thích hợp thúc đẩy đáng kể tế bào lympho tăng sinh, tăng cường kháng thể, làm tăng khả sản xuất interleukin-2 (IL-2) interferon-γ (IFN-γ) huyết gà, cải thiện đáng kể hiệu miễn dịch vắc-xin, phòng bệnh Newcastle, ứng cử viên chocác tá dược miễn dịch (Mi Wang cộng sự, 2014) Sulfate glucantăng cường chức tế bào lympho T, tế bào B, đại thực bào, tế bào giết tự nhiên (NK tế bào) thúc đẩy kháng thể phản ứng lại với tế bào hồng cầu máu cừu (SRBC) thí nghiệm in vivo d Hoạt tính chống oxy hóa Rất nhiều công bố cho thấy Sulfate beta-glucan thể hoạt tính chống oxy hóa quan trọng thí nghiệm in vitro in vivo Nó chất chống oxy hóa tự tuyệt vời để ngăn ngừa bệnh gây gốc tự Tác dụng ức chế hình thành gốc tự hydroxyl gốc peoxit, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Sulfate beta-glucan từ Saccharomyces cerevisiae nghiên cứu Na Lei cộng sự, 2015, kết cho thấy, Sulfate beta-glucan cải thiện đáng kể catalase huyết thanh, hoạt động glutathione peroxidase (GSH-Px) giảm malondialdehyde (MDA) cấp chuột Hoạt tính chống oxy hóa liên quan đến trọng lượng phân tử hàm lượng sulfate Sulfate beta-glucan Những kết Sulfate beta-glucan với thấp MW DS có chất chống oxy hóa tốt hoạt động miễn dịch tốt hơn.Cả khối lượng phân tử hàm lượng sulfate sulfate beta-glucan đóng vai trò quan trọng việc tác động lên gốc azo 2-2'-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) gây trình oxy hóa LDL e Giảm lipid máu Sulfate beta-glucan hợp chất có hoạt tính tương tự axít sialic, làm tăng điện tích âm bề mặt tế bào đến mức có hiệu lực với tích tụ cholesterol máu, kết làm giảm lượng cholesterol huyết Các nghiên cứu in vivo chuột béo phì cho thấy Sulfate betaglucan sợi nấm Ganoderma lucidum làm giảm đáng kể cholesterol toàn phần, triglyceride LDLC mà tác dụng phụ gây tổn hại cho gan thận (Kim cộng sự, 2014) Hoạt tính giảm lipid máu Sulfate betaglucan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử chúng, trọng lượng phân tử thấp hoạt tính cao f Hoạt tính chống viêm Năm 2006, Groth I cộng nghiên cứu hoạt tính chống viêm Sulfate beta-glucan bán tổng hợp Kết cho thấy Sulfate beta-glucan có khả ức chế tăng số lượng bạch cầu mô hình chuột bị viêm, hiệu chống viêm Sulfate beta-glucan mô hình không bị ảnh hưởng nhiều hàm lượng sulfate Ngoài Sulfate betaglucan bảo vệ dày, Sulfate beta-glucan tác nhân chống viêm loét ức chế kết dính với vi khuẩn Helicobacter pyroli (một loại vi khuẩn gây viêm loét dày), bảo vệ tế bào gan ức chế tăng sinh tế bào gan hình Những nghiên cứu suốt thập niên vừa qua đưa số lượng lớn chứng khoa học lợi ích sức khỏe Sulfate beta-glucan, Nghiên cứu hoạt tính sinh học Sulfate beta-glucan mở hội tiềm cho ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm thực phẩm chức năng, dụng điều trị bệnh ung thư vú, ruột kết, buồng trứng, tác dụng chống dị ứng, chống lão hóa, chống đái tháo đường, giảm cholesterol, loét dày, tác dụng trị tim mạch, chống lão hóa, tăng cường miễn dịch, sản phẩm thuốc kháng virut, điều trị ung thư tim mạch… Như thấy, Sulfate betaglucan với nhiều hoạt tính sinh học thú vị tiềm ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực sống ngày thu hút quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ nhà khoa học toàn giới 2.2.3 Phương pháp tạo sunfate beta-glucan từ beta-glucan nấm men Phương pháp D.L Wiliams 1991, trình tạo sulfate glucan hòa tan chuẩn bị sau: 2,4 g vi hạt glucans nấm men hòa tan 200 ml dimethyl sulfoxide (DMSO) chứa M urea 32 ml axit sulfuric đậm đặc nhỏ vào dung dịch.Dung dịch đun nóng đến 100 ° C h Một tinh thể kết tủa (ammonium sulfate?) hình thành 90 phút Sau đó, dung dịch làm lạnh đến nhiệt độ môi trường xung quanh pha loãng l nước tinh khiết, Pyrogen-miễn phí, nước khử ion thu từ hệ thống lọc nước (Millipore, Bedford, MA) Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian địa điểm thực tập Thời gian  Khóa luận tiến hành từ 08/2016 đến ngày 12/2016 Địa điểm nghiên cứu  Phòng Cộng nghệ tế bào động vật – Viện công nghệ sinh học – Viện hàn lâm khoa học Việt Nam  Khoa Công nghệ sinh học thuộc Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội 3.2 Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn nấm men bia (saccharomyces serevisiae) 3.3 Vật liệu nghiên cứu 3.3.1 Vật liệu 3.3.2 Dụng cụ, hóa chất