Tài liệu Lưu hành kháng thể kháng H. pylori, CagA, VacA ở các bệnh nhân có bệnh dạ dày - tá tràng và người bình thường không triệu chứng pot

TCNCYH 23 (3) 2003 Lu hành kháng thể kháng H. pylori, CagA, VacA ở các bệnh nhân có bệnh dạ dày - tá tràng và ngời bình thờng không triệu chứng Nguyễn Thái Sơn 1 , Phùng Đắc Cam 2 , sa Ljungh 3 1 Học viện quân y 2 Viện vệ sinh dịch tễ trung ơng 3 Khoa vi khuẩn học, Đại học Lund, Thụy Điển Xét nghiệm 110 mẫu huyết thanh bệnh nhân có bệnh dạ dày-tá tràng và 31 mẫu từ ngời bình thờng bằng kỹ thuật immunoblot cho thấy, tỷ lệ nhiễm H. pylori cao ở cả hai nhóm. Tỷ lệ H. pylori dơng tính ở các bệnh nhân loét dạ dày, loét tá tràng và viêm dạ dày lần lợt là 76,5; 95,8 và 73%. Tỷ lệ huyết thanh học dơng tính với H. pylori ở ngời lành là 64,5%. Tỷ lệ kháng thể kháng cagA và VacA là 86.2% và 60.6% ở ngời bệnh và 70% và 40.0% ở ngời lành. i. Đặt vấn đề Sự phát hiện ra Helicobacter pylori (H. pylori) và vai trò của nó trong các bệnh về dạ dày - tá tràng là một trong những phát hiện có ý nghĩa nhất trong lĩnh vực vi khuẩn học và hệ thống tiêu hóa cuối thế kỷ 20. Tiếp sau phát hiện của Marshall và Warren năm 1983 [8], rất nhiều nghiên cứu đã đợc công bố. Ngày nay H. pylori đã đợc thừa nhận là nguyên nhân chủ yếu gây viêm, loét dạ dày - tá tràng, có vai trò quan trọng trong bệnh sinh của ung th dạ dày [9]. Khả năng gây bệnh của H. pylori có liên quan đến hai yếu tố độc tính quan trọng của chúng là CagA và VacA [5]. Mức độ lu hành của H. pylori qua các nghiên cứu cho thấy khác nhau giữa các quốc gia, khu vực và sắc tộc [10]. Nhìn chung, tỉ lệ nhiễm H. pylori ở các nớc đang phát triển cao hơn hẳn ở các nớc phát triển [10]. Việt Nam là một nớc đang phát triển, tỉ lệ nhiễm H. pylori tơng đối cao qua một số nghiên cứu đợc công bố [1]; tuy nhiên các yếu tố CagA và VacA vẫn cha đợc nghiên cứu nhiều. Đề tài này nhằm mục tiêu tìm hiểu thêm về tỉ lệ lu hành kháng thể kháng H. pylori, và tỉ lệ mang CagA, VacA ở các bệnh nhân có bệnh dạ dày tá tràng và ngời bình thờng không triệu chứng bằng kỹ thuật Immunoblot. ii. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng 1.1. Bệnh nhân 110 bệnh nhân (tuổi từ 15 đến 70, trung bình 39) có viêm hoặc loét dạ dày, tá tràng đợc chẩn đoán qua nội soi tại Bệnh viện 103, Học viện quân y từ 3/1998 đến 6/2000, gồm: - Loét dạ dày: 17 bệnh nhân - Loét tá tràng: 24 bệnh nhân - Loét dạ dày kèm loét tá tràng: 20 bệnh nhân - Viêm dạ dày: 26 bệnh nhân 54 TCNCYH 23 (3) 2003 - Viêm dạ dày kèm viêm tá tràng: 23 bệnh nhân 1.2. Ngời khoẻ mạnh 31 ngời bình thờng khoẻ mạnh (tuổi từ 19 đến 60, trung bình 32), không có tiền sử và triệu chứng dạ dày- tá tràng tính đến thời điểm nghiên cứu. ắ Tất cả các đối tợng nghiên cứu đều đợc lấy máu tĩnh mạch dùng cho xét nghiệm H. pylori. 2. Vật liệu - Kháng nguyên tách chiết bằng phơng pháp glycine từ chủng chuẩn H. pylori CCUG 17874 (Lund University, Sweden). - SDS - PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) với Precast gradient gel 10- 20% Tris-HCl (catalog 345- 0045, Bio-Rad, CA, USA). - Bộ điện di thấm (electroblotter equipment, Ancos, Vig, Denmark). - Màng PVDF (polyvinylidene difluoride, Micron Separation Inc,Westborough, MA, USA). - Kháng thể kháng ngời gắn men [horse- radish-peroxidase conjugated anti-IgG antibodies (Dako, Glostrup, Denmark)]. 3. Phơng pháp Kháng nguyên của vi khuẩn H. pylori đợc tách chiết bằng phơng pháp glycine axit từ chủng chuẩn CCUG 17874 (Lund University, Sweden). Các lớp protein kháng nguyên đợc phân tách bằng điện di gradient trên gel SDS- PAGE (Precast gradient gel 10-20% Tris-HCl, catalog 345-0045, Bio - Rad, CA, USA) với bộ điện di gel (Bio - Rad, Richmond, CA, USA). Tiếp theo các kháng nguyên lại đợc điện di chuyển sang màng PVDF. Sau khi điện di, phần màng chứa các marker mẫu đợc cắt riêng, nhuộm Amidoblack. Phần màng đã phủ kháng nguyên đợc đánh dấu, cắt thành các dải 3mm chiều rộng, đặt vào khay ủ, phủ huyết thanh bệnh nhân pha loãng 1:100, 1 ml/ dải, để qua đêm ở 8 o C. Hôm sau, các dải màng đợc lấy ra rửa sạch huyết thanh thừa, rồi sau đó đợc ủ tiếp với kháng thể kháng IgG ngời gắn peroxidase (Dako, Glostrup, Denmark) pha loãng 1/600, ủ trong 2 giờ, sau đó rửa sạch kháng thể thừa. Các vị trí kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể trên màng đợc phát hiện sau khi ủ 30 phút với đệm cơ chất (gồm sodium acetate buffer, 1% 3-amino-9- ethyl Carbazole, H 2 0 2 30%) [4]. Kết quả dơng tính khi có một trong ba dải trọng lợng phân tử cao (120, 94 và 85 kDa) kèm với hai trong bốn dải trọng lợng phân tử thấp (33, 30, 29, 26 kDa) đặc hiệu của H. pylori xuất hiện trên cột kháng nguyên [4]. iii. Kết quả Trong 110 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có bệnh dạ dày - tá tràng và 31 mẫu huyết thanh của ngời bình thờng không triệu chứng, tỉ lệ H. pylori dơng tính, CagA, VacA tìm đợc thể hiện trong bảng sau: 55 TCNCYH 23 (3) 2003 H. pylori CagA * VacA * Bệnh nhân: Số mẫu + % + % + % LDD 17 13 76,5 11 84,6 6 46,2 LTT 24 23 95,8 22 95,6 17 73,9 LDD + LTT 20 18 90,0 15 83,3 11 61,1 VDD 26 19 73,0 18 94,7 11 57,9 VDD + VTT 23 21 91,3 15 71,4 12 57,1 Tổng số 110 94 85,5 81 86,2 57 60,6 Ngời khỏe mạnh 31 20 64,5 14 70,0 8 40,0 LDD = Loét dạ dày LTT = Loét tá tràng VDD = Viêm dạ dày VTT = Viêm tá tràng * Tỉ lệ % của CagA và VacA đợc thống kê trong số trờng hợp dơng tính với H. pylori. 120 kDa 94 kDa 87 kDa 33 kDa 30 kDa 29 kDa 26 kDa Các kháng nguyên đặc hiệu của H. pylori sau khi điện di gradient SDS - PAGE. 56 TCNCYH 23 (3) 2003 iv. Bàn luận Trong nhóm các phơng pháp không xâm phạm sử dụng huyết thanh học chẩn đoán H. pylori, Immunoblot đợc coi là phơng pháp có độ tin cậy cao với độ đặc hiệu gần nh 100%, độ nhậy trên 90%. Ngoài ra, phơng pháp này còn có thể phát hiện những marker gây bệnh quan trọng nh CagA, VacA [2]. Những trờng hợp dơng tính với H. pylori có thể đợc khẳng định thông qua những vị trí kháng nguyên đặc hiệu của H. pylori xuất hiện trên cột kháng nguyên (ảnh). Để tránh những trờng hợp dơng tính giả xảy ra sau khi H. pylori đã đợc điều trị diệt trừ, kết quả dơng tính trong Immunoblot đợc qui ớc khi có ít nhất một dải kháng nguyên ở khu vực trọng lợng phân tử cao kèm theo hai dải ở khu vực trọng lợng phân tử thấp đặc hiệu của H. pylori xuất hiện trên cột kháng nguyên [4]. Kết quả của Immunoblot trên các đối tợng bệnh nhân và ngời khoẻ mạnh trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: Tỉ lệ dơng tính với H. pylori ở nhóm bệnh nhân là 85,5%; ở nhóm ngời khoẻ mạnh không triệu chứng là 64,5% (p < 0,05%). Tỉ lệ H. pylori dơng tính phân bố giữa các thể bệnh trong nhóm bệnh nhân cũng hoàn toàn phù hợp với những nghiên cứu về H. pylori đã đợc công bố trên thế giới và trong nớc [1], [7]. Đặc biệt, hai marker gây bệnh quan trọng của H. pylori là CagA và VacA có tỉ lệ cao trong số các trờng hợp dơng tính với H. pylori: CagA dơng tính 86,2% trong nhóm bệnh và 70% trong nhóm ngời khoẻ không triệu chứng nhiễm H. pylori. VacA dơng tính 60,6% trong nhóm bệnh nhân và 40% trong nhóm ngời khoẻ mạnh không triệu chứng nhiễm H. pylori qua nghiên cứu. Các nghiên cứu về CagA và VacA trên thế giới cho biết tỉ lệ dơng tính của hai marker này khoảng 40% - 70% trong các trờng hợp nhiễm H. pylori [3]. Một nghiên cứu trớc đây của các tác giả Hà Văn Mạo và Tạ Long đã cho biết tỉ lệ CagA là 80% ở các bệnh nhân ngời Việt Nam bị loét tá tràng có H. pylori dơng tính [6]. Nghiên cứu của chúng tôi nếu tính riêng trong số bệnh nhân loét tá tràng có H. pylori dơng tính thì CagA là 95,8%, các thể bệnh còn lại cũng đều ở mức cao (71,4% đến 95,6%). Còn về VacA, trớc đây cha có nghiên cứu trong nớc thống kê về marker này. Yếu tố VacA (liên quan trực tiếp đến gây loét ở dạ dày - tá tràng) tới 60 % ở nhóm bệnh, 40 % ở nhóm lành. Yếu tố CagA làm tăng tính độc của VacA và còn liên quan đến một số biểu hiện khác (ung th dạ dày, các bệnh ngoài dạ dày), tới 86 % ở nhóm bệnh và 70 % ở nhóm lành trong những trờng hợp H. pylori dơng tính. Nh vậy, nghiên cứu này góp phần giúp thêm nhận định rằng, các bệnh nhân ngời Việt Nam và cả ngời khỏe mạnh không triệu chứng có tỉ lệ các marker CagA và VacA ở mức cao trong số các trờng hợp nhiễm H. pylori, đặc biệt là yếu tố CagA. Điều này cảnh báo rằng, các chủng H. pylori đang lu hành ở Việt Nam có tiềm năng gây loét cao và nguy cơ cao của các trờng hợp nhiễm H. pylori với các bệnh lý của dạ dày- tá tràng (ung th dạ dày, viêm dạ dày- tá tràng v.v.). v. Kết luận Tỉ lệ lu hành cao của nhiễm trùng H. pylori ở cả hai nhóm bệnh nhân và ngời khỏe mạnh: 85,5% trong nhóm bệnh dạ dày tá tràng; 64,5% trong nhóm ngời khỏe mạnh không triệu chứng. Tỉ lệ xuất hiện CagA và VacA cao trong những trờng hợp dơng tính với H. pylori: 86,2 % với CagA và 60,6 % với VacA ở nhóm bệnh dạ dày tá tràng; 70 % với với CagA và 40 % với VacA ở nhóm ngời khỏe mạnh không triệu chứng. Tài liệu tham khảo 1. Tạ Long: Helicobacter pylori và bệnh loét dạ dày tá tràng. Một số chuyên đề nội khoa, Hội Nội khoa Việt Nam. 1999: 27- 34. 57 TCNCYH 23 (3) 2003 2. Bee Ling Ng, Han Chong Ng, Kee Tai Goh, Bow Ho: Helicobacter pylori in familial clusters based on antibody profile, FEMS Immunology and Microbiology. 2001, 30: 139- 142. 3. Bruce E. Dunn, Hartley Cohen, and Martin J. Blaser: Helicobacter pylori, Clinical Microbiology Reviews. 1997: 720-741. 4. Ingrid Nilsson, Åsa Ljungh, Pär Aleljungh, and Torkel Wadström: Immunoblot Assay for Serodiagnosis of H. pylori Infections, Journal of Clinical Microbiology. 1997: 427-432. 5. Leen-Jan van Doorn, Ceu Figueiredo, and Wim Quint : Molecular Typing of Helicobacter pylori, Helicobacter pylori: Molecular and Cellular Biology, Horizon Scientific Press. 2001: 293-310. 6. Mao H.V, Lak B.V, Long T et al : Omeprazole or ranitidine bismuth citrate triple therapy to treat H. pylori infection: a randomized, controlled trial in Vietnamese patients with duodenal ulcer”, Aliment Pharmacol Ther. 1999, 13: 1 – 5. 7. Marshall BJ et al : Helicobacter pylori, Am. J. Gastroenterol. 1994, 89(8): S116-S126. 8. Marshall BJ, Warren JR : Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration, Lancet. 1984, (1) : 1311 - 1315. 9. Military Medicine : Association of Helicobacter pylori infection with gastric cancer. 2000, 165-1(021) : 21-27. 10. Pradip K.Bardhan: Epidemiological Features of Helicobacter pylori infection in Developing countries, Clinical Infectious Diseases. 1997, 25: 973-978. Summary Antibodies to Helicobacter pylori, CagA, VacA in the patients with gastroenteropathy and in healthy persons The results of study from the sera of 110 patients with gastro-duodenal diseases and 31 healthy persons by Immunoblot assay show that: The prevalence of H. pylori infections is high level in both patients and healthy persons. The proportion of H. pylori positive in patients with gastric ulcer, duodenal ulcer and gastritis were found 76.5%, 95.8% and 73% respectively. H. pylori seropositive was found 64.5% in healthy persons. The prevalence of anti-CagA and anti-VacA antibodies in patients who have H. pylori positive were found 86.2% and 60.6% respectively. Those prevalence were found 70% and 40.0% (respectively) in heathy persons with H. pylori seropositivity. 58 . TCNCYH 23 (3) 2003 Lu h nh kháng thể kháng H. pylori, CagA, VacA ở các bệnh nhân có bệnh dạ dày - tá tràng và ngời bình thờng không triệu chứng . Đề tài này nhằm mục tiêu tìm hiểu thêm về tỉ lệ lu h nh kháng thể kháng H. pylori, và tỉ lệ mang CagA, VacA ở các bệnh nhân có bệnh dạ dày tá tràng và