Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh cây hoa nhài nhật ( braufel dsla hopeana benth )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ……… NGUYỄN THỊ THÚY ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ NHÂN NHANH CÂY HOA NHÀI NHẬT BRUNFELDSIA HOPEANA BENTH KHÓ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

………

NGUYỄN THỊ THÚY

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY

MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ NHÂN

NHANH CÂY HOA NHÀI NHẬT

(BRUNFELDSIA HOPEANA BENTH)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

………

NGUYỄN THỊ THÚY

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY

MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ NHÂN

NHANH CÂY HOA NHÀI NHẬT

(BRUNFELDSIA HOPEANA BENTH)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền học

Người hướng dẫn:

TS LÊ XUÂN ĐẮC

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn TS

Lê Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ Trại Thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận

Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Như Toản đã có những đóng góp quý báu trong quá trình tôi thực hiện đề tài Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã truyền đạt những khiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho tôi trong suốt thời gian thực tập

Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và các bạn bè - những người luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả trong luận văn tốt nghiệp này đều là sự thực,

do tôi thu thập số liệu từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn toàn không

có sự sao chép hay bịa đặt

Hà Nội, tháng 5 năm 2012

Sinh viên

Nguyễn Thị Thúy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

4.1 Ý nghĩa khoa học 2

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Các đặc điểm tự nhiên của cây Nhài nhật 3

1.2 Tình hình sản xuất hoa cây cảnh trên thế giới và Việt Nam 4

1.3 Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng 5

1.3.1 Lược sử phát triển 5

1.3.2 Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro 9

1.3.4 Các phương pháp nhân giống in vitro 12

1.3.5 Phương pháp nhân đa chồi 16 1.3.6 Thành tựu của nuôi cấy mô tế bào thực vật 17

CHƯƠNG: 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2.1.1 Vật liệu thực vật 22

2.2.1 Dụng cụ, hóa chất 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Khử trùng mẫu 22

2.2.2 Nhân nhanh bằng phương pháp nhân đa chồi 23

2.2.3 Tạo cây Nhài Nhật in vitro hoàn chỉnh 24

2.2.4 Trồng cây trong bầu 26

2.2.5 Thu thập và xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Tạo nguyên liệu vô trùng cây Nhài Nhật 28

3.2 Tạo đa chồi 29

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Nhài Nhật 30

3.2.2 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi cây Nhài Nhật

31 3.3 Tạo cây hoàn chỉnh 32

3.3.1 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của cây Nhài Nhật

33 3.3.2 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của cây Nhài Nhật 34

3.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ MS đến sự phát triển của chồi 35

3.3.4 Ảnh hưởng của IBA trên môi trường NNE2 đến khả năng tạo rễ 36

3.3.5 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trồng trong bầu 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

1 Kết luận 38

2 Kiến nghị 38

PHỤ LỤC 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Tỷ lệ mẫu vô trùng và mẫu sống 24 Bảng 3.2: Ảnh hưởng BAP đến khả năng tạo chồi 30 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi 31

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của cây

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây Nhài Nhật tại Trại thực nghiệm sinh học 4 Hình 3.1: Mẫu vô trùng và chồi non 29 Hình 3.2: Tạo đa chồi trên môi trường NNA3 31 Hình 3.3: Tạo đa chồi trên môi trường NNB4 32 Hình 3.4: Chồi bị mô sẹo hóa trên môi trường NNC3 34 Hình 3.5: Chồi bị mô sẹo hóa trên môi trường NND2 35 Hình 3.6: Sự phát triển chồi trên môi trường NNE2 36 Hình 3.7: Sự tạo rễ trên môi trường NNF1 37

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4 D 2,4 - Dichlorophenoxy Axetic Axit

BAP 6 - Benzyl Amino Purin

CTMT Công thức môi trường

ĐC Đối chứng

IAA Indol - 3- Axetic Axit

IBA 3 - Indol Butyric Axit

K Kinetin

KTST Kích thích sinh trưởng

MS Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog

NAA α- Napthalen Axetic Axit

TB Trung bình

CS Cộng sự

Trong các loài hoa cây cảnh cây, cây Nhài Nhật (Brunfeldsia hopeana

Benth) đang được người dân quan tâm trồng nhiều như là cây hoa cảnh có giá trị Cây Nhài Nhật có hình dáng cây và hoa hai màu rất đẹp , được nhiều người yêu thích vì vẻ đẹp mộc mạc và hương thơm ngọt ngào của những bông hoa tím trắng Cây Nhài Nhật mới chỉ được trồng ở Hà Nội và

Đà Lạt với quy mô nhỏ lẻ, chưa đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của người dân

Hiện nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, thì kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nhân nhanh, phục tráng cây trồng, chọn tạo giống chống chịu các bất lợi của môi trường, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao và nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao Kĩ thuật nuôi cấy

mô và tế bào thực vật cho phép nhân nhanh một lượng lớn cây giống trong ống nghiệm trong thời gian ngắn nhằm tạo ra một quần thể cây con có chất lượng đồng đều về mặt di truyền

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật

nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh cây hoa Nhài Nhật

2 Mục tiêu đề tài

Xác định các điều kiện môi trường thích hợp để nhân nhanh cây hoa

Nhài Nhật trong ống nghiệm

3 Nội dung nghên cứu

- Xác định phương pháp khử trùng mẫu để đưa vào ống nghiệm

-Xác định môi trường thích hợp để tạo đa chồi cây Nhài Nhật

-Xác định môi trường thích hợp để tạo rễ cây Nhài Nhật

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Góp phần nghiên cứu khả năng nhân nhanh cây hoa Nhài Nhật bằng kỹ

thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Ứng dụng để nhân nhanh hàng loạt cây con để phục vụ và đáp nhu cầu thị trường hoa cây cảnh

5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại : Trại thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ

sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Thời gian: Từ tháng 5/2011 đến 5/2012

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các đặc điểm tự nhiên của cây Nhài nhật

Tên tiếng Việt: Lài nhật, Lài hai màu, Cà hoa xanh

Tên tiếng Anh: Manaca Rain-tree

Tên Khoa Học: Brunfeldsia hopeana Benth

Họ: Solanaceae

Nguồn gốc xuất xứ: Brazil

Phân bố ở Việt Nam: Vùng núi Trung Bộ

Đặc điểm hình thái : Cây gỗ nhỏ, phân cành nhánh nhiều, dài, mọc thẳng, dạng bụi, vỏ thân nứt dọc, nhẵn Lá thuôn hình giáo, màu xanh đậm, bóng nhẵn, mép nguyên Hoa mọc ở nách lá hay ngọn cây, có mùi thơm, hay

nở vào ban đêm, cũng có khi nở rộ vào giữa trưa, hoa đơn độc hay tập trung

2 - 3 chiếc ở đầu cành, có cuống ngắn, cánh tràng hợp thành ống rộng, trên chia 5 thuỳ tròn xoè ra trên mặt phẳng, lúc mới nở màu tím sau chuyển dần sang màu trắng Trên một cây, hoa non và già lẫn lộn nên làm cho cụm hoa

có màu sắc thay đổi

Đặc điểm sinh lý , sinh thái: Tốc độ sinh trưởng trung bình Cây Nhài Nhật ưa khí hậu mát , ẩm, nhiều nắng Càng hạn cây ra hoa càng nhiều , ra hoa quanh năm

Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 20- 330C, nhiệt độ thấp 8-100

C cây sinh trưởng kém Nhài nhật ưa sáng do đó cần trồng nơi thoáng, rộng, không bị che bóng mới cho năng suất cao và hoa mới thơm Nhài sống được trên nhiều loại đất khác nhau như: đất đồng bằng trung tính (pH từ 6,5 - 7), đất đồi núi hơi chua (pH từ 3,5 - 4), đất thịt nặng, đất thịt pha cát Nhài Nhật

cần nước để sinh trưởng và ra hoa liên tục nhưng không chịu úng do đó cần trồng nơi cao ráo, tưới tiêu thuận lợi

Nhài Nhật là một loài hoa đặc biệt có khả năng thay đổi màu sắc từ lam tím sang trắng Nhài Nhật được trồng phổ biến ở Hà Nội và Đà Lạt, được giới chơi hoa cây cảnh rất yêu thích Là loại cây dễ trồng, phù hợp với điều kiện nước ta, chỉ cần đất đồng bằng trung tính, đất đồi núi hơi chua, đất thịt nặng, đất thịt pha cát, thoát nước là có thể phát triển tốt Nó không đòi hỏi tốn công chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao nhưng lại mang giá trị kinh tế cao cho người trồng

Hình 1.1: Cây Nhài Nhật tại Trại thực nghiệm sinh học

1.2 Tình hình sản xuất hoa cây cảnh trên thế gới và Việt Nam

Trong những tháng đầu năm 2009, kim ngạch xuất khẩu hoa các loại sang thị trường Nhật Bản đạt khá cao Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải quan, kim ngạch xuất khẩu hoa tươi, hoa khô và các loại lá trong tháng 3/2009 đạt hơn 1 triệu USD, tăng 36% so với tháng trước và tăng tới 54,1%

so với cùng kỳ năm 2008 Tính chung 3 tháng đầu năm 2009, kim ngạch xuất khẩu hoa các loại đạt hơn 2,3 triệu USD, tăng 35% so với cùng kỳ 2008 Xuất

khẩu hoa các loại tiếp tục tăng cao trong 10 tháng năm 2010 với kim ngạch đạt 11,5 triệu USD, tăng 37,9% [36]

Số liệu điều tra về tình hình phát triển hoa của Hà Nội những năm gần đây cho thấy tỷ lệ diện tích trồng hoa các loại ngày càng tăng lên không ngừng qua các năm Những vùng sản xuất hoa các loại có thể kể đến: Đà Lạt,

Hà Nội, Hải Phòng, Lào Cai, Thành phố Hồ Chí Minh, trong đó Đà Lạt là nơi

lý tưởng cho việc sinh trưởng và phát triển hầu hết các loại hoa [36]

Bên cạnh đó, với địa hình đồi núi cao, chia cắt mạnh đã tạo nên những tiểu vùng khí hậu nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới, hoa là cây trồng đang trở thành ưu thế trong sản xuất nông nghiệp tại tỉnh Lào Cai Lào Cai có 97,5ha hoa các loại, đạt giá trị 16.033 triệu đồng, vùng trồng hoa tập trung tại thị xã Lào Cai và huyện Bảo Thắng [36]

Theo chương trình phát triển sản xuất hoa của Bộ nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, đến năm 2010, Việt Nam sẽ xuất khẩu 1 tỷ cành hoa các loại trong đó hoa hồng, cúc và phong lan chiếm 85% Theo chương trình này diện tích trồng hoa của cả nước sẽ đạt 8.000ha cho sản lượng 4,5 triệu cành Doanh thu từ xuất khẩu hoa đạt 60 triệu USD [33]

Để đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ hoa trong nước cũng như trên thế giới đòi hỏi các nhà sản xuất hoa của Việt Nam phải có kế hoạch đầu tư

và phát triển một cách thích hợp, đặc biệt là trong công tác chọn tạo giống

và nhân giống… công nghệ đóng gói bảo quản để nâng cao năng xuất chất lượng hoa

1.3 Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng

1.3.1 Lược sử phát triển

Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn 100 năm phát triển Ngày càng có nhiều ứng dụng và làm sáng tỏ lý thuyết về tính toàn

năng của tế bào Có thể thấy sự phát triển của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật luôn song song với lịch sử các ngành khoa học sự sống khác Các giai đoạn chính của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [1], [6], [8], [12]

- Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Schleiden và Schwann đã đề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là thuyết tế bào và nêu rõ:

+ Mọi cơ thể sống đều cấu tạo từ một hoặc nhiều tế bào

+ Tế bào là đơn vị cấu trúc chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức nhỏ nhất của sự sống

+ Tế bào chỉ được tạo ra từ tế bào trước đó

- Người đầu tiên là Haberlandt (1898) đề xuất ra lý thuyết về tính toàn năng của tế bào, ông cũng là người đầu tiên đưa ra các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm Ông đã đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào

Theo ông, mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Vì vậy, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Haberlandt đã nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng chưa thành công

- Đến năm 1922, Robbins và Kotte đã thành công trong nuôi cấy đầu rễ cây hòa thảo kéo dài 12 ngày trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng, glucose

- Năm 1934, White (Mỹ) đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cây cà chua với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men Sau đó ít lâu White đã chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Piridoxin (B6), axit

nicotinic Cùng năm, Gautheret thành công trong việc nuôi cấy mô tách từ mô

thượng tầng của cây Salic apraea và cây Populus nigra Mô nuôi cấy đã phân

chia liên tục trong môi trường Knop bổ sung glucose và cysteinhyochloride

- Went và Thimann (1937) đã phát hiện ra chất sinh trưởng thực vật đầu tiên là axit β-indolaxetic (IAA) tác động lên quá trình phân chia tế bào

và hình thành rễ

- Năm 1938 Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng với thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạch bằng cách cấy chuyển đều đặn 6 tuần/lần

- Năm 1941, Overbeck (Mỹ) chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà Trong thời gian này, nhiều chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công như: α-napthyl axetic axit (NAA), và 2,4 Dichlorophenoxy axetic axit (2,4-D) Nhiều tác giả đã nhận thấy cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công

ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy

- Năm 1954, Skoog đã phát hiện ra Kinetin (6 furfuryl-amino-purin) là chất điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi Sau này người ta cũng tìm thấy Zeatin tách từ mầm ngô có hoạt tính tương tự Kinetin Cả 2 chất này đều thuộc nhóm Cytokinin

- Năm 1960, Bergman đã phát triển kĩ thuật nuôi cấy tế bào đơn lên một bước mới là tạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kĩ thuật gieo trải tế bào thực vật trên đĩa thạch như trải tế bào vi sinh vật Cũng năm 1960, Cooking

đã dùng men cellulase để phân hủy cellulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào trần (protoplast)

- Guha và Maheswari (1964) công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược

- Bourgin và Nitsch (1967), Nakata (1968) tạo thành công cấy đơn bội từ bao phấn thuốc lá, mở ra nhiều triển vọng ứng dụng tạo cây đơn bội vào công tác giống và nghiên cưu di truyền

- Đến năm 1971, Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast thuốc lá giống Xanthi

- Melchers (1977) lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây

- Năm 1985 cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố

- Năm 1994 là năm đánh dấu cây cà chua đầu tiên (cà chua Flav’rSav’r)

có mặt trên thị trường thực phẩm Hoa Kì Cùng năm 1994 giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào sản xuất đại trà tại Na Uy

Đến nay đã có hàng trăm loài cây được nuôi cấy mô thành công với

nhiều mục đích khác nhau như nhân nhanh, bảo tồn in vitro, nuôi cấy bao

phấn… Đặc biệt, nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô và chuyển gen thông qua giai đoạn

mô sẹo và tái sinh tạo chồi mà nhiều giống cây trồng chuyển gen đã được tạo

ra (cà chua, lúa, đậu tương, khoai tây, bông, đu đủ…) [12]

1.3.2 Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902 Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng

rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào Như vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng Đây là một điểm rất quan trọng bởi vì trên cơ sở đơn vị mô,

tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện những kĩ thuật tiên tiến cho việc lựa chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng [1], [10]

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro

Mẫu nuôi cấy

Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của việc lựa chọn mẫu cấy thích hợp, điều quan trọng cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm: kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu

+ Kiểu gen: Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy Với loài thuốc lá được sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lồi Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng

và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cây cà chua

+ Cơ quan: Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có

khả năng sử dụng để nuôi cấy invitro Mẫu nuôi cấy in vitro khác nhau ở các

loài khác nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy Theo Doerschung

và Miller (1976) cho rằng: chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt

+ Tuổi và tuổi sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa và của tuổi sinh lý Có nhiều nghiên cứu khác nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi

cấy Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già

+ Mẫu in vitro: Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng

hay trong vườn ươm như cây Azalea

+ Sức sống của mẫu: Điều cần nhận thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất

quan trọng đến nuôi cấy in vitro, cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là

đối với những cây bị bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn mẫu cây bị bệnh được nhân lên [10]

Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là từ 20-27o

C Theo Murashige (1974) nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng và phát hấp hay hình thành tế bào cơ quan

Cường độ ánh sáng: Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng

trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây lá xanh Ảnh

hưởng của ánh sáng có liên hệ đến các loài, có loài chịu ánh sáng cao, có loài

chịu ánh sáng thấp hay tối, có loài chịu ánh sáng trung bình Việc nuôi cấy in

vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng từ 1000-3000lux [9]

Môi trường nuôi cấy

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô tế bào là rất cần thiết Vì mỗi loại cây trồng khác nhau đều cần một hàm lượng chất dinh dưỡng khác nhau Mặt khác môi trường cũng thay đổi tùy thuộc vào sự phân hóa của mô cấy, tùy theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo chồi hay tái sinh cây hoàn chỉnh Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy hoặc thăm dò một số môi trường đã cho để xác định môi trường cho mẫu nuôi cấy

Chất kích thích sinh trưởng (KTST)

Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò rất quan trọng trong kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Bằng cách cung cấp các chất kích thích ở một mức hợp lý thì chúng ta có thể điều khiển được quá trình phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy Auxin và cytokinin là hai nhóm chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất hiện nay

Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác trong môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với nhóm cytokinin Sự áp dụng loại và nồng

độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

+ Kiểu tăng trưởng và phát triển của mẫu cần nghiên cứu

+ Hàm lượng auxin nội sinh có trong mẫu nuôi cấy

+ Sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và auxin ngoại sinh

Đặc tính của Auxin

Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Đặc điểm chung của các auxin là kích thích sự phân chia tế bào Các hoocmon của nhóm này có các hoạt tính như tăng trưởng chiều dài thân, gióng, tính hướng đất, tính ưu thế ngọn và phân hóa mạch dẫn

auxin cũng kích thích sự hình thành rễ bất định và sự giãn của tế bào làm cho kích thước tế bào tăng lên Các auxin thường liên quan đến độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật, auxin được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ

Những Auxin được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật:

+ IAA (Indol-3-Axetic Axit)

+ NAA (α-Naptalen Axetic Axit)

+ 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxy Axetic Axit)

Đặc tính của Cytokinin

Cytokinin là hoocmon phân bào, là dẫn xuất của Ađênin, có ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là: + BAP (6-Benzyl Amino Purin)

+ Kinetin (N-(2-Furfurylamin)-1-H-6- Amin)

+ Zeatin

Hàm lượng của các loại cytokinin có tác dụng kích thích từ rễ đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh mẽ sự tạo thành rễ của chồi nuôi cấy Trong các loại cytokinin nói trên thì BAP và Kinetin là hai loại hay được sử dụng nhiều nhất

Ngoài hai nhóm auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô tế bào thực vật người ta cũng sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào, qua

đó làm tăng kích thước của chồi nuôi cấy GA (Gibberellic axit) là loại gibberellin được sử dụng thường xuyên nhất Tuy nhiên, GA vẫn mẫn cảm với nhiệt độ, nó mất hoạt tính đến 90% sau khi hấp vô trùng Vì vậy, muốn sử dụng GA ta thường phải lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó đưa vào môi trường nuôi cấy [14]

1.3.4 Các phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kĩ thuật nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành,chiết cành, ghép cành, tách dòng… Nhân giống in

vitro hay vi nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn lĩnh vực ứng dụng

cây quý, sản xuất và chuyển hóa sinh học các hợp chất tự nhiên và cải biến về mặt di truyền các giống cây trồng) và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình và CS, 1997) Cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng thành công để nhân nhanh và bảo tồn trong ống nghiệm nhiều loại cây trồng khác nhau (Lê Xuân Đắc và CS, 2005; Lưu Trường Sinh và CS, 2005)

Có ba phương thức để tạo cây in vitro:

a Hoạt hóa chồi nách

Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ Theo phương pháp này thì

sự hoạt hóa của chồi nách diễn ra theo hai cách:

- Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi cấy loài cây hai lá mầm như khoai tây, hoa cúc, cây thuốc lá,… )

- Cách 2: Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra với cây một lá mầm như lúa, mía…)

c Tạo phôi vô tính

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình hành từ các tế bào

soma gọi là phôi vô tính Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện hai

quá trình phân hóa và quá trình phản phân hóa để tách các tế bào soma hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển của mô sẹo

Sự hình thành phôi trải qua hai bước chính:

Bước 1: Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi Trong quá

trình này cần môi trường giàu auxin, vì auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các tế bào phôi, đồng thời nó còn giúp kích thích cho quá trình phát triển số lượng tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào Các tế bào có khả năng phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein và ARN thông tin

Bước 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành Môi trường nuôi cấy

của giai đoạn này phải nghèo hoặc không có Auxin, với nồng độ Auxin cao kích thích sự tạo thành phôi nhưng ức chế quá trình phân hóa và quá trình phát triển tiếp theo của phôi này Như vậy, với nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lý là rất quan trọng để có các phản hồi thích hợp Nếu nồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng, nếu nồng độ cao quá sẽ gây ức chế hoặc gây độc[9]

Các bước chính trong nhân giống in vitro

Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm

các bước sau:

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ

(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và đang ở giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng bệnh hợp lý sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh

trưởng khi tra đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng mẫu, giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tăng tỷ lệ mẫu tái sinh, mô tồn tại, sinh trưởng và phát triển tốt Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển tốt của cây Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách, đỉnh chồi hoa

và sau đó là đoạn thân, mảnh lá

Bước 3: Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh

số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo phôi vô tính, tạo chồi bất định… Vấn đề là cần xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắc chung, môi trường

có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi (auxin/cytokinin < 1: thì kích thích tạo chồi) Chế độ nuôi cấy thường là 25-27oC và 16h chiếu sáng/ngày, cường

độ ánh sáng 2000-3000lux Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy khác nhau đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi người ta cấy chuyển sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường được bổ sung thêm một lượng nhỏ auxin Một số loại

cây có thể phát sinh rễ ngay cả khi ta không bổ sung auxin

Bước 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm

Để đưa được cây ra bên ngoài vườn ươm phát triển tốt ta cần phải đảm bảo một số yêu cầu sau:

- Cây đảm bảo về chiều cao, số rễ, số lá

- Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt

- Phải điều chỉnh độ ẩm, chế độ chiếu sáng vườn ươm, cũng như chế độ dinh dưỡng thích hợp

1.3.5 Phương pháp nhân đa chồi

Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi ngọn và các chồi bên từ các nách lá cấy vào môi truờng có chứa cytokinin với nồng độ cao Vai trò của cytokinin lúc này là ức chế quá trình ưu thế ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển Các chồi bên này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới có bổ sung cytokinin để tiếp tục tạo ra các chồi khác Sau đó các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh

Phương pháp có ý nghĩa quan trọng trong thực tế vì:

- Phương pháp này đơn giản hơn so với các phương pháp khác

- Tốc độ nhân giống cao

- Các cây đồng đều về mặt di truyền

- Cây con tăng trưởng rất tốt

Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi:

- Hàm lượng cytokinin (loại và nồng độ)

- Nhu cầu về nồng độ cytokinin thay đổi theo từng giai đoạn nuôi cấy, những

mô cấy còn non thì cần ít cytokinin hơn các mẫu đã trưởng thành

- Thông thường trong quá trình tạo chồi, người ta sử dụng auxin với nồng

độ thấp phối hợp cùng cytokinin ở nồng độ cao, tỷ lệ auxin/cytokinin

- Không nên cảm ứng sự tạo thành mô sẹo với nồng độ Cytokinin quá cao vì

có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến