5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
1.3.5. Phương pháp nhân đa chồi
Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi ngọn và các chồi bên từ các nách lá cấy vào môi truờng có chứa cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là ức chế quá trình ưu thế ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển. Các chồi bên này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới có bổ sung cytokinin để tiếp tục tạo ra các chồi khác. Sau đó các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh.
Phương pháp có ý nghĩa quan trọng trong thực tế vì: - Phương pháp này đơn giản hơn so với các phương pháp khác. - Tốc độ nhân giống cao.
- Các cây đồng đều về mặt di truyền. - Cây con tăng trưởng rất tốt.
Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi: - Hàm lượng cytokinin (loại và nồng độ).
- Nhu cầu về nồng độ cytokinin thay đổi theo từng giai đoạn nuôi cấy, những mô cấy còn non thì cần ít cytokinin hơn các mẫu đã trưởng thành.
- Thông thường trong quá trình tạo chồi, người ta sử dụng auxin với nồng độ thấp phối hợp cùng cytokinin ở nồng độ cao, tỷ lệ auxin/cytokinin thường 1/10.
- Đôi khi nên để chồi ngọn phát triển trước khi tăng nồng độ cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi bên.
- Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắt bỏ ngọn của chồi để các chồi bên phát triển.
- Không nên cảm ứng sự tạo thành mô sẹo với nồng độ Cytokinin quá cao vì có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến.
Nguyễn Thị Thúy 27 K34E Sinh - KTNN
- Trong một số trường hợp có thể kích thích sự tạo thành chồi bên bằng cách cấy vào môi trường lỏng. Môi trường lỏng này cần lắc hay không lắc tùy thuộc vào cây được làm thí nghiệm.
- Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh trưởng sinh khối bị thay đổi.
Hiện nay, nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp dụng cho nhiều loài thực vật, quy trình nhân chồi thường được thực hiện theo các bước như sau [7]:
Sơ đồ tổng quát nhân nhanh trong phòng thí nghiệm
1.3.6. Thành tựu của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trở thành một trong những phương thức quan trọng để nhân nhanh, đặc biệt là đối với những cây khó nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống. Đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng thành công trong việc nhân nhanh các loài thực vật cho các mục đích như: chuyển gen, nhân giống để bảo tồn các giống quý….
Trong nƣớc:
Tác giả Nguyễn Thanh Danh và cs (2005) đã nghiên cứu thành công nhân nhanh in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte) ở VQG Cúc Phương, nghiên cứu này đã sử dụng phôi hạt xanh của quả Vù hương để nuôi cấy và tạo đa chồi bằng kỹ thuật tách phôi hạt xanh, các cây có nguồn
Trồng cây ngoài tự nhiên
Trồng cây trong bầu
Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Nhân đa chồi
Khử trùng mẫu
Nguyễn Thị Thúy 28 K34E Sinh - KTNN
gốc từ nuôi cấy mô đã được trồng trở lại rừng tự nhiên và cây con phát triển bình thường. Cây Vù hương có tên trong danh sách các loài bị đe dọa ở Việt Nam [2].
Tác giả Hoàng Thị Nga (2011), nghiên cứu xây dựng thành công quy trình nhân nhanh cây hoa Đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [11].
Những nghiên cứu của Trần Văn Minh và cs cũng đã thành công trong việc nhân giống và bảo tồn nhiều loài cây quý hiếm như: Cây Trầm hương, cây Giá tỵ (Tectona grandis Linn F) và cây Lát hoa Côn Đảo (Chukrasia tabularis A. Juss). Thành công trong việc nhân giống in vitro cây Trầm hương có ý nghĩa hết sức to lớn, nó cho phép phục hồi, phát triển cho những khu vực trồng Trầm hương thuận lợi. Hơn thế nữa, việc sử dụng cây giống có nguồn gốc từ nuôi cấy mô có chất lượng cao sẽ giúp cho người trồng rừng Trầm hương tốt và đồng nhất về kiểu gen [11], [9].
Tác giả Nguyễn Thị Quỳnh và cs (2003) đã nuôi cấy cây Lõi thọ (Gmelina arborea Roxb) bằng phương pháp quang tự dưỡng. Đặc diểm chính của phương pháp này là không sử dụng đường, vitamin và hạn chế sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong môi trường nhân giống. Đồng thời tạo điều kiện tối đa cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng khí CO2 có sẵn trong không khí làm nguồn cacbon chính cho quá trình tăng trưởng và phát triển của cây. Cây Lõi thọ đã phát triển rất tốt trong điều kiện quang tự dưỡng [13].
Viện nghiên cứu và bảo tồn nguồn gen ở VQG Bạch Mã đã nghiên cứu thành công và bảo tồn một số loài quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng như:
Nguyễn Thị Thúy 29 K34E Sinh - KTNN
- Hoàng Đàn giả (Dacrydyum elatum (Roxb) Wallich ex Hooker) là đối tượng quý hiếm có trong sách đỏ Việt Nam, phân bố trên các đỉnh núi cao ở VQG Bạch Mã.
- Cây Hồi hoa nhỏ (Illicium parvifolium Merr) là loài thực vật quý hiếm có trong sách đỏ Việt Nam, thuộc dạng nguy cấp. Đây là loài có giá trị trong sản xuất tinh dầu hồi, đã có chương trình khoanh vùng bảo vệ nghiêm ngặt những khu vực có sự phân bố của cây này theo hướng bảo tồn in situ ở VQG Bạch Mã [7].
- Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L) được sử dụng như là một vị thuốc trong việc phòng và chữa trị một số loại ung thư. Cây Trinh nữ hoàng cung có củ giống củ hành, chùm hoa giống chùm hoa cây láng trắng, thường được trồng làm cảnh hoặc làm thuốc. Trong lĩnh vực làm thuốc, người ta dùng lá cây Trinh nữ hoàng cung thái nhỏ rồi sao vàng sắc uống để đề phòng và chữa trị ung thư tử cung, u tiền liệt tuyến. Tác giả Lưu Trường Sinh và cs đã nhân giống thành công cây Trinh nữ hoàng cung theo phương pháp
in vitro có chất lượng tương đương với cây trồng theo phương pháp truyền thống [16].
- Berberin được chiết xuất từ cây Hoàng liên gai (Berberis wallichiama
DC) để làm thuốc điều trị các bệnh đường ruột và đau mắt hột nhưng do khai thác quá mức nguồn nguyên liệu này trong tự nhiên đã bị cạn kiệt. Vì vậy, các nhà khoa học Viện công nghệ sinh học đã lấy quả xanh của cây Hoàng liên gai ở vùng núi Sapa, tách lấy phôi và đưa vào nuôi cấy đẻ tạo mô sẹo và thu sinh khối. Sau một thời gian ngắn, sinh khối thu được từ rễ cây Hoàng liên gai tăng gấp 10 lần so với số lượng mẫu ban đầu. Đặc biệt khối mô tế bào này chứa berberin có chất lượng tương đương với rễ cây Hoàng liên gai trong tự nhiên. Vì vậy các kết quả nghiên cứu thành công này của Viện Công nghệ sinh học (Viện khoa học và công nghệ Việt Nam) không chỉ giúp các cơ quan
Nguyễn Thị Thúy 30 K34E Sinh - KTNN
sản xuất chủ động nguồn dược liệu mà còn góp phần bảo tồn nguồn gen cây thuốc quý của nước ta [1] [2].
Thế giới:
- Tác giả Pereira AM và cs (2003) đã nhân và bảo tồn cây thuốc
Anemopaegma arvense, nghiên cứu này đã nuôi cấy để bảo tồn cây A. arvense
trong ống nghiệm trên môi trường MS có chứa 4% đường sorbitol, kết quả cho thấy sau 6 tháng mới cần phải cấy chuyển một lần [31].
- Các nhà khoa học Đức đã ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong việc phục tráng và nhân giống một số loài thuộc chi Grevillea, trong đó có một số loài gần như là tuyệt chủng: Grevillea scapgera, Grevillea banksii, Grevillea batrachioides [27].
- Tác giả Joshi và cs đã nhân giống thành công giống cây Saussurea obvallata, một loại dược thảo quý hiếm bằng việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật . Sau thời gian 15 ngày nuôi cấy và 12 ngày thích nghi với điều kiện môi trường bên ngoài có 66,7% cây đã thích nghi với môi trường tự nhiên [25].
- Các nhà khoa học Ấn Độ đã xây dựng thành công quy trình tái sinh một số giống tre quý như: Dendrocalamus asper (tre Mạnh tông), Bambusa multiplex (cây Hóp) thông qua nuôi cấy hạt hoặc chồi bên [30].
- Năm 2003, Bedir E và cs đã nhân giống in vitro thành công giống
Hydrastis canadensis, một loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng ở miền Bắc nước Mỹ [21].
- Gần đây các tác giả Balaraju và cs (2008) cũng đã nhân giống và tái sinh
in vitro thành công cây thuốc Vitex agnuscastus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường 1/2 MS có bổ sung 0,1mg/l IBA [20].
Nguyễn Thị Thúy 31 K34E Sinh - KTNN
- Các tác giả Nishritha B và cs (2008) đã nhân giống in vitro thành công loài Asparagus racemosus Willd, đem lại nhiều giá trị kinh tế lớn. Cùng năm đó Mukherjee và cs cũng đã nhân giống in vitro loài Aloevera sp[29].
- Bên cạnh đó tác giả Park SU và cs (2009) cũng đã tái sinh thành công loài Rehmanniaglutinosa Lquý hiếm đang bị khai thác quá mức [30].
- Ngoài ra vẫn còn nhiều loại cây dược liệu quý hiếm khác cũng đã được nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen trong ống nghiệm như: Lawsonia inermis Linn, Saussurea lappa… [22].
Nguyễn Thị Thúy 32 K34E Sinh - KTNN
CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU