Xây dựng mô hình nuôi cấy in vitro tế bào đơn nhân được phân lập từ máu ngoại vi của người (2)

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC XÂY DỰNG MƠ HÌNH NI CẤY IN VITRO TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ MÁU NGOẠI VI CỦA NGƢỜI Cơ quan chủ trì nhiệm vụ : Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc TP.HCM Chủ trì nhiệm vụ: TS Nguyễn Thị Minh Thuận Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ XÂY DỰNG MƠ HÌNH NI CẤY IN VITRO TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ MÁU NGOẠI VI CỦA NGƢỜI (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày ) Cơ quan chủ quản Chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) (ký tên) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI TS Nguyễn Thị Minh Thuận SV Lê Thị Thảo Nguyên MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG iii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng - TỔNG QUAN Y VĂN Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .8 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất - thuốc thử 2.2.1 Thiết bị 2.2.2 Dụng cụ 10 2.2.3 Hóa chất – thuốc thử .10 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu .11 2.3.1 Dược liệu 11 2.3.2 Điều chế cao toàn phần ethanol 96% 11 2.3.3 Phân lập PBMCs .11 2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng dung môi DMSO lên tăng sinh in vitro PBMCs thử nghiệm MTT 12 2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng cao toàn phần ethanol tăng sinh in vitro PBMCs thử nghiệm MTT .13 2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng cao chiết phân đoạn tăng sinh in vitro PBMCs thử nghiệm MTT .14 2.3.7 Phân tích thống kê 15 Chƣơng - Kết VÀ BÀN LUẬN 16 3.1 KẾT QUẢ 16 3.1.1 Dược liệu 16 3.1.2 Khảo sát độc tính DMSO PBMCs 18 3.1.3 Kết khảo sát ảnh hưởng cao chiết dược liệu toàn phần tăng sinh in vitro PBMCs 19 3.1.4 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật dược liệu có hoạt tính tăng sinh in vitro PBMCs 27 3.1.5 Quy trình chiết cao phân đoạn phương pháp lắc phân bố lỏng – lỏng 27 3.1.6 Kết khảo sát ảnh hưởng cao chiết phân đoạn tăng sinh in vitro PBMCs 29 3.1.7 Phân tích sơ thành phần cao phân đoạn .34 3.2 BÀN LUẬN .36 3.2.1 Độc tính DMSO PBMCs 36 3.2.2 Thử nghiệm MTT để đánh giá tác động cao chiết tăng sinh in vitro PBMCs 37 3.2.3 Đánh giá phân đoạn cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs 38 Chƣơng - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .40 4.1 KẾT LUẬN 40 4.2 KIẾN NGHỊ .40 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ tắt Từ nguyên AND Acid deoxyribonucleic CL Chloroform DĐVN V Ý nghĩa tiếng Việt Cloroform Dược điển Việt Nam V EA Ethyl acetate Ethyl acetat EC50 Effective concentration of 50% Nồng độ hiệu 50% IC50 Inhibition concentration of 50% Nồng độ ức chế 50% Mơi trường ni cấy hồn chỉnh MTNCHC MTT dye – [4,5 – dimethylthiazol – –yl] – 2, – diphenyl tetrazolium bromide OD Optical density Mật độ quang PBMCs Peripheral blood mononuclear cells Tế bào đơn nhân máu ngoại biên PHA Phytohemagglutinin RPMI – 1640 Roswell Park Memorial Institute medium 1640 TP Môi trường RPMI - 1640 Tồn phần DANH MỤC HÌNH Hình 3-1 Độc tính DMSO PBMCs 19 Hình 3-2 Ảnh hưởng cao cam thảo bắc toàn phần lên tăng sinh PBMCs 20 Hình 3-3 Ảnh hưởng cao muồng trâu tồn phần lên tăng sinh PBMCs .20 Hình 3-4 Ảnh hưởng cao sài đất toàn phần lên tăng sinh PBMCs .21 Hình 3-5 Ảnh hưởng cao hồng kỳ toàn phần lên tăng sinh PBMCs 21 Hình 3-6 Ảnh hưởng cao trầu khơng tồn phần lên tăng sinh PBMCs 22 Hình 3-7 Ảnh hưởng cao tơ mộc tồn phần lên tăng sinh PBMCs 22 Hình 3-8 Ảnh hưởng cao trà xanh toàn phần lên tăng sinh PBMCs 23 Hình 3-9 Ảnh hưởng cao kim ngân hoa tồn phần lên tăng sinh PBMCs 23 Hình 3-10 Ảnh hưởng cao ngũ gia bì chân chim tồn phần lên tăng sinh PBMCs 24 Hình 3-11 Ảnh hưởng cao vàng đắng tồn phần lên tăng sinh PBMCs .24 Hình 3-12 Ảnh hưởng cao đương quy toàn phần lên tăng sinh PBMCs 25 Hình 3-13 Ảnh hưởng cao ngưu tất nam toàn phần lên tăng sinh PBMCs 25 Hình 3-14 Ảnh hưởng cao thảo minh tồn phần lên tăng sinh PBMCs 26 Hình 3-15 Ảnh hưởng phân đoạn cao hoàng kỳ lên tăng sinh PBMCs 29 Hình 3-16 Ảnh hưởng phân đoạn cao cam thảo bắc lên tăng sinh PBMCs 30 Hình 3-17 Ảnh hưởng phân đoạn sài đất lên tăng sinh PBMCs 30 Hình 3-18 Ảnh hưởng phân đoạn tô mộc lên tăng sinh PBMCs 31 Hình 3-19 Ảnh hưởng phân đoạn ngũ gia bì chân chim lên tăng sinh PBMCs 31 Hình 3-20 Ảnh hưởng phân đoạn muồng trâu lên tăng sinh PBMCs 32 Hình 3-21 Ảnh hưởng phân đoạn kim ngân hoa lên tăng sinh PBMCs 32 Hình 3-22 Ảnh hưởng phân đoạn trầu không lên tăng sinh PBMCs .33 i DANH MỤC BẢNG Bảng 1-1 Một số dược liệu có hoạt tính ức chế miễn dịch Bảng 1-2 Một số dược liệu có hoạt tính tăng sinh miễn dịch Bảng 1-4 Thành phần hóa học tác dụng dược lý dược liệu nghiên cứu .6 Bảng 2-1 Đặc điểm người tình nguyện cho máu .8 Bảng 2-2 Danh mục dược liệu sử dụng nghiên cứu Bảng 3-1 Kết thử độ ẩm mẫu bột dược liệu 16 Bảng 3-2 Kết thử độ tro toàn phần mẫu bột dược liệu 16 Bảng 3-3 Hiệu suất chiết cao cồn toàn phần 17 Bảng 3-4 Độc tính DMSO PBMCs 18 Bảng 3-5 Phân nhóm tác động cao cồn tồn phần dược liệu lên tăng sinh in vitro PBMCs theo kết thử nghiệm MTT 26 Bảng 3-6 Kết hóa sơ thành phần hóa thực vật dược liệu 27 Bảng 3-7 Bảng tổng kết giá trị IC50 EC50 cao phân đoạn tăng sinh in vitro PBMCs 33 Bảng 3-8 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật phân đoạn dược liệu kích thích 34 Bảng 3-9 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật phân đoạn cao dược liệu ức chế PBMCs 35 Bảng 3-10 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật phân đoạn cao dược liệu ức chế PBMCs 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh lý liên quan đến rối loạn hệ miễn dịch ngày phổ biến Ngun nhân tình trạng suy giảm miễn dịch đáp ứng miễn dịch mức cần thiết Hiện nay, việc điều trị trường hợp bệnh lý suy giảm miễn dịch bệnh tự miễn chủ yếu sử dụng thuốc Tây Y Tuy nhiên, việc sử dụng kéo dài thuốc đem đến bất lợi đáng kể cho bệnh nhân tác dụng phụ thuốc, giá vấn đề cần cân nhắc khả sử dụng thuốc dài hạn Trong dân gian, nhiều thuốc sử dụng dược liệu Y học cổ truyền người dân sử dụng từ hàng ngàn năm qua điều trị bệnh lý liên quan đến bất thường hệ miễn dịch Việc sử dụng dược liệu Y học cổ truyền mang lại lợi ích định cho bệnh nhân giảm tác dụng phụ sử dụng thuốc cách đáng kể so sánh với dùng thuốc Tân dược Điều mở hướng nghiên cứu đầy tiềm cho Dược học đại đa dạng có sẵn nguồn nguyên liệu dược liệu Hiện nay, giới có nhiều nghiên cứu nhằm tìm hiểu, đánh giá tính hiệu dược liệu điều trị bệnh liên quan đến hệ thống miễn dịch Các nghiên cứu có quy mơ từ in vitro in vivo, thực nhằm đánh giá hiệu dược liệu có nguồn gốc tự nhiên tăng sinh, hoạt hóa tế bào miễn dịch ức chế, giảm hoạt tính chúng Một mơ hình sử dụng rộng rãi mơ hình in vitro nuôi cấy tế bào miễn dịch đơn nhân phân lập từ máu ngoại vi người để thử hoạt tính làm tăng sinh ức chế miễn dịch dược liệu Với mong muốn tìm kiếm dược liệu có khả kích thích ức chế tăng sinh tế bào lympho miễn dịch để ứng dụng điều trị, thực đề tài “Sàng lọc dƣợc liệu tác động tăng sinh in vitro tế bào đơn nhân đƣợc phân lập từ máu ngoại vi ngƣời” với mục tiêu cụ thể sau: Khảo sát tác động loại cao chiết toàn phần số dược liệu tăng sinh in vitro tế bào lympho máu ngoại vi người Khảo sát tác động cao chiết phân đoạn dược liệu chọn tăng sinh in vitro tế bào lympho máu ngoại vi người Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 30 Cam thảo bắc (CTB) Hình 3-16 Ảnh hƣởng phân đoạn cao cam thảo bắc lên tăng sinh PBMCs Nhận xét: Cao cam thảo bắc phân đoạn cloroform (CT – CL) nồng độ 10 ppm làm tăng 28,06% tỷ lệ tế bào sống so với nhóm chứng (p < 0,0001); nồng độ 50, 100, 200 ppm làm giảm tỷ lệ tế bào sống 44,2; 84,55 78,06% so với nhóm chứng (p < 0,0001) Cao cam thảo bắc phân đoạn ethyl acetat (CT – EA) nồng độ 50 ppm làm tăng 23,24% tỷ lệ tế bào sống so với nhóm chứng (p < 0,0001); nồng độ 100, 200 ppm làm giảm tỷ lệ tế bào sống 37 84,4% so với nhóm chứng (p < 0,0001) Cao cam thảo bắc phân đoạn nước tất nồng độ không ảnh hưởng lên tỷ lệ tế bào sống so với nhóm chứng (p > 0,05) 3.1.6.2 Nhóm cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs Sài đất (SD) Hình 3-17 Ảnh hƣởng phân đoạn sài đất lên tăng sinh PBMCs Nhận xét: cao sài đất phân đoạn ethyl acetat không ảnh hưởng lên tỷ lệ sống tế bào so với nhóm chứng (p > 0,05) Phân đoạn sài đất cloroform ức chế mạnh tăng sinh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 31 PBMCs kích thích PHA, ức chế phụ thuộc vào nồng độ với giá trị IC50 16,12 ppm Phân đoạn sài đất nước ức chế trung bình tăng sinh PBMCs, giá trị IC50 168 ppm Như các cao phân đoạn sài đất, phân đoạn cloroform ức chế mạnh tăng sinh in vitro PBMCs với giá trị IC50 16,12 ppm Tơ mộc (TM) Hình 3-18 Ảnh hƣởng phân đoạn tô mộc lên tăng sinh PBMCs Nhận xét: Phân đoạn tô mộc cloroform ức chế mạnh tăng sinh PBMCs kích thích PHA, ức chế phụ thuộc vào nồng độ với giá trị IC50 60,01 ppm Phân đoạn tô mộc ethyl acetat ức chế mạnh tăng sinh PBMCs, giá trị IC50 36,52 ppm Phân đoạn tô mộc nước ức chế trung bình tăng sinh PBMCs, giá trị IC50 149,5 ppm Như các cao phân đoạn tô mộc, phân đoạn ethyl acetat ức chế mạnh tăng sinh in vitro PBMCs với giá trị IC50 36,52 ppm Ngũ gia bì chân chim (NGB) Hình 3-19 Ảnh hƣởng phân đoạn ngũ gia bì chân chim lên tăng sinh PBMCs Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 32 Nhận xét: Phân đoạn ngũ gia bì cloroform ức chế mạnh tăng sinh PBMCs kích thích PHA, ức chế phụ thuộc vào nồng độ với giá trị IC50 34,99 ppm Phân đoạn ngũ gia bì chân chim ethyl acetat ức trung bình tăng sinh PBMCs, giá trị IC50 > 200 ppm Phân đoạn ngũ gia bì chân chim nước ảnh hưởng khơng có ý nghĩa lên tỷ lệ tế bào sống so với nhóm chứng Như các cao phân đoạn ngũ gia bì chân chim, phân đoạn cloroform ức chế mạnh tăng sinh in vitro PBMCs với giá trị IC50 34,99 ppm Muồng trâu (MT) Hình 3-20 Ảnh hƣởng phân đoạn muồng trâu lên tăng sinh PBMCs Nhận xét: Phân đoạn muồng trâu cloroform ức chế trung bình tăng sinh PBMCs kích thích PHA, ức chế phụ thuộc vào nồng độ với giá trị IC50 162,1 ppm Tuy nhiên, phân đoạn muồng trâu ethyl acetat phân đoạn nước ảnh hưởng khơng có ý nghĩa lên tỷ lệ tế bào sống so với nhóm chứng (p > 0,05) Như các cao phân đoạn muồng trâu, phân đoạn cloroform ức chế mạnh tăng sinh in vitro PBMCs với giá trị IC50 162,1 ppm Kim ngân hoa Hình 3-21 Ảnh hƣởng phân đoạn kim ngân hoa lên tăng sinh PBMCs Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 33 Nhận xét: Phân đoạn kim ngân hoa cloroform ức chế trung bình tăng sinh PBMCs kích thích PHA, ức chế phụ thuộc vào nồng độ với giá trị IC50 142,3 ppm Phân đoạn ethyl acetat ức chế tăng sinh PBMCs với giá trị IC50 186,9 ppm Phân đoạn nước nồng độ 200 ppm ức chế 21,88% tăng sinh PBMCs Giá trị IC50 > 200 ppm Như các cao phân đoạn kim ngân hoa, phân đoạn cloroform ức chế mạnh giá trị IC50 142,3 ppm Trầu khơng Hình 3-22 Ảnh hƣởng phân đoạn trầu không lên tăng sinh PBMCs Nhận xét: Phân đoạn trầu không cloroform ức chế mạnh tăng sinh PBMCs kích thích PHA, ức chế phụ thuộc vào nồng độ với giá trị IC50 27,81 ppm Tuy nhiên, phân đoạn ethyl acetat phân đoạn nước ảnh hưởng khơng có ý nghĩa lên tỷ lệ tế bào sống so với nhóm chứng (p > 0,05) Như các cao phân đoạn trầu không, phân đoạn cloroform ức chế mạnh giá trị IC50 27,81 ppm Bảng 3-7 Bảng tổng kết giá trị IC50 EC50 cao phân đoạn tăng sinh in vitro PBMCs STT Nhóm Tên Cam thảo bắc Kích thích Hồng kỳ Ức chế Muồng trâu Phân đoạn IC50 (ppm) Nồng độ IC50 EC50 (ppm) CL 10 EA 50 H2O Không ảnh hưởng CL 50 EA 100 H2O Không ảnh hưởng CL 162,1 EA Không ảnh hưởng Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 34 H2O Khơng ảnh hưởng CL 27,81 EA Không ảnh hưởng 12 H2O Không ảnh hưởng 13 CL 34,99 EA >200 15 H2O Không ảnh hưởng 16 CL 60,01 EA 36,52 18 H2O 149,5 19 CL 16,12 EA Không ảnh hưởng 21 H2O 168 22 CL 142,3 EA 186,9 H2O >200 10 Trầu khơng 11 Ngũ gia bì 14 17 Tơ mộc Sài đất 20 Kim ngân hoa 23 24 3.1.7 Phân tích sơ thành phần cao phân đoạn 3.1.7.1 Nhóm cao có hoạt tính kích thích tăng sinh in vitro PBMCs Bảng 3-8 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật phân đoạn dƣợc liệu kích thích STT Cam thảo Nhóm hợp chất Hồng kỳ CL EA H2O CL EA H2O Chất béo - - - - - - Tinh dầu - - - - - - Triterpenoid tự + - - + - - Alkaloid - - - - - - Coumarin - - - - - - Anthranoid + + + - - - Flavonoid - + - - + - Các hợp chất phenolic + + + + + + Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 35 Tanin - - - - - - 10 Saponin - + + - + - 11 Chất khử - + + - + + 12 Acid hữu - - - - - - 13 Hợp chất polyuronid - - - - - - Nhận xét: Đa số phân đoạn cao có hoạt tính kích thích tăng sinh in vitro PBMCs có chứa saponin, hợp chất phenolic 3.1.7.2 Nhóm cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs Bảng 3-9 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật phân đoạn cao dƣợc liệu ức chế PBMCs Muồng trâu STT Nhóm hợp chất Sài đất Tô mộc CL EA H2O CL EA H2O CL EA H2O Chất béo - - - - - - - - - Tinh dầu - - - - - - - - - Triterpenoid tự + + + + + - Alkaloid - - - - - - - - - Coumarin - - - - - - - - - Anthranoid + + + + + + - - - Flavonoid - - + +++ +++ +++ - - - Các hợp chất phenolic - - + +++ +++ +++ + + + Tanin - - - - - - - - - 10 Saponin - + + - - - - - + 11 Chất khử - - - - - - - - + 12 Acid hữu - - - - - - - - - 13 Hợp chất polyuronid - - - - - - - - - Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 36 Bảng 3-10 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật phân đoạn cao dƣợc liệu ức chế PBMCs Ngũ gia bì chân chim STT Trầu khơng Kim ngân hoa Nhóm hợp chất CL EA H2O CL EA H 2O CL EA H 2O Chất béo - - - - - - - - - Tinh dầu - - - - - - - - - Triterpenoid tự + (xanh) + + (đỏ) + - - + - - Alkaloid - - - - - - - - - Coumarin - - - - - - - - - Anthranoid - - - + + - - - - Flavonoid - - - - - - - - - Các hợp chất phenolic - ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ Tanin - - - - - - - - + 10 Saponin - + + - - - + ++ +++ 11 Chất khử - + + - - - - - + 12 Acid hữu - - - - - - - - - 13 Hợp chất polyuronid - - + - - - - - - Nhận xét: Sự phân bố nhóm hợp chất phân đoạn cao dược liệu có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs khơng Nhìn chung, vài hợp chất thường tìm thấy phân đoạn cao ức chế nhóm triterpenoid tự do, anthranoid, flavonoid, phenolic 3.2 BÀN LUẬN 3.2.1 Độc tính DMSO PBMCs Dimethyl sulfoxyd (DMSO) dung môi hữu dùng phổ biến thử nghiệm tế bào khả trợ tan, hòa tan chất phân cực không phân cực nhở vào cấu trúc lưỡng cực DMSO gồm nhóm sulfinyl thân nước nhóm methyl thân dầu Tuy nhiên, nồng độ DMSO nuôi cấy tế bào phải nằm giới hạn cho phép độc tính DSMO tế bào Do cao dược liệu thường khó tan nước, DMSO dùng để hịa tan cao DMSO thường coi dung mơi có độc tính Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 37 thấp dùng phổ biến nuôi cấy tế bào, không trợ tan mà dùng để bảo vệ tế bào trình trữ tế bào nitơ lỏng với nồng độ 10% [10],[16] Nồng độ DMSO 1% coi độc với đa số tế bào Cơ chế gây độc tế bào DMSO tương tác DMSO với màng phospholipid kép, gây hòa màng tạo lỗ thủng màng, làm giảm tính chọn lọc làm tăng tính thấm màng [13] Nồng độ gây độc DMSO tùy thuộc vào dòng tế bào thời gian nuôi cấy Theo Kloverpris [35], thời gian tế bào tiếp xúc với DMSO độc nồng độ DMSO tỷ lệ sống chức PBMCs khơng thay đổi xử lý tế bào với nồng độ DMSO lên tới 10% v/v vòng giờ; ngược lại, 0,2% DMSO làm tăng tỷ lệ PBMCs chết sau ngày Theo Lucas de Abreu Costa [31], DMSO có hoạt tính kháng viêm in vitro, gây giảm hoạt hóa tế bào lympho, giảm tăng sinh lymphocyte nồng độ từ 1% trở lên nồng độ 5% làm giảm sản xuất TNF – α IL – Tuy nhiên, nồng độ DMSO thấp (0,05 – 0,2%) lại gây kích thích tăng sinh tế bào, ví dụ tế bào Mono Mac 6, tế bào HL – 60 [80], dòng tế bào ung thư buồng trứng Caov – 3, OVCAR – 3, SK – OV – [44], tế bào biểu mô da GSF3.2 [45] Vì vậy, chúng tơi khảo sát ảnh hưởng DMSO lên tỷ lệ tế bào sống tất nồng độ tương ứng với nồng độ cuối môi trường nuôi cấy để loại trừ ảnh hưởng DMSO lên tỷ lệ sống tăng sinh tế bào PBMCs Kết cho thấy nuôi cấy PBMCs 48 giờ, nồng độ DMSO không vượt 1% không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống tế bào so với nhóm chứng; nồng độ DMSO 2% làm giảm tỷ lệ tế bào sống 20 ± 4,465% 20,33 ± 2,882% nhóm tế bào khơng có PHA có PHA tương ứng Vì vậy, cao dược liệu pha DMSO cho nồng độ DMSO cuối giếng nuôi cấy không lớn 0,5% để đảm bảo hịa tan cao khơng ảnh hưởng lên tế bào PBMCs, phân đoạn giàu tế bào lympho 3.2.2 Thử nghiệm MTT để đánh giá tác động cao chiết tăng sinh in vitro PBMCs Thử nghiệm MTT giúp đo lường tỷ lệ tế bào sống dựa phản ứng muối tetrazolium có màu vàng bị khử thành sản phẩm formazan có màu tím tế bào sống có hoạt tính chuyển hóa mạnh Tuy nhiên, số tế bào sống khơng khử MTT chúng dạng bất hoạt Vì lý đó, tế bào PBMCs sau chiết từ máu tồn phần phải ni ổn định tủ ấm mơi trường RPMI có thêm chất kích thích phân chia tế bào trước thực phản ứng MTT Trong thử nghiệm đề tài Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 38 này, chúng tơi sử dụng điều kiện nuôi cấy in vitro tế bào PBMCs tối ưu hóa trước [1] Các tế bào PBMCs thường dạng hoạt động nuôi ổn định mơi trường RPMI có PHA PHA (phytohemaglutinin) chất kích thích phân bào thường dùng nghiên cứu miễn dịch in vitro PBMCs Các tế bào PBMC sau phân lập khỏi máu toàn phần phần lớn gồm tế bào trạng thái nghỉ với hoạt tính chuyển hóa thấp [34], thiết kế nghiên cứu sàng lọc dược liệu cao cồn tồn phần ln gồm nhóm: nhóm có chất kích thích phân bào PHA giúp tế bào PBMCs tăng sinh từ sàng lọc dược liệu ức chế tăng sinh PBMCs, nhóm khơng có PHA để sàng lọc dược liệu kích thích tăng sinh PBMCs trạng thái nghỉ Kết thử nghiệm MTT dùng làm tiền đề cho thử nghiệm chuyên biệt trình gây độc tế bào chất khảo sát apoptosis hay necrosis Trong đề tài này, từ 13 dược liệu ban đầu, dùng thử nghiệm MTT để sàng lọc tác động cao cồn toàn phần tiếp tục sàng lọc cao phân đoạn tăng sinh in vitro PBMCs Một vài nghiên cứu cho trình khử MTT bị ảnh hưởng chất có hoạt tính khử mơi trường chất làm thay đổi hoạt tính ty thể, dẫn đến sai số ước lượng tỷ lệ sống tế bào [20],[43] Theo kết phân tích sơ hóa, cao dược liệu nghiên cứu thường giàu chất/nhóm hợp chất có tính khử flavonoid, triterpenoid, phenolic có khả khử muối MTT, đọc đối chiếu kết mẫu thử với mẫu trắng thử (là mẫu có cao dược liệu tất nồng độ khảo sát) 3.2.3 Đánh giá phân đoạn cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs Các phân đoạn cao có hoạt tính ức chế mạnh tăng sinh PBMcs in vitro chủ yếu nằm phân đoạn cloroform Ngoại trừ phân đoạn cao ethyl acetat tô mộc, phân đoạn ức chế mạnh tăng sinh PBMcs in vitro dược liệu phân đoạn cloroform Kết phân tích hóa sơ phân đoạn cao cho thấy tất phân đoạn cloroform có triterpenoid, phân đoạn tơ mộc ethyl acetat có triterpenoid, điều phù hợp với nghiên cứu trước cho thấy nhóm hợp chất triterpenoid có hoạt tính kháng viêm ức chế miễn dịch mạnh thường dùng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị bệnh viêm hen suyễn, viêm khớp dạng thấp, vảy nến, lupus [14] Dihydrocucurbitacin B triterpen, có tác dụng ức chế tăng sinh tế bào lympho Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 39 T người kích thích PHA, đưa tế bào phase G0 chu kỳ tế bào [8] Các thuốc ức chế miễn dịch thuộc nhóm glucocorticoid có chứa nhân steroid (một phân nhóm triterpenoid Như vậy, kết nghiên cứu định hướng cho nghiên cứu theo hướng phân lập xác định cấu trúc chất có hoạt tính ức chế tăng sinh PBMCs in vitro in vivo để ứng dụng điều trị bệnh lý liên quan đến miễn dịch điều trị chống thải ghép Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 40 Chƣơng - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Sau thởi gian nghiên cứu, đề tài đạt kết sau: - Khảo sát ảnh hưởng 13 cao dược liệu toàn phần ethanol 96% lên tăng sinh in vitro PBMCs (phân đoạn giàu tế bào lympho nhất) thử nghiệm MTT, từ xác định dược liệu có tính kích thích miễn dịch (cam thảo bắc, hoàng kỳ) dược liệu ức chế miễn dịch (sài đất, trầu không, muồn trâu, kim ngân hoa, ngũ gia bì chân chim, tơ mộc) Kết định hướng cho nghiên cứu việc sử dụng dược liệu để điều trị bệnh lý liên quan hệ miễn dịch (làm kích thích ức chế tế bào hệ miễn dịch) - Khảo sát ảnh hưởng 24 cao phân đoạn cloroform, ethyl acetat nước dược liệu có hoạt tính tăng sinh in vitro PBMCs thử nghiệm MTT, từ chọn phân đoạn cao dược liệu ức chế tốt (5 phân đoạn cloroform sài đất, kim ngân hoa, trầu khơng, muồng trâu, ngũ gia bì chân chim, phân đoạn ethyl acetat tơ mộc; cao phân đoạn sài đất cloroform có tác động ức chế mạnh (IC50 =16,12 ppm)), phân đoạn cao dược liệu ức kích thích tốt (phân đoạn cloroform ethyl acetat cam thảo bắc hoàng kỳ) 4.2 KIẾN NGHỊ Do hạn chế thời gian thực nên đề tài bước đầu thu số kết Nếu có điều kiện thực tiếp, chúng tơi có số đề nghị sau: - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao toàn phần cao phân đoạn thử nghiệm DPPH - Khảo sát ảnh hưởng cao phân đoạn sản xuất IL – PBMCs tiết môi trường nuôi cấy - Đánh giá độc tính cao sài đất phân đoạn cloroform PBMCs thử nghiệm Annexin V/PI - Đánh giá thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ TCD3+/CD8+ quần thể tế bào lympho T tác động cao sài đất phân đoạn cloroform Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 41 - Nghiên cứu phân lập chất cao phân đoạn có hoạt tính kích thích ức chế tăng sinh PBMCs, thử tác dụng dược lý xác định cấu trúc chất có hoạt tính Từ đó, sử dụng hoạt chất để điều trị bệnh lý liên quan hệ miễn dịch Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thanh Thy, Lê Thị Thảo Nguyên, and Nguyễn Thị Minh Thuận(2018), "Tối ưu hóa điều kiện ni cấy in vitro tế bào đơn nhân chiết từ máu ngoại vi người" Hội thảo Công nghệ Sinh học vùng Đồng Sông Cửu Long 2018 – Thành tựu Phát triển Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam Hà Nội: Nhà xuất Y học Nguyễn Thị Ngọc Trâm(2015), "Nghiên cứu tác dụng sinh học độ an toàn phân đoạn alcaloid flavonoid từ Trinh nữ hồng cung" Bộ Khoa Học Cơng Nghệ Tài liệu tiếng Anh Amirghofran Z., et al.(2011), "In vitro immunomodulatory effects of extracts from three plants of the Labiatae family and isolation of the active compound(s)" J Immunotoxycol 8(4): p 265-73 Auyeung K K., Han Q B., and Ko J K.(2016), "Astragalus membranaceus: A Review of its Protection Against Inflammation and Gastrointestinal Cancers" Am J Chin Med 44(1): p 1-22 Chen X P., et al.(2013), "Phytochemical and pharmacological studies on Radix Angelica sinensis" Chin J Nat Med 11(6): p 577-87 Dastagir G and Rizvi M A.(2016), "Review - Glycyrrhiza glabra L (Liquorice)" Pak J Pharm Sci 29(5): p 1727-1733 Escandell J M., et al.(2007), "Dihydrocucurbitacin B inhibits delayed type hypersensitivity reactions by suppressing lymphocyte proliferation" J Pharmacol Exp Ther 322(3): p 1261-8 Fu J., et al.(2014), "Review of the botanical characteristics, phytochemistry, and pharmacology of Astragalus membranaceus (Huangqi)" Phytother Res 28(9): p 1275-83 10 Gurtovenko A A and Anwar J.(2007), "Modulating the structure and properties of cell membranes: the molecular mechanism of action of dimethyl sulfoxyde" J Phys Chem B 111(35): p 10453-60 11 Harput U S., Saracoglu I., and Ogihara Y.(2005), "Stimulation of lymphocyte proliferation and inhibition of nitric oxyde production by aqueous Urtica dioica extract" Phytother Res 19(4): p 346-8 12 Li Y., et al.(2007), "Antiviral triterpenoids from the medicinal plant Schefflera heptaphylla" Phytother Res 21(5): p 466-70 13 Notman R., et al.(2006), "Molecular basis for dimethylsulfoxyde (DMSO) action on lipid membranes" J Am Chem Soc 128(43): p 13982-3 14 Rios J L.(2010), "Effects of triterpenes on the immune system" J Ethnopharmacol 128(1): p 15 Saleh F., et al.(2014), "Analysis of the effect of the active compound of green tea (EGCG) on the proliferation of peripheral blood mononuclear cells" BMC Complement Altern Med 14: p 322 16 Santos N C., et al.(2003), "Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxyde: pharmacological, cellular, and molecular aspects" Biochem Pharmacol 65(7): p 1035-41 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 17 Sarma D and Khosa R.(1994), "Immunomodulators of plant origin – a review" Anc Sci Life 13(3-4): p 326-31 18 Shang X., et al.(2011), "Lonicera japonica Thunb.: ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine" J Ethnopharmacol 138(1): p 1-21 19 Tsai Y C., et al.(2017), "Anti-inflammatory Principles from Sarcandra glabra" J Agric Food Chem 65(31): p 6497-6505 20 Wang P., Henning S M., and Heber D.(2010), "Limitations of MTT and MTSbased assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols" PLoS One 5(4): p e10202 21 Wu C., et al.(2013), "Triterpenoid saponins from the stem barks of Schefflera heptaphylla" Planta Med 79(14): p 1348-55 22 Wu S Y., et al.(2012), "Green tea (Camelia sinensis) mediated suppression of IgE production by peripheral blood mononuclear cells of allergic asthmatic humans" Scand J Immunol 76(3): p 306-10 23 Agyemang Kojo, et al.(2013), "Recent Advances in Astragalus membranaceus Anti-Diabetic Research: Pharmacological Effects of Its Phytochemical Constituents" Evidence-based Complementary and Alternative Medicine : eCAM 2013: p 654643 24 Aldahlawi Alia M.(2016), "Modulation of dendritic cell immune functions by plant components" Journal of Microscopy and Ultrastructure 4(2): p 55-62 25 Amirghofran Zahra(2011), "Herbal Medicines for Immunosuppression" Iran J Allergy Asthma Immunol 11(2): p 111-119 26 Arreola Rodrigo(2015), "Immunomodulation and Anti-Inflammatory Effects of Garlic Compounds" Journal of Immunology Research 2015: p 27 Bhalerao Satish A(2013), "Phytochemistry, Pharmacological Profile and Therapeutic Uses of Piper Betle Linn An Overview" Research & Reviews: Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 1(2): p 10 28 Block Keith I.(2012), "Immune System Effects of Echinacea, Ginseng, and Astragalus: A Review" Integrative cancer therapies 2(3): p 247 29 Curry Michael, Brooks Austin, and Bruns Heather A.(2016), "The Effect of Lonicera japonica on LPS-Stimulated B-Cell Functions" Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants 22(2): p 139-147 30 Chen Yanfen, et al.(2015), "Antinociceptive and anti-inflammatory activities of Schefflera octophylla extracts" Journal of Ethnopharmacology 171: p 42-50 31 de Abreu Costa Lucas, et al.(2017), "Dimethyl Sulfoxyde (DMSO) Decreases Cell Proliferation and TNF-α, IFN-γ, and IL-2 Cytokines Production in Cultures of Peripheral Blood Lymphocytes" Molecules 22(11): p 1789 32 Ilangkovan Menaga(2015), "Immunosuppressive effects of the standardized extract of Phyllanthus amarus on cellular immune responses in Wistar-Kyoto rats" Drug Design, Development and Therapy 9: p 4917 33 Kainthla R P.(2006), "Effect of Hemidesmus indicus (Anantmool) extract on IgG production and adenosine deaminase activity of human lymphocytes in vitro" Indian J Pharmacol 38(3): p 190 - 193 34 Kleiveland Charlotte R (2015), The Impact of Food Bio-Actives on Health: In vitro and Ex vivo models Springer Open 161 - 165 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 35 Kloverpris Henrik, et al.(2010), "Dimethyl sulfoxyde (DMSO) exposure to human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) abolish T cell responses only in high concentrations and following coincubation for more than two hours" Journal of Immunological Methods 356(1): p 70-78 36 Kothavade Pankaj S., et al.(2015), "Therapeutic Effect of Saponin Rich Fraction of Achyranthes aspera Linn on Adjuvant-Induced Arthritis in Sprague-Dawley Rats" Autoimmune Diseases 2015: p 943645 37 Khan Adnan, et al.(2016), "Camellia sinensis Mediated Enhancement of Humoral Immunity to Particulate and Non-particulate Antigens" 30(1): p 41-48 38 Namita Parmar(2012), "Camellia Sinensis (Green Tea): A Review" Global Journal of Pharmacology 6(2): p 52 - 59 39 Nirmal Nilesh P., et al.(2015), "Brazilin from Caesalpinia sappan heartwood and its pharmacological activities: A review" Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 8(6): p 421-430 40 Nomani Irshad(2013), "Wedelia chinensis (Asteraceae)- An Overview Of A Potent Medicinal Herb" International Journal of PharmTech Research 5(3): p 957 - 964 41 Pawar Harshal A.(2011), "Cassia tora linn.: An overview" IJPSR 2(9): p 2286 2291 42 Rai Ravishankar V.(2012), "Medicinal use of Coscinium fenestratum (Gaertn.) Colebr.: an short review" Oriental Pharmacy and Experimental Medicine 13(1): p 1-9 43 Rai Yogesh, et al.(2018), "Mitochondrial biogenesis and metabolic hyperactivation limits the application of MTT assay in the estimation of radiation induced growth inhibition" Scientific Reports 8(1): p 1531 44 Rodríguez-Burford C., et al.(2003), "The use of dimethylsulfoxyde as a vehicle in cell culture experiments using ovarian carcinoma cell lines" Biotechnic & Histochemistry 78(1): p 17-21 45 Singh Mahipal(2017), "Effect of dimethyl sulfoxyde on in vitro proliferation of skin fibroblast cells" Effect of dimethyl sulfoxyde on in vitro proliferation of skin fibroblast cells 8: p 78 46 Singh Namrata(2016), "A review on herbal plants as immunomodulators" International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research 7(9): p 3602 3610 47 Tcheghebe Olivier Tene(2017), "Ethnobotanical uses, phytochemical and pharmacological profiles, and toxycity of Cassia alata L An overview" Landmark Research Journals of Medicine and Medical Sciences 4(2): p 16 - 24 48 Tungpradit Rudeewan(2010), "Anti-Cancer Compound Screening and Isolation: Coscinium fenestratum, Tinospora crispa and Tinospora cordifolia" Chiang Mai J Sci 37(3): p 476 - 488 49 Wang L., Wang F S., and Gershwin M E.(2015), "Human autoimmune diseases: a comprehensive update" J Intern Med 278(4): p 369-95 50 Wu Yi-Chian and Hsieh Ching-Liang(2011), "Pharmacological effects of Radix Angelica Sinensis (Danggui) on cerebral infarction" Chinese Medicine 6: p 3232 ... sinh in vitro tế bào đơn nhân đƣợc phân lập từ máu ngoại vi ngƣời” với mục tiêu cụ thể sau: Khảo sát tác động loại cao chiết toàn phần số dược liệu tăng sinh in vitro tế bào lympho máu ngoại vi. .. toàn phần dược liệu tăng sinh in vitro tế bào đơn nhân phân lập từ máu ngoại vi người (PBMCs) phương pháp MTT Khảo sát tác động cao chiết phân đoạn dược liệu tăng sinh in vitro PBMCs phương pháp... dược liệu lên điều hòa tăng sinh in vitro tế bào PBMCs phân lập từ máu ngoại vi người, phân đoạn giàu tế bào lympho Các mẫu máu tồn phần thu thập từ 10 tình nguyện vi? ?n khỏe mạnh (5 nam, nữ),