Nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan có giá trị doc

nghiên cứu ứng dụng phơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan có giá trị Study on application of thin cell layer culture for in vitro propagation of some valuable cymbidium varieties Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Thị Hoài Summary The thin cell layer method was suggeted by Tran Thanh Van K. We use this method to complete micropropagation of Cymbidium. Experiments were carried out on varieties Miss Kim, Xanh Chieu and Hong Bet originated from China and Viet Nam. The tissue culture was done in artificial conditions (adjustable light, temperature, humidity). There ware 15-50 explants in each variant of experiments. In optimal medium: MS + 150ml coconut water + 1mg kinetin + 10g sucrose + 6,5g agar per lit (for variety Miss Kim) and MS + 150ml coconut water + 1mg BA + 10g sucrose + 6,5g agar per lit (for variety Xanh chieu), the thin layers with size 0,3 0,5 mm gave best rate of protocorm formation. Number of protocorms per thin cell layer ware 6,23 (Miss Kim) and 4,21 (Xanh Chieu). Above results show that, the thin cell layer culture is successful method for rapid multiplication of Cymbidium. Key words: Cymbidium, thin cell layer, protocorm 1. Đặt vấn đề Phơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào đã đợc Trần Thanh Vân đề xuất (2000) và trở thành một trong những phơng pháp nhân nhanh in vitro có hiệu quả. Trong vài năm trở lại đây, phơng pháp này đợc nghiên cứu ứng dụng tại một số phòng nuôi cấy mô ở Việt Nam và đã đem lại kết quả đáng kể trong quá trình nhân nhanh một số đối tợng nh: phong lan (Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, 2000), dứa (Nguyễn Quang Thạch và CS, 2004) và các cây trồng khác (Dơng Tấn Nhật, 2001). Nhằm cải tiến và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho cây địa lan, chúng tôi đã tiến hành Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan có giá trị. . 2. vật liệu, phơng pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu Các giống địa lan dùng trong nghiên cứu là: Miss Kim (nguồn gốc từ Trung Quốc), Xanh chiểu, Hồng Bệt (2 giống đợc a chuộng và phổ biến ở Đà Lạt) . 2.2. Phơng pháp nghiên cứu + Điều kiện nuôi cấy: các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đợc thực hiện trong điều kiện nhân tạo cho phép chủ động điều chỉnh các chế độ ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ. + Các thí nghiệm đợc bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi công thức theo dõi 15 - 50 cá thể. + Thí nghiệm đợc quan sát, theo dõi thờng xuyên 10 - 15 ngày/lần + Số liệu đợc xử lý thống kê theo chơng trình IRRISTAT. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Nghiên cứu ảnh h ởng của kích thớc lát cắt mỏng đến sự hình thành protocorm Với mục đích để tăng nhanh số lợng protocorm, chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu nuôi cấy lát mỏng cắt từ thể protocorm ban đầu với độ dày từ 0,1mm 1mm trên môi trờng MS +1% saccarose + 1ppm kinetin (K) + 0,65% agar. Đây là môi trờng phù hợp cho nhân nhanh các thể protocorm nguyên vẹn đã đợc xác định đợc trong các nghiên cứu trớc (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2000; 2004). Kết quả thí nghiệm trình bày trong bảng 1. Bảng 1. ảnh hởng của kích thớc lát mỏng đến khả năng tạo protocorm (sau 8 tuần ) Giống địa lan Kích thớc lát cắt (mm) Tỷ lệ sống (%) Protocorm/lát cắt 0,1 16,60 2,00 0,3 63,65 3,00 0,5 75,41 2,83 0,7 87,45 2,50 Xanh chiểu 1,0 92,18 2,30 0,1 33,67 2,25 0,3 57,61 3,33 0,5 69,56 3,00 0,7 81,64 2,57 Hồng bệt 1,0 94,28 2,37 Nh vậy, kích thớc của lát cắt có ảnh hởng rõ rệt đến tỷ lệ sống và sự hình thành protocorm. Nếu độ dày của lát cắt tăng thì tỷ lệ sống tăng nhng tỷ lệ tạo protocorm lại giảm và ngợc lại. ở kích thớc từ 0,3 - 0,5mm kết quả đạt đợc là cao nhất với tỷ lệ sống là 63,65 - 75,41% và số protocorm/lát cắt là 3,00 2,83 protocorm cho giống Xanh chiểu, còn đối với giống Hồng bệt các chỉ tiêu tơng tự là: 57,61- 69,56% và 3,33 - 3,00 protocorm. Nh vậy, các lát cắt với độ dày 0,3 - 0,5 mm là phù hợp cho việc nuôi cấy để tạo protocorm. 3.2. Nghiên cứu ảnh hởng của phơng thức nuôi cấy đến khả năng tạo protocorm Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng môi trờng nuôi cấy: MS +1% đờng + 1ppmK + 0,65% agar/ 1lít môi trờng. Các lát mỏng tế bào đã đợc nuôi cấy tĩnh trên môi trờng đặc, môi trờng lỏng và nuôi cấy lắc trong môi trờng lỏng. Bảng 2. ảnh hởng của phơng thức nuôi cấy đến khả năng tạo protocorm (sau 8 tuần ) Xanh chiểu Hồng bệt Phơng thức nuôi cấy Kích thớc lát cắt (mm) Tỷ lệ sống (%) Protocorm /lát cắt Tỷ lệ sống (%) Protocorm /lát cắt 0,3 63,65 3,00 57,61 3,33 Đặc 0,5 75,41 2,83 69,56 3,00 0,3 37,21 2,67 37,43 2,88 Lỏng + không lắc 0,5 42,16 2,50 47,28 2,50 0,3 43,54 4,67 49,24 4,00 Lỏng + lắc 0,5 59,82 3,30 57,37 3,25 Số liệu thực nghiệm ở bảng 2 cho thấy: không chỉ độ dày của lớp cắt mà phơng thức nuôi cấy cũng là nhân tố tác động mạnh mẽ đến tỷ lệ sống và khả năng tạo protocorm của lát cắt nuôi cấy. Trong cả ba phơng thức nuôi cấy, lát cắt có độ dày 0,3mm đều có tỷ lệ sống thấp hơn nhng số protocorm tạo thành /lát cắt nhiều hơn so với lát cắt dày 0,5mm. Phơng thức nuôi cấy tĩnh trong môi trờng lỏng có hiệu quả kém nhất do tỷ lệ mẫu chết cao và số protocorm/lát cắt thấp nhất. Phơng thức nuôi cấy lắc trong môi trờng lỏng tuy có số protocorm/lát cắt cao nhất nhng tỷ lệ sống của lát cắt không cao nên tổng số protocorm tạo đợc vẫn ít hơn so với phơng thức nuôi cấy tĩnh trên môi trờng đặc. Vì vậy, với các lát mỏng tế bào phơng thức nuôi cấy tĩnh trên môi trờng đặc là hiệu quả hơn cả. Quy luật này thể hiện trên cả hai giống nghiên cứu (Xanh chiểu và Hồng bệt). 3.3. Nghiên cứu ảnh hởng của chất điều tiết sinh trởng đến khả năng tạo protocorm Khi đã xác định đợc độ dày lát cắt và phơng thức nuôi cấy phù hợp, chúng tôi cũng đã bổ sung các chất điều tiết sinh trởng khác nhau ở trạng thái riêng rẽ cũng nh dạng tổ hợp vào môi trờng nuôi cấy nhằm tìm ra tổ hợp và nồng độ thích hợp nhất vừa đảm bảo kích thích lát mỏng hình thành nhiều thể protocorm vừa đảm bảo đợc chất lợng của nguồn mẫu. Nhng kết quả khả quan nhất chỉ đạt đợc khi sử dụng riêng rẽ các xytokinin. Điều này đợc trình bày ở bảng 3 và 4. Bảng 3. ảnh hởng của Benzyl adenin (BA) đến khả năng tạo protocorm (sau 8 tuần) Số protocorm / 1 protocorm ban đầu Giống địa lan Công thức thí nghiệm Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) protocorm /lát mỏng Số protocorm % so với đối chứng I (Đ/C) 57,44 42,54 2,85 11,12 100 I + 0,3mg BA 70,86 29,14 4,50 20,25 182,1 I + 0,5mg BA 81,42 18,58 5,70 27,01 242,9 I + 1mg BA 76,67 23,33 4,00 17,95 161,4 I + 1,5mg BA 85,00 25,00 3,50 15,77 141,8 I + 2mg BA 86,19 13,81 3,40 13,36 120,1 Miss Kim LSD (5%) 0,18 I (Đ/C) 90,40 9,60 2,90 10,25 100 I + 0,3mg BA 89,30 10,70 3,25 12,23 119,3 I + 0,5mg BA 100 0 3,88 15,01 146,4 I + 1mg BA 100 0 4,21 19,05 185,9 I + 1,5mg BA 90,90 9,10 3,88 18,52 180,7 I + 2mg BA 100 0 3,51 15,90 155,1 Xanh chiểu LSD (5%) 0,10 Ghi chú: I (ĐC): MS + 15% nớc dừa + 10g saccarosa + 6,5g aga /1 lít môi trờng Từ các kết quả bảng 3 và 4 cho thấy việc bổ sung chất điều tiết sinh trởng vào môi trờng nuôi cấy có khả năng kích thích sự phát sinh hình thái của lát mỏng rất rõ rệt. Đối với giống Miss Kim, trên các môi trờng có bổ sung BA tổng số protocorm tạo đợc/1 protocorm ban đầu cao hơn đối chứng từ 20,1- 142,9% và khi bổ sung kinetin chỉ tiêu này là 41,6-144,5 %. ở môi trờng có nồng độ BA bằng 0,5ppm hay kinetin bằng 1ppm có thể thu đợc 27 hay 30 thể protocorm từ một protocorm ban đầu sau 8 tuần nuôi cấy. Trên giống Xanh chiểu quy luật cũng diễn ra tơng tự. Nhng với giống này nồng độ thích hợp của BA và kinetin đều là 1mg/l. Trên các môi trờng có bổ sung BA và kinetin ở nồng độ 1mg/l, sau 8 tuần nuôi cấy có thể thu đợc 16-19 protocorm từ 1 protocorm ban đầu. Vì vậy sau khi tạo đợc nguồn vật liệu khởi đầu (protocorm) từ đỉnh chồi hay các mắt ngủ của chồi bên, để tăng nhanh nguồn mẫu cho quá trình nhân tiếp theo thì việc sử dụng nuôi cấy lát mỏng tế bào là phơng pháp tối u nhất. Bảng 4. ảnh hởng của kinetin đến khả năng tạo protocorm (sau 8 tuần) Số protocorm / 1 protocorm ban đầu Giống địa lan Công thức thí nghiệm Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) protocorm /lát mỏng Số protocorm % so với đối chứng I (Đ/C): 60,50 39,50 2,60 12,17 100 I + 0,3mg K 67,27 32,73 4,07 19,47 160,0 I + 0,5mg K 78,26 21,74 4,60 20,65 169,7 I + 1mg K 80,98 19,02 6,23 29,76 244,5 I + 1,5mg K 86,19 13,81 4,25 17,25 141,7 I + 2mg K 83,35 16,65 4,09 17,24 141,6 Miss Kim LSD (5%) 0,07 I (Đ/C): 94,43 5,57 2,71 9,58 100 I + 0,3mg K 89,27 10,73 3,08 11,85 123,7 I + 0,5mg K 91,18 8,82 3,12 14,11 147,3 I + 1mg K 92,76 7,24 3,70 15,95 166,5 I + 1,5mg K 82,31 17,69 3,18 12,52 130,7 I + 2mg K 90,90 9,10 3,14 11,93 124,5 Xanh chiểu LSD (5%) 0,06 Ghi chú: I(ĐC): MS + 15% nớc dừa + 10g saccarosa + 6,5g aga /1lít môi trờng 4. Kết luận Các lát cắt protocorm có chiều dày 0,3- 05mm là thích hợp cho nuôi cấy lớp mỏng để nhân nhanh protocorm. Phơng thức nuôi cấy phù hợp nhất để nuôi cấy lát mỏng protocorm là nuôi cấy tĩnh trên môi trờng đặc. Môi trờng nuôi cấy cho hệ số nhân và số protocorm tạo thành cao nhất: + Đối với giống Miss Kim là: MS+ 150mlND + 1mgKinetin + 10g Saccaroza + 6,5g agar/lít. Trên môi trờng này số protocorm/lát cắt đạt: 6,23 và tổng số protocorm/1 protocorm ban đầu đạt: 29,76. + Đối với giống Xanh chiểu là: MS+ 150mlND + 1mg BA + 10g Saccaroza + 6,5g agar/lít. Trên môi trờng này số protocorm/lát cắt đạt: 4,21 và tổng số protocorm/1 protocorm ban đầu đạt: 19,05. Tài liệu tham khảo Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, 2000. Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy lát mỏng trong nhân nhanh các giống Vanda, Cattleya và Phaleanopsis. Tạp chí Nông nghiệp, Công nghiệp thực phẩm, số 12/2000, trang 546 548. Nguyễn Quang Thạch, Đinh Trờng Sơn, Nguyễn Thị Hơng, 2004. Nhân nhanh giống dứa Đài nông 4 bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, Trờng Đại học Nông nghiệp I. Tập II , số 3/2004, trang: 185-190. Nhut D.T., Bui V.L., Teixeira da Silva J.A., Aswth C.R., 2001. Thin cell layer culture system in Lilium: regeneration and transformation perspectives. In vitro Cell Dev Biol. 37, p: 516-523. Tran Thanh Van K., Bui V.L., 2000. Curent status of thin cell layer method for the induction of organogenesis or somatic embryogenesis. In: somatic embryogenesis in woodly plants. Mohan S.J., Gupta P.K., Newton R.J. (eds.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht 6, p: 51-92 . quy trình nhân giống in vitro cho cây địa lan, chúng tôi đã tiến hành Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan có giá trị. . 2 nghiên cứu ứng dụng phơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan có giá trị Study on application of thin cell layer culture for in vitro propagation. thin cell layer, protocorm 1. Đặt vấn đề Phơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào đã đợc Trần Thanh Vân đề xuất (2000) và trở thành một trong những phơng pháp nhân nhanh in vitro có hiệu quả. Trong