Khảo sát tác động trên sự tăng sinh in vitro của tế bào đơn nhân máu ngoại vi người (pbmcs) và hoạt tính chống oxy hóa của một số dược liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LÊ THỊ THẢO NGUYÊN KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRÊN SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI (PBMCs) VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU Luận văn Thạc sĩ Dược học Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LÊ THỊ THẢO NGUYÊN KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRÊN SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI (PBMCs) VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU Ngành: Dược lý Dược lâm sàng Mã số: 8720205 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Thị Minh Thuận Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Lê Thị Thảo Nguyên iv Luận văn thạc sĩ – Khóa 2016 -2018 Ngành: Dược lý Dược lâm sàng – Mã ngành: 8720205 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRÊN SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI (PBMCs) VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU Lê Thị Thảo Nguyên Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Minh Thuận Từ khóa: chiết xuất dược liệu, PBMCs, interleukin – 2, TCD3+/CD4+, TCD3+/CD8+, độc tế bào, chống oxy hóa Mở đầu: Hệ miễn dịch đóng vai trị quan trọng bảo vệ thể khỏi tác nhân có hại Tuy nhiên, hệ miễn dịch hoạt động thấp mức gây bệnh lý suy giảm miễn dịch, mẫn viêm, bệnh tự miễn Hiện có nhiều dược liệu dùng điều trị bệnh liên quan đến hệ miễn dịch, nhiên chế tác động chưa rõ Đề tài thực nhằm khảo sát ảnh hưởng vài dược liệu Việt Nam tăng sinh in vitro tế bào PBMCs, đồng thời khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dược liệu Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Tế bào PBMCs phân lập từ máu toàn phần người khỏe mạnh Thử nghiệm MTT dùng để khảo sát tác động 13 cao cồn 96% dược liệu 24 cao phân đoạn tăng sinh in vitro PBMCs Định lượng interleukin – (IL – 2) tiết PBMCs môi trường có cao phân đoạn phương pháp ELISA Chọn cao ức chế mạnh nhất, đánh giá gây chết theo chu trình (apoptosis) thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ TCD3+/CD8+ phương pháp đếm tế bào theo dòng Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao tồn phần phân đoạn thử nghiệm DPPH Kết quả: cao toàn phần ức chế cao toàn phần kích thích tăng sinh PBMCs xác định Các phân đoạn cao ức chế làm giảm tiết IL – 2, cao kích thích khơng làm tăng IL – so với nhóm chứng Cao sài đất phân đoạn cloroform ức chế tăng sinh PBMCs mạnh (IC50 =16,12 ppm), làm tỷ lệ apoptosis tăng 19,1% (p < 0,05) tỷ lệ TCD3+/CD4+ giảm 4,18% so với nhóm chứng Cao trầu khơng phân đoạn cloroform có tính chống oxy hóa mạnh gấp 2,1 lần (EC50 = 1,94 ppm) so với vitamin C Kết luận: Cao sài đất cloroform ức chế tăng sinh PBMCs mạnh với IC50 = 16,12 ppm Kết nghiên cứu tiền đề cho nghiên cứu để xác định chất có hoạt tính ức chế tăng sinh PBMCs sài đất để ứng dụng điều trị bệnh lý liên quan đến miễn dịch v Master’s Thesis – Acedemic course: 2016 – 2018 Specialty: Pharmacology and Clinical Pharmacy – Code: 8720205 STUDY ON THE EFFECT OF SOME MEDICINAL PLANTS ON IN VITRO PROLIFERATION OF PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS AND THEIR ANTIOXIDANT ACTIVITY Thao Nguyen Le Thi Supervisor: Dr Minh Thuan Nguyen Thi Keywords: plant extracts, PBMCs, Interleukine – 2, TCD3+CD4+, TCD3+CD8+, cytotoxicity, antioxidant Introduction The immune system plays an essential role in safeguarding our body from surrounding detrimental factors in the environment Nevertheless, when this system functions abnormally (underactive or overactive), it can result in immune-related diseases, namely immunodeficiency, hypersensitivity, inflammation, or autoimmune diseases Medicinal plants have been used widely in the treatment of immune-related diseases, yet little is known about their mechanisms of action Therefore, this study was conducted to study the effect of some medicinal plants on in vitro proliferation of peripheral blood mononuclear cells and their antioxidant activity Materials and methods PBMCs isolated from whole blood of healthy donors MTT assay was used to evaluate the effect of thirteen extracts in 96% ethanol and twenty four fractionated extracts on PBMCs in vitro proliferation IL – concentrations secreted by extracts – treated PBMCs were quantitated using ELISA The plant extract that showed the strongest inhibitory effect on PBMCs in vitro proliferation was chosen to evaluate the apoptosis/necrosis and ratios of TCD3+/CD4+ and TCD3+/CD8+ of PBMCs Antioxidant activities of 96% ethanol extracts and fractionated extracts were assessed using the DPPH method Results Of the 13 ethanol 96% extracts, extracts inhibited and extracts stimulated the in vitro proliferation of PBMCs The extracts with inhibitory effects reduced the amount of IL – 2, whilst the extracts with stimulatory effects were unable to increase the amount of IL – compared to untreated cells (control) The chloroform extract of Wedelia chinesis showed strongest inhibitory activity with an IC50 value of 16.1 ppm, exerting an increase of 19.1% in apoptosis and a decrease of 4.18% in TCD3+/CD4+ ratio compared to untreated cells The chloroform extract of Piper betle showed a strong antioxydant activity with an EC50 of 1.94 ppm, as 2.1 times higher than that of vitamin C Conclusion The chloroform extract of Wedelia chinensis had a potential of being used in the treatment of autoimmune diseases Further studies are needed to isolate and identify the compounds that contribute to this activity vi MỤC LỤC 1.1 Tổng quan mơ hình PBMCs in vitro .3 1.1.1 Nguồn gốc đặc điểm tế bào PBMCs 1.1.1 Cách phân lập PBMCs 1.1.2 Ứng dụng PBMCs nghiên cứu khoa học .4 1.1.2 Các phương pháp đo lường tăng sinh in vitro PBMCs 1.2 Stress oxy hóa 1.3 Một số hợp chất có tính chống oxy hóa .9 1.4 Các phương pháp đánh giá khả chống oxy hóa in vitro 10 1.5 Tình hình nghiên cứu giới .10 1.5.1 Ứng dụng y học cổ truyền điều trị bệnh lý miễn dịch 10 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu .21 vii 2.2 Hóa chất, thuốc thử, nguyên vật liệu 22 2.2.1 Các dược liệu khảo sát 22 2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất - thuốc thử 23 2.3.1 Thiết bị 23 2.3.2 Dụng cụ 24 2.3.3 Hóa chất – thuốc thử .24 2.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu .25 2.4.1 Quy trình điều chế cao toàn phần ethanol 96% 25 2.4.2 Phân lập PBMCs .27 2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng dung môi DMSO lên tăng sinh in vitro PBMCs thử nghiệm MTT 27 2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng cao toàn phần ethanol tăng sinh in vitro PBMCs thử nghiệm MTT .28 2.4.5 Khảo sát ảnh hưởng cao chiết phân đoạn tăng sinh in vitro PBMCs thử nghiệm MTT .30 2.4.6 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao dược liệu tồn phần phân đoạn thử nghiệm DPPH 31 2.4.7 Đánh giá tác động cao chiết phân đoạn trình apoptosis/necrosis PBMCs phương pháp nhuộm Annexin V Propidium iodide (PI) 32 2.4.8 Đánh giá tác động cao chiết phân đoạn sản xuất Interleukin – PBMCs 33 2.4.9 Đánh giá thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ TCD3+/CD8+ tế bào lympho T tác động cao chiết phân đoạn ức chế mạnh tăng sinh tế bào PBMCs .34 2.4.10 Phân tích thống kê 35 viii 3.1 Dược liệu 36 3.1.1 Độ ẩm độ tro toàn phần 36 3.1.2 Chiết cao cồn toàn phần 37 3.2 Khảo sát độc tính DMSO PBMCs 38 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng cao chiết dược liệu toàn phần tăng sinh in vitro PBMCs 40 3.4 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật dược liệu có hoạt tính tăng sinh in vitro PBMCs 50 3.5 Quy trình chiết cao phân đoạn phương pháp lắc phân bố lỏng – lỏng51 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng cao chiết phân đoạn tăng sinh in vitro PBMCs 52 3.6.1 Nhóm cao có hoạt tính kích thích tăng sinh in vitro PBMCs 52 3.6.2 Nhóm cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs .54 3.7 Phân tích sơ thành phần cao phân đoạn 61 3.7.1 Nhóm cao có hoạt tính kích thích tăng sinh in vitro PBMCs 61 3.7.2 Nhóm cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs .62 3.8 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao dược liệu tồn phần phân đoạn thử nghiệm DPPH 63 3.9 Đánh giá tác động gây độc cao chiết phân đoạn lên tế bào PBMCs phương pháp nhuộm Annexin V Propidium iodide (PI) 65 3.10 Kết đánh giá tác động cao chiết phân đoạn sản xuất IL – PBMCs 66 ix 3.11 Kết đánh giá thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ TCD3+/CD8+ tế bào lympho T tác động cao chiết phân đoạn ức chế mạnh tăng sinh tế bào PBMCs 67 4.1 Độc tính DMSO PBMCs 69 4.2 Thử nghiệm MTT để đánh giá tác động cao chiết tăng sinh in vitro PBMCs 70 4.2.1 Khả chống oxy hóa cao dược liệu toàn phần cao phân đoạn71 4.3 Mối liên quan khả chống oxy hóa khả chống tăng sinh PBMCs in vitro 72 4.4 Đánh giá phân đoạn cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs .72 4.5 Ảnh hưởng cao chiết phân đoạn lên sản xuất IL – PBMCs 73 4.6 Đánh giá tác động gây độc cao chiết phân đoạn lên tế bào PBMCs phương pháp nhuộm Annexin V PI 74 4.7 Đánh giá thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ TCD3+/CD8+ tế bào lympho T tác động cao chiết phân đoạn ức chế mạnh tăng sinh tế bào PBMCs .75 x DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ tắt Từ nguyên ADN Acid deoxyribonucleic CL Chloroform DĐVN V Ý nghĩa tiếng Việt Cloroform Dược điển Việt Nam V DPPH 1,1 – diphenyl – –picrylhydrazyl EA Ethyl acetate Ethyl acetat EC50 Effective concentration of 50% Nồng độ hiệu 50% IC50 Inhibition concentration of 50% Nồng độ ức chế 50% IFN - γ Interferon gamma IL – Interleukin – IL – 12 Interleukin -12 LSC Liquid scintillation counting Máy đếm phóng xạ MHC Major Histocompatibility Complex Phức hợp phù hợp mơ Mơi trường ni cấy hồn chỉnh MTNCHC MTT dye – [4,5 – dimethylthiazol – –yl] – 2, – diphenyl tetrazolium bromide NK cells Natural Killer cells Các tế bào giết tự nhiên OD Optical density Mật độ quang PBMCs Peripheral blood mononuclear cells Tế bào đơn nhân máu ngoại biên Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 77 - Đánh giá độc tính cao sài đất phân đoạn cloroform PBMCs thử nghiệm Annexin V/PI: nồng độ IC50 = 16,02 ppm 48 giờ, cao sài đất gây apoptosis cho tế bào PBMCs với tỷ lệ apoptosis tăng 19,1% so với nhóm chứng, chưa làm tế bào necrosis - Đánh giá thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ TCD3+/CD8+ quần thể tế bào lympho T tác động cao sài đất phân đoạn cloroform: nồng độ IC50 = 16,02 ppm 18 giờ, tỷ lệ TCD3+/CD4+ giảm 4,18% KIẾN NGHỊ Do hạn chế thời gian thực nên đề tài bước đầu thu số kết Nếu có điều kiện thực tiếp, chúng tơi có số đề nghị sau: - Khảo sát quy trình ni PBMCs mơi trường có PHA để mẫu phân tích flow cytometer - Thực thêm thử nghiệm chuyên biệt dùng đánh giá tăng sinh tế bào đo tích hợp BrdU để đánh giá xác ảnh hưởng cao dược liệu tăng sinh PBMCs - Nghiên cứu phân lập chất cao phân đoạn có hoạt tính kích thích ức chế tăng sinh PBMCs, thử tác dụng dược lý xác định cấu trúc chất có hoạt tính Từ đó, sử dụng hoạt chất để điều trị bệnh lý liên quan hệ miễn dịch - Nghiên cứu thay đổi biểu gen, protein, mARN tế bào miễn dịch để hiểu rõ chế tác động dược liệu tăng sinh in vitro PBMCs - Đánh giá thêm ảnh hưởng cao phân đoạn tốt cytokin khác liên quan đến Th1 IFN – γ, IL – 12 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thanh Thy, Lê Thị Thảo Nguyên, Nguyễn Thị Minh Thuận (2018), "Tối ưu hóa điều kiện ni cấy in vitro tế bào đơn nhân chiết từ máu ngoại vi người" Hội thảo Công nghệ Sinh học vùng Đồng Sông Cửu Long 2018 – Thành tựu Phát triển Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam Hà Nội: Nhà xuất Y học Nguyễn Thị Ngọc Trâm (2015), "Nghiên cứu tác dụng sinh học độ an toàn phân đoạn alcaloid flavonoid từ Trinh nữ hoàng cung" Bộ Khoa Học Công Nghệ Tài liệu tiếng Anh Amirghofran Z., et al.(2011), "In vitro immunomodulatory effects of extracts from three plants of the Labiatae family and isolation of the active compound(s)" J Immunotoxycol 8(4): p 265-73 Auyeung K K., Han Q B., and Ko J K.(2016), "Astragalus membranaceus: A Review of its Protection Against Inflammation and Gastrointestinal Cancers" Am J Chin Med 44(1): p 1-22 Belikov A V., Schraven B., and Simeoni L.(2015), "T cells and reactive oxygen species" J Biomed Sci 22 Closa D and Folch-Puy E.(2004), "Oxygen free radicals and the systemic inflammatory response" IUBMB Life 56(4): p 185-91 Chen X P., et al.(2013), "Phytochemical and pharmacological studies on Radix Angelica sinensis" Chin J Nat Med 11(6): p 577-87 Daher M and Rezvani K.(2018), "Next generation natural killer cells for cancer immunotherapy: the promise of genetic engineering" Curr Opin Immunol 51: p 146-153 10 Dastagir G and Rizvi M A.(2016), "Review - Glycyrrhiza glabra L (Liquorice)" Pak J Pharm Sci 29(5): p 1727-1733 11 Dzubak P., et al.(2006), "Pharmacological activities of natural triterpenoids and their therapeutic implications" Nat Prod Rep 23(3): p 394-411 12 Escandell J M., et al.(2007), "Dihydrocucurbitacin B inhibits delayed type hypersensitivity reactions by suppressing lymphocyte proliferation" J Pharmacol Exp Ther 322(3): p 1261-8 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 79 13 Fu J., et al.(2014), "Review of the botanical characteristics, phytochemistry, and pharmacology of Astragalus membranaceus (Huangqi)" Phytother Res 28(9): p 1275-83 14 Gurtovenko A A and Anwar J.(2007), "Modulating the structure and properties of cell membranes: the molecular mechanism of action of dimethyl sulfoxyde" J Phys Chem B 111(35): p 10453-60 15 Hamelryck T W., et al.(1996), "The crystallographic structure of phytohemagglutinin-L" J Biol Chem 271(34): p 20479-85 16 Harput U S., Saracoglu I., and Ogihara Y.(2005), "Stimulation of lymphocyte proliferation and inhibition of nitric oxyde production by aqueous Urtica dioica extract" Phytother Res 19(4): p 346-8 17 Li Y., et al.(2007), "Antiviral triterpenoids from the medicinal plant Schefflera heptaphylla" Phytother Res 21(5): p 466-70 18 Li Y L., et al.(2009), "Chemical composition and antiproliferative activity of essential oil from the leaves of a medicinal herb, Schefflera heptaphylla" Phytother Res 23(1): p 140-2 19 Lopez-Lazaro M.(2015), "A simple and reliable approach for assessing anticancer activity in vitro" Curr Med Chem 22(11): p 1327 20 Miliotou A N and Papadopoulou L C.(2018), "CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy" Curr Pharm Biotechnol 19(1): p 5-18 21 Notman R., et al.(2006), "Molecular basis for dimethylsulfoxyde (DMSO) action on lipid membranes" J Am Chem Soc 128(43): p 13982-3 22 Parkin J and Cohen B.(2001), "An overview of the immune system" Lancet 357(9270): p 1777-89 23 Ravipati A S., et al.(2012), "Antioxydant and anti-inflammatory activities of selected Chinese medicinal plants and their relation with antioxydant content" BMC Complement Altern Med 12: p 173 24 Rios J L.(2010), "Effects of triterpenes on the immune system" J Ethnopharmacol 128(1): p 25 Sajkowska-Kozielewicz J J., et al.(2016), "Antioxydant, Cytotoxyc, and Antiproliferative Activities and Total Polyphenol Contents of the Extracts of Geissospermum reticulatum Bark" Oxyd Med Cell Longev 2016: p 2573580 26 Saleh F., et al.(2014), "Analysis of the effect of the active compound of green tea (EGCG) on the proliferation of peripheral blood mononuclear cells" BMC Complement Altern Med 14: p 322 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 80 27 Santos N C., et al.(2003), "Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxyde: pharmacological, cellular, and molecular aspects" Biochem Pharmacol 65(7): p 1035-41 28 Sarma D and Khosa R.(1994), "Immunomodulators of plant origin – a review" Anc Sci Life 13(3-4): p 326-31 29 Shang X., et al.(2011), "Lonicera japonica Thunb.: ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine" J Ethnopharmacol 138(1): p 1-21 30 Teixeira J., et al.(2013), "Hydroxycinnamic acid antioxydants: an electrochemical overview" Biomed Res Int 2013: p 31 Tsai Y C., et al.(2017), "Anti-inflammatory Principles from Sarcandra glabra" J Agric Food Chem 65(31): p 6497-6505 32 Wang L T., et al.(2018), "Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells Results in Downregulation of c-Myc and DNA Replication Pathways with Immunomodulation Toward CD4 and CD8 Cells" Stem Cells 36(6): p 903-914 33 Wang P., Henning S M., and Heber D.(2010), "Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols" PLoS One 5(4): p e10202 34 Wu C., et al.(2013), "Triterpenoid saponins from the stem barks of Schefflera heptaphylla" Planta Med 79(14): p 1348-55 35 Wu S Y., et al.(2012), "Green tea (Camelia sinensis) mediated suppression of IgE production by peripheral blood mononuclear cells of allergic asthmatic humans" Scand J Immunol 76(3): p 306-10 36 Agyemang Kojo, et al.(2013), "Recent Advances in Astragalus membranaceus Anti-Diabetic Research: Pharmacological Effects of Its Phytochemical Constituents" Evidence-based Complementary and Alternative Medicine : eCAM 2013: p 654643 37 Alam M N., Bristi N J., and Rafiquzzaman M.(2013), "Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxydant activity" Saudi Pharm J 21(2): p 143-52 38 Aldahlawi Alia M.(2016), "Modulation of dendritic cell immune functions by plant components" Journal of Microscopy and Ultrastructure 4(2): p 55-62 39 Ali Shahin Sharif, et al.(2008), "Indian medicinal herbs as sources of antioxydants" Food Research International 41(1): p 1-15 40 Amirghofran Zahra(2011), "Herbal Medicines for Immunosuppression" Iran J Allergy Asthma Immunol 11(2): p 111-119 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 81 41 Arreola Rodrigo(2015), "Immunomodulation and Anti-Inflammatory Effects of Garlic Compounds" Journal of Immunology Research 2015: p 42 Bhalerao Satish A(2013), "Phytochemistry, Pharmacological Profile and Therapeutic Uses of Piper Betle Linn An Overview" Research & Reviews: Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 1(2): p 10 43 Block Keith I.(2012), "Immune System Effects of Echinacea, Ginseng, and Astragalus: A Review" Integrative cancer therapies 2(3): p 247 44 Curry Michael, Brooks Austin, and Bruns Heather A.(2016), "The Effect of Lonicera japonica on LPS-Stimulated B-Cell Functions" Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants 22(2): p 139-147 45 Chen Yanfen, et al.(2015), "Antinociceptive and anti-inflammatory activities of Schefflera octophylla extracts" Journal of Ethnopharmacology 171: p 42-50 46 de Abreu Costa Lucas, et al.(2017), "Dimethyl Sulfoxyde (DMSO) Decreases Cell Proliferation and TNF-α, IFN-γ, and IL-2 Cytokines Production in Cultures of Peripheral Blood Lymphocytes" Molecules 22(11): p 1789 47 Dickinson Becton(2017), "BD Multitest™ CD3/CD8/CD45/CD4" p - 48 Duduku Krishnaiah, Rosalam Sarbatly, and Rajesh Nithyanandam(2011), "A review of the antioxydant potential of medicinal plant species" Food and Bioproducts Processing 89(3): p 217-233 49 Gaffen Sarah L and Liu Kathleen D.(2004), "Overview of interleukin-2 function, production and clinical applications" Cytokine 28(3): p 109-123 50 Garg Ramesh C., Chapter 44 - Fenugreek: Multiple Health Benefits, in Nutraceuticals, R.C Gupta, Editor 2016, Academic Press: Boston p 600 51 Grice(1988), "Enhanced tumour development by butylated hydroxyanisole (BHA) from the prospective of effet on forestomach and oesophageal squanous epithelium" Food Chem Toxycol 26: p 717 - 723 52 Huang Guo N.(2012), "ELISA Measurement of Mouse IL-2" Bio-protocol 2(1): p e169 53 Ilangkovan Menaga(2015), "Immunosuppressive effects of the standardized extract of Phyllanthus amarus on cellular immune responses in Wistar-Kyoto rats" Drug Design, Development and Therapy 9: p 4917 54 Kainthla R P.(2006), "Effect of Hemidesmus indicus (Anantmool) extract on IgG production and adenosine deaminase activity of human lymphocytes in vitro" Indian J Pharmacol 38(3): p 190 - 193 55 Kleiveland Charlotte R (2015), The Impact of Food Bioactives on Health : In vitro and Ex Vivo Models Springer 161 - 165 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 82 56 Kleiveland Charlotte R (2015), The Impact of Food Bio-Actives on Health: In vitro and Ex vivo models Springer Open 161 - 165 57 Kloverpris Henrik, et al.(2010), "Dimethyl sulfoxyde (DMSO) exposure to human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) abolish T cell responses only in high concentrations and following coincubation for more than two hours" Journal of Immunological Methods 356(1): p 70-78 58 Koleva, II, et al.(2002), "Screening of plant extracts for antioxydant activity: a comparative study on three testing methods" Phytochem Anal 13(1): p 817 59 Kothavade Pankaj S., et al.(2015), "Therapeutic Effect of Saponin Rich Fraction of Achyranthes aspera Linn on Adjuvant-Induced Arthritis in Sprague-Dawley Rats" Autoimmune Diseases 2015: p 943645 60 Khan Adnan, et al.(2016), "Camellia sinensis Mediated Enhancement of Humoral Immunity to Particulate and Non-particulate Antigens" 30(1): p 41-48 61 Lakshmanan Imayavaramban and Batra Surinder K.(2013), "Protocol for Apoptosis Assay by Flow Cytometry Using Annexin V Staining Method" Bio-protocol 3(6): p e374 62 M Pisoschi A.(2016), "Antioxydant Capacity Determination in Plants and Plant-Derived Products: A Review" Oxyd Med Cell Longev 2016: p 9130976 63 Madhavan H N.(2007), "Simple Laboratory methods to measure cell proliferation using DNA synthesis property" Journal of Stem Cells & Regenerative Medicine 3(1): p 12-14 64 Molyneux Philip(2004), "The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxydant" Journal of Science Technology: p 212 65 Namita Parmar(2012), "Camellia Sinensis (Green Tea): A Review" Global Journal of Pharmacology 6(2): p 52 - 59 66 Nirmal Nilesh P., et al.(2015), "Brazilin from Caesalpinia sappan heartwood and its pharmacological activities: A review" Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 8(6): p 421-430 67 Nomani Irshad(2013), "Wedelia chinensis (Asteraceae)- An Overview Of A Potent Medicinal Herb" International Journal of PharmTech Research 5(3): p 957 - 964 68 Partap Sangh(2012), "A Review on Herbal Antioxydants" Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 1(4): p 26-38 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 83 69 Pawar Harshal A.(2011), "Cassia tora linn.: An overview" IJPSR 2(9): p 2286 - 2291 70 Pourahmad Jalal and Salimi Ahmad(2015), "Isolated Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC), a Cost Effective Tool for Predicting Immunosuppressive Effects of Drugs and Xenobiotics" Iranian Journal of Pharmaceutical Research : IJPR 14(4): p 979-979 71 Prieto Jose M.(2012), "Procedure: Preparation of DPPH Radical, and antioxydant scavenging assay" p 1-3 72 Pham-Huy Lien Ai, He Hua, and Pham-Huy Chuong(2008), "Free Radicals, Antioxydants in Disease and Health" International Journal of Biomedical Science : IJBS 4(2): p 89-96 73 Rai Ravishankar V.(2012), "Medicinal use of Coscinium fenestratum (Gaertn.) Colebr.: an short review" Oriental Pharmacy and Experimental Medicine 13(1): p 1-9 74 Rai Yogesh, et al.(2018), "Mitochondrial biogenesis and metabolic hyperactivation limits the application of MTT assay in the estimation of radiation induced growth inhibition" Scientific Reports 8(1): p 1531 75 Rodríguez-Burford C., et al.(2003), "The use of dimethylsulfoxyde as a vehicle in cell culture experiments using ovarian carcinoma cell lines" Biotechnic & Histochemistry 78(1): p 17-21 76 Romar George A., Kupper Thomas S., and Divito Sherrie J.(2016), "Research Techniques Made Simple: Techniques to Assess Cell Proliferation" Journal of Investigative Dermatology 136(1): p e1-e7 77 Singh Mahipal(2017), "Effect of dimethyl sulfoxyde on in vitro proliferation of skin fibroblast cells" Effect of dimethyl sulfoxyde on in vitro proliferation of skin fibroblast cells 8: p 78 78 Singh Namrata(2016), "A review on herbal plants as immunomodulators" International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research 7(9): p 3602 - 3610 79 Tcheghebe Olivier Tene(2017), "Ethnobotanical uses, phytochemical and pharmacological profiles, and toxycity of Cassia alata L An overview" Landmark Research Journals of Medicine and Medical Sciences 4(2): p 16 24 80 Timm Michael, et al.(2013), "Considerations regarding use of solvents in in vitro cell based assays" Cytotechnology 65(5): p 887-894 81 Tungpradit Rudeewan(2010), "Anti-Cancer Compound Screening and Isolation: Coscinium fenestratum, Tinospora crispa and Tinospora cordifolia" Chiang Mai J Sci 37(3): p 476 - 488 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 84 82 van der Velden V H.(1998), "Glucocorticoids: mechanisms of action and anti-inflammatory potential in asthma" Mediators of Inflammation 7(4): p 229-237 83 Wang L., Wang F S., and Gershwin M E.(2015), "Human autoimmune diseases: a comprehensive update" J Intern Med 278(4): p 369-95 84 Wichi(1986), "Safety evaluation of butylated hydroxytoluene (BHT) in the liver, lung and gastrointestinal tract" Food Chem Toxycol 24: p 1127 1130 85 Wu Yi-Chian and Hsieh Ching-Liang(2011), "Pharmacological effects of Radix Angelica Sinensis (Danggui) on cerebral infarction" Chinese Medicine 6: p 32-32 86 Zhang Min and Huang Bing(2012), "The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells" Stem Cell Research & Therapy 3(6): p 48-48 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 85 PHỤ LỤC Phụ lục Dữ liệu phân tích TCD3+/CD4+ TCD3+/CD8+ (viện Pasteur TP.HCM cung cấp) .1 Phụ lục Dữ liệu phân tích Apoptosis/Necrosis (viện Sinh học Nhiệt Đới TP.HCM cung cấp) .3 Phụ lục Các đường chuẩn hệ số R2 cho thử nghiệm chống oxy hóa DPPH Phụ lục Giấy chấp thuận Hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh .6 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL – Phụ lục Dữ liệu phân tích TCD3+/CD4+ TCD3+/CD8+ (viện Pasteur TP.HCM cung cấp) Mẫu chứng Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL – Mẫu thử Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL – Phụ lục Dữ liệu phân tích Apoptosis/Necrosis (viện Sinh học Nhiệt Đới TP.HCM cung cấp) Mẫu chứng Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL – Mẫu thử Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL – Phụ lục Các đường chuẩn hệ số R2 cho thử nghiệm chống oxy hóa DPPH STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 32 Tên Hồng kỳ Cam thảo Sài đất Tơ mộc Trầu khơng Ngũ gia bì Kim ngân hoa Muồng trâu Tên phân đoạn Toàn phần Cloroform Etyl acetat Nước Toàn phần Cloroform Etyl acetat Nước Toàn phần Cloroform Etyl acetat Nước Toàn phần Cloroform Etyl acetat Nước Toàn phần Cloroform Etyl acetat Nước Toàn phần Cloroform Etyl acetat Nước Toàn phần Cloroform Etyl acetat Nước Toàn phần Cloroform Etyl acetat Nước Vitamin C Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đường chuẩn Hệ số R2 EC50 (ppm) Y = 0.4422*X + 9.348 Y = 0.479*X + 8.295 0,9904 0,9938 Y = 0.126*X + 4.452 Y = 0.7376*X + 7.275 Y = 0.7745*X + 6.456 0,9897 0,9828 0,9854 Y = 1.995*X + 6.593 0,9949 Y = 3.25*X + 2.585 Y = 2.814*X + 4.432 Y = 3.011*X + 15.2 Y = 0.7231*X - 0.5112 Y = 2.754*X + 2.135 Y = 23.92*X + 3.564 Y = 0.2732*X + 1.448 0,9974 0,97 0,9989 0,9997 0,9951 0,989 Y = 0.2481*X + 1.054 Y = 0.4509*X - 3.585 Y = 3.25*X + 8.44 0,9817 0,996 0,9975 Y = 1.284*X + 7.33 Y = 0.2377*X + 0.8508 Y = 2.442*X + 32.53 Y = 1.251*X + 5.591 0,992 > 400 91,94 87,07 > 400 361,46 57,92 56,22 > 400 > 400 21,76 > 400 > 400 14,59 16,19 11,56 69,85 17,38 1,94 177,73 > 400 197,29 118,8441781 12,78824834 > 400 33,23 0,9871 206,7318303 0,9306 0,9919 7,15 35,49 >400 245,68 70,37 > 400 4,09 Y = 0.183*X + 5.032 Y = 0.719*X - 0.6003 0,9869 0,994 Y = 11.75*X + 1.921 0,9997 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL – Phụ lục Giấy chấp thuận Hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... ức chế tăng sinh tế bào lympho miễn dịch để ứng dụng điều trị, thực đề tài ? ?Khảo sát tác động tăng sinh in vitro tế bào đơn nhân máu ngoại vi người (PBMCs) hoạt tính chống oxy hóa số dược liệu? ??... VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LÊ THỊ THẢO NGUYÊN KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRÊN SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI (PBMCs) VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG... ĐỘNG TRÊN SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI (PBMCs) VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU Lê Thị Thảo Nguyên Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Minh Thuận