Thu nhận hợp chất Alkaloid từ nuôi cấy in vitro tế bào cây dừa cạn

Thu nhận hợp chất Alkaloid từ nuôi cấy in vitro tế bào cây dừa cạn

MỤC LỤC Mở đầu: .2 I Tổng quan HCTC ALKALOID: A Hợp chất thứ cấp: Định nghĩa: .4 Vài nét tình hình nghiên cứu HCTC Việt Nam: .4 B Alkaloid: Lịch sử phát triển: Khái niệm Alkaloid: II Thu nhận hợp chất Alkaloid từ loài Catharanthus roseus (L.) G.Don phương pháp nuôi cấy tế bào: III Thu nhận Alkaloid từ nuôi cấy in vitro tế bào dừa cạn: 16 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào: 18 Nuôi cấy mô sẹo: 19 Hột nhân tạo: 20 Nuôi cấy mô phân sinh: 21 Nuôi cấy rễ tơ: 22 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng: 22 Tài liệu tham khảo: 28 MỞ ĐẦU Ngày khơng phủ nhận tầm quan trọng công nghệ sinh học kinh tế quốc dân nước ta nói riêng giới nói chung Thế kỷ 21 coi kỷ ngành công nghệ sinh học.Việt Nam nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho phát triển thực vật coi kho tàng vô giá nguồn hợp chất tự nhiên nguồn nguyên liệu để phát triển ngành công nghệ sinh học nước nhà Trong năm gần đây, công nghệ tách chiết hợp chất từ thực vật không ngừng phát triển và bước đầu đạt thành đáng kể Trên giới từ lâu người ta ứng dụng công nghệ để sản xuất chất có hoạt tính sinh học, phục vụ cho nghiên cứu, sản xuất phục vụ lợi ích người Những nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học thực vật phát triển từ năm 1950 Có khoảng 30.000 hợp chất chiết xuất từ thực vật có hoạt tính có giá trị sống Những hợp chất alkaloid, terpenoid, phenolic… biết đến hợp chất thứ cấp Các hợp chất thường tạo số loại tế bào định tế bào rễ tơ, biểu mô, hoa, lá… Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu đạt nhiều thành tựu quan trọng nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học (thường gọi chất thứ cấp) cịn khó tổng hợp tổng hợp chi phí đắt Chẳng hạn, số hỗn hợp phức tạp tinh dầu hoa hồng khơng thể tổng hợp hóa học Ngày nay, hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học phân lập từ cỏ ứng dụng nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp chăm sóc sức khoẻ người Chúng dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm v.v Mặc dù cơng nghệ tổng hợp hố dược ngày phát triển mạnh mẽ, tạo biệt dược khác sử dụng công tác phịng, chữa bệnh, nhờ giảm tỷ lệ tử vong nhiều song đóng góp thảo dược khơng mà chỗ đứng Y học Nó tiếp tục dùng nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp cung cấp chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm dược phẩm cho việc điều trị bệnh thông thường bệnh nan y Tuy nhiên nguồn thực vật thiên nhiên ngày hạn hẹp,hơn nựa chiết xuất hợp chất từ thiên nhiên thường hiệu suất không cao.Ứng dụng nuôi cấy tế bào đơn để thu nhận hợp chất tự nhiên hướng cho ngành công nghệ sinh học nay.Một nhữ hợp chất thu nhận thành công từ nuôi cấy tế bào đơn hợp chất alkaloid I.TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT THỨ CẤP VÀ ALKALOID A.HỢP CHẤT THỨ CẤP 1.Định nghĩa: Sản phẩm trao đổi chất bậc hai hay hợp chất thứ cấp sản phẩm tạo tế bào nhờ trình trao đổi chất xảy tế bào,sau chúng khỏi tế bào mơi trường ngồi Phần lớn sản phẩm bậc hai thường khơng có ý nghĩa sinh lý thân tế bào.Quá trình tạo sản phẩm bậc hai thông qua chế chuyển hóa tự nhiên tế bào,cũng sai lệch thơng tin di truyền tế bào dẫn đến tượng sinh tổng hợp thừa Thực vật nguồn cung cấp hợp chất dùng làm dược liệu phụ gia thực phẩm có giá trị Những sản phẩm biết chất trao đổi thứ cấp, thường hình thành với lượng nhỏ chức trao đổi chất chưa biết đầy đủ Chúng dường sản phẩm phản ứng hóa học thực vật với môi trường bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật động vật Những nghiên cứu hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật phát triển từ cuối năm 50 kỷ 20 (Rao cs 2002) Các chất trao đổi thứ cấp xếp ba nhóm alkaloid, tinh dầu glycoside 2.Vài nét tình hình nghiên cứu hợp chất thứ cấp Việt Nam Ở Việt Nam, công nghệ tách chiết hợp chất thứu cấp chủ yếu gắn liền với công nghệ nuôi cấy tế bào chúng phát triển vào năm 1970 Từ đến đạt nhiều thành cơng, đáng kể quy trình sản xuất sâm Ngọc Linh Học viện Quân y khai thác Phương pháp sản xuất sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh cấp độc quyền sáng chế số 7523 vào ngày 11/02/2009 Việt Nam Việt Nam triển khai dự án nuôi cấy chiết xuất taxol từ thông đỏ Lâm Đồng Ngồi cịn có “Nghiên cứu sản xuất arteminisin dùng kỹ thuật nuôi cấy tế bào từ hao hoa vàng” Viện Sinh học Nhiệt đới nghị định thư hợp tác với Malaysia (2007-2010) hay đại học Huế “Nghiên cứu khả tích lũy glycoalkaloid callus cà gai leo Solanum hainanense” Tuy nhiên, dự án nói cịn quy mơ phịng thí nghiệm B Alkaloid Lịch sử phát Năm 1804- 1805, pháp Đức phân lập morphin điều chế dạng muối Đồng thời chứng minh morphin hoạt chất thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt Năm 1980, từ vỏ canhkina, chiết kết tinh chất đặt tên “cinchonino” sau hai nhà hóa học pháp xác định cinchonino hỗn hợp hai alcaloid quinin cinchonin Năm 1918, phát alcaloid hạt mã tiền strycnin bruxin Năm 1918 phát cafein chè, cà phê sau nicotin thuốc lá, atropin cà độc dược, theobromin cacao, codein thuốc phiện, cocain coca Giữa năm 1973, người ta xác định 4959 Alcaloid khác có 3293 chất xác định cơng thức hóa học Hiện phát nhiều số lượng Alcaloid đưa vào ứng dụng y học ngày tăng Khái quát Alkaloid 2.1 Khái niệm Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập kiềm Alkaloid là: - Những hợp chất hữu có chứa dị vịng nitơ, có tính bazơ thường gặp nhiều lồi thực vật đơi cịn tìm thấy vài lồi động vật - Có phản ứng kiềm cho muối với acid muối dễ kết tinh - Có hoạt tính sinh học quan trọng - Có số phản ứng chung tạo “tủa“ cần thiết cho xác định chúng Chúng nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng nhiều mặt Đặc biệt lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao độc đáo 2.2 Cấu tạo hóa học Về mặt hóa học, phong phú đa dạng alkaloid trở thành chuyên nghành, chiếm vị trí quan trọng lĩnh vực nghiên cứu tạp chí thơng tin hóa học Đối với việc nghiên cứu alkaloid cịn quan trọng chúng có hệ thực vật nhiệt đới phong phú nguồn cung cấp alkaloid chủ yếu Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có nguyên tử N phân tử, chủ yếu nằm vịng Có ý kiến xếp hợp chất có N ngồi vịng Colchicin, Hordenin, protoalkaloid Sự có mặt nguyên tử N cấu trúc định tính bazơ alkaloid chỗ dựa quan trọng cho nhà hóa học nghiên cứu alkaloid 2.3 Phân loại Đã biết có đến 250 dạng cấu trúc khác với 5.500 hợp chất alkaloid tự nhiên Vì cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân trước (khoảng 20 nhóm cấu trúc) xét chưa đáp ứng nên ngày có xu hướng chia chúng thành nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin, Yohimbin, Strychnin, Echitamin Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin chia thành nhóm: Benzyliaoquinolin, Apocphin, Protobecberin, Benzophenanthridin Bảng 1:Một số dạng cấu trúc nhóm Alkaloid Tên cấu trúc Cơng thức Hợp chất thí dụ Apocphin Stephanin, Apomocphin Erythrinan Erythratin Pyrolidin Nicotin, Stachydrin, Hygrin Indol Reserpin, Strychnin, Echitamin Mocphinan Mocphin, Codein Purin Cafein, Theophylin Pyridin Rixinin Pyroligidin Heliotridin Quinolin Dictamnin Steroit Solasodin, Tomatidin Tropan Hyosxinamin,Cocain II.THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT ALKALOID TỪ LOÀI Catharanthus roseus (L.) G Don BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO Catharanthus roseus Tên khác: Bông dừa, Hải đăng, Hải đằng Tên khoa học: Catharanthus roseus (L.) G Don Tên đồng nghĩa: Vinca rosea L Họ: Trúc đào (Apocynaceae) Tên nước ngoài: Madagasca Periwinkle, Pervenche mangache Thân cỏ nhỏ, mọc đứng, phân nhiều cành, cao 40-60 cm Thân hình trụ có khía dọc, có lơng ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, dầu nhọn, dài 4-7 cm, rộng 2-3 cm, mặt sẫm, mặt nhạt, có lơng Cuống ngắn, dài 3-5 mm Gân hình lơng chim lồi mặt dưới, 12-14 cặp gân phụ lồi mặt dưới, cong hướng lên Cụm hoa : Hai hoa kẽ Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5; cuống hoa dài 4-5 mm Lá đài 5, dính dưới, chia thành thùy hình tam giác hẹp, có lơng mặt ngồi, dài 3-4 mm Cánh hoa 5, dính Ống tràng màu xanh, cao 2-4 cm, phình gần họng, mặt ngồi có chấm lồi; thùy có màu đỏ hay hồng tím , trắng , …ở mặt trên, mặt màu trắng, dài 1,5-1,7 cm, miệng ống tràng có nhiều lơng có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng hoa màu hồng tím)Tiền khai hoa vặn chiều kim đồng hồ Nhị : rời, đính phần phình ống tràng, xen kẽ cánh hoa,chỉ nhị ngắn Bao phấn hình mũi tên, hướng trong, khai dọc, đính đáy Các bao phấn chụm đầu nhụy Hạt phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc Lá nỗn : rời bầu dính vịi đầu nhụy, mặt ngồi có nhiều lơng, nỗn mang nhiều nỗn, đính nỗn mép, bầu Vịi nhụy: dài ống tràng, dạng sợi màu trắng Đầu nhụy hình trụ, màu xanh, đỉnh có thùy nhọn, phía có màng mỏng màu vàng đĩa mật màu vàng, hình tam giác hẹp nằm xen kẽ noãn đại dài 3-5 cm, chứa 12-20 hạt, xếp thành hàng Hạt nhỏ, hình trứng 10 Hoạt chất Dừa cạn alkaloid có nhân indol tất phận cây, nhiều rễ Dừa cạn Việt Nam có tỷ lệ alkaloid toàn phần 0,1-0,2% Rễ chứa hoạt chất (0,7-2,4%) nhiều thân (0,46%) (0,37-1,15%) Các chất chủ yếu là: vinblastin, vincristin tetrahydroalstonin, prinin, vindolin, catharanthin, vindolinin, ajmalicin, vincosid (1 glucoalkaloid tiền thân để sinh tổng hợp alkaloid) Từ Dừa cạn, người ta chiết chất sau: acid pyrocatechic, sắc tố flavonoid (glucozid quercetol campferol) anthocyanic từ thân dừa cạn hoa đỏ Ngoài từ chiết acid ursoloc, từ rễ chiết cholin Tác dụng dược lý - Công dụng: Dừa cạn dùng làm thuốc kiềm tế bào dẫn điều trị bệnh Hodgkin, bệnh bạch cầu lympho cấp, số ung thư Trong dân gian dùng trị cao huyết áp, trị bệnh tiểu đường, điều kinh, chữa tiêu hóa chữa lỵ, thơng tiểu tiện, chữa bệnh tiểu đỏ Có người trị ung thư máu, ung thư phổi, tẩy giun, chữa sốt, lợi tiểu mạnh, Thân có tính chất săn da, lọc máu, dùng chữa số bệnh ngồi da III.THU NHẬN ALKALOID TỪ NI CẤY INVITRO TẾ BÀO CÂY DỪA CẠN Mô sẹo màu xanh nuôi điều kiện chiếu sáng từ dừa cạn in vitro tháng tuổi chuyển vào 100 ml môi trường cảm ứng erlen 250 ml Môi trường cảm ứng gồm môi trường MS + Vitamin Morel + Hormon tăng trưởng thực vật (NAA 2,4-D Kinhoặc BAP) + 30g/l đường sucrose Sau đặt vào máy lắc 200 vòng/phút nhiệt độ 25± 2oC 14 điều kiện chiếu sáng liên tục 16 giờ/ngày Cũng làm theo cách tương tự thay nồng độ đường 30g/l nồng độ đường 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l nồng độ hormon tăng trưởng tối ưu thí nghiệm Xác định sinh khối phương pháp cân Chiết tách alkaloid toàn phần từ sinh khối tế bào Dừa cạn theo phương pháp Kutney cộng (1983) Cây dừa cạn tự nhiên Khử trùng mẫu ni cấy điều kiện thích hợp Cây dừa cạn in vitro Mô sẹo Dịch huyền phù tế bào Nuôi cấy mô sẹo điều kiện chiếu sáng 1000 lux Sinh khối 15 Chuyển mô sẹo sang môi trường lỏng để nuôi cấy dịch huyền phù Định lượng alkaloid Nuôi cấy 28 ngày 16 1.Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Nhiều nghiên cứu thử nghiệm việc thu nhận huyền phù tế bào nuôi cấy cho suất thu indole alkaloid cao, đặc biệt vinblastine vincristine Phương pháp sản xuất catharanthine ajmalicine dịch huyền phù nuôi cấy bioreactor thành công Moreno cộng (1996) nghiên cứu ảnh hưởng chất cảm ứng lên đường chuyển hóa khác liên quan đến q trình chuyển hóa hợp chất thứ cấp ni cấy huyền phù tế bào C.roseus Dịch trích tế bào nấm Phytium aphanidermatum tiệt trùng dùng nghiên cứu Những tế bào C.roseus biến đổi q trình chuyển hóa chúng để phản ứng lại tác động nấm Zhao cộng (2001) thử nghiệm nhiều chất cảm ứng nấm nhận từ 12 loại nấm ảnh hưởng chúng lên việc cải thiện sản xuất indole alkaloid huyền phù tế bào C.roseus Những kết cho thấy chất chiết từ nấm khác kích thích tích lũy indole alkaloid khác nhau, gấp đến lần nuôi cấy thường Zhao cộng (2001) tăng sản phẩm catharanthine tế bào nuôi cấy C.roseus cách kết hợp chất cảm ứng ni bình lắc bioreactor Tác động tổng hợp lên tích lũy alkaloid tế bào nuôi cấy theo dõi chúng xử lý với vài kết hợp chất cảm ứng nấm hóa chất Sự kết hợp tetramethyl ammonium bromide nấm sợi Aspergillum niger cho hiệu suất thu ajmalicine cao cải thiện tích lũy catharanthine Trong kết hợp chất cảm ứng malate sodium alginate cho kết hiệu suất catharanthine cao tích lũy ajmalicine cao tế bào ni cấy Các tác giả sau phát triển quy trình để nâng cao việc sản xuất catharanthine tế bào C.roseus ni bình lắc bioreactor Sau 10 ngày nuôi cấy thu catharanthine với hiệu suất theo thứ tự 25 mg/l, 32mg/l 22 mg/l bình lắc 500 ml, 1,000 ml bioreactor dạng sục khí 20 lít Tác giả quan sát thấy kết hợp việc xử lý malate alginate kích thích phản ứng lại, ví dụ oxy hóa lipid xảy hầu hết q trình ni cấy C.roseus điều gián tiếp sản xuất indole alkaloid thông qua đường jasmonate Nuôi cấy mơ sẹo Những mơ sẹo nguồn cung cấp alkaloid chính, phổ biến nhất, cung cấp vật liệu khởi đầu cho thiết lập q trình ni cấy huyền phù cho việc cảm ứng quan chồi rễ Những khảo sát có liên quan đến hình thành rễ từ mô sẹo C.roseus công bố Dhruva cộng (1977) Việc tái sinh C.roseus khỏe mạnh thực từ mơ sẹo thơng qua việc làm lây nhiễm với mycoplasma-like organisms (MLOs) Mollers Sarkar (1989) làm nhiễm chỗ cắt đốt thân C.roseus với loại MLOs khác nuôi chúng môi trường dinh dưỡng MS rắn Mơ sẹo hình thành mô bị nhiễm, phân vào cây, sau chuyển sang mơi trường MS có bổ sung 1-naphthyl acetic acid (NAA) 1.0 mg/l, 6-benzyl aminopurine (BAP) 0.25 mg/l gentamycin 10.0 ml/l Những sau dễ dàng thích nghi với điều kiện nhà kính nơi chúng nuôi năm Việc nhuộm màu với fluorochoromes DAPI (4’,6- diamidino-2phenylindole) berberine sulfate chứng minh vắng mặt MLOs tái sinh Ramavat cộng (1978) mô tả q trình hình thành chồi non C.roseus từ mơ sẹo Sự tái sinh từ tế bào mô sẹo đơn bội hay lưỡng bội C.roseus kết hợp với việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật kinetin β-indolylacetic acid (IAA) thực AbouMandour cộng (1979) Phương pháp cho tần số C.roseus tái sinh cao cách tạo phôi soma mô tả Kin cộng (1994) Tác giả thu mô sẹo từ bao phấn C.roseus sử dụng môi trường MS rắn bổ sung NAA 1.0 mg/l kinetin 0.1 mg/l (MSNK) Những phơi soma hình thành sau chuyển mô sẹo vào môi trường MSNK lỏng Những trồng có số nhiễm sắc thể trồng từ hạt (2n=16) Pietrosiuk cộng (1999) thành lập hai dịng mơ sẹo C.roseus trắng xanh (hình 17d, e) môi trường Gamborg rắn bổ sung với 0.1 mg/l kinetin 1.0 mg/l IAA Mô sẹo lấy từ đoạn trụ mầm C.roseus giống Dịng mơ sẹo trắng chọn từ mô xanh phát triển pha tĩnh Trái ngược với rắn dịng mơ sẹo màu xanh, dịng màu trắng lại mịn mềm Phương pháp HPLC phân tích chất chiết từ mơ sẹo hai dịng mơ sẹo xanh mơ sẹo trắng cho thấy indole alkaloid tồn dạng vết khơng có dược tính Ni hạt nhân tạo Krueger cộng (1982) tạo có ni cấy từ hạt C.roseus nảy mầm vơ trùng môi trường Murashige Skoogs Revised Tobacco (MS RT) có bổ sung benzyladenine (BA), với đặc điểm nhân giống nhanh chóng sản xuất alkaloid vindoline, ajmalicine, sitsiriline, tetrahydroalstonine serpentine Q trình ni cấy cho thấy phát triển sản xuất vindole nhanh chóng nhiều hỗn hợp alkaloid khác, bao gồm alkaloid khơng tìm thấy nguyên vẹn Miura cộng (1988) cô lập đựơc vinblastine từ chồi non C.roseus nuôi cấy lấy từ nảy mầm từ hạt Lượng vinblastine thu đựơc 15µg/g chất khơ cao mô sẹo (Miura et al 1987) Kết cho thấy sản xuất vinblastine liên quan đến hình thành chồi Ni cấy mơ phân sinh Sự nhân giống từ mô phân sinh phương pháp hữu ích để sản xuất nhanh sinh khối phục vụ cho y học Nó cho phép khả tái tạo kiểu gen ổn định không thay đổi Alen cộng (1995) đề xướng việc nhân giống in vitro C.roseus cách nuôi dưỡng mô phân sinh chồi nách từ ni nhà kính Các tác giả sử dụng môi trường MS có bổ sung BA 2,4-D nồng độ thấp Những chồi nách hình thành chồi sau 4-5 tuần nuôi cấy Một phần cành nhân giống chuyển vào nuôi cấy tiếp môi trường tự Sau chúng cắt cho tạo rễ in vitro môi trường MS bổ sung với NAA phát triển nhà kính với độ ẩm tương đối 100% Trong trường hợp thành công Furmanowa cộng (1991, 1994) thành công việc áp dụng phương pháp cho nhân giống C.roseus Tác giả tái sinh từ chồi chồi nách Những chồi cắt từ ngày tuổi nuôi môi trường rắn Nitsch Nitsch (NN) (Nitsch Nitsch 1969) bổ sung thêm kinetin, bezyladenine, indole-3-butyric acid (IBA) IAA kết hợp với Sau tháng ni cấy có rễ cắt chuyển vào môi trường Những phải gồm có chồi chồi nách Khoảng 200 mọc rễ (hình 17a, b) thu từ Sau chúng phát triển nhà mái vòng nhựa nhà kính (hình1c) Sau tháng sinh trưởng chúng thu nhận, sấy cân Việc phân tích thành phần hóa học thực Vindoline catharanthine chiếm ưu giai đoạn non (trước hoa) Hàm lượng alkaloid tổng nuôi cấy in vitro chuyển sang mơi trường đất cao trồng đất Nuôi cấy rễ tơ Trong năm gần đây, phương pháp nuôi cấy rễ, chủ yếu rễ tơ C.roseus tăng lên đáng kể mong đợi, nguồn tiềm hợp chất có giá trị chữa bệnh Sự phát triển kỹ thuật vi nhân giống phương pháp để mở rộng việc nuôi cấy rễ in vitro quan trọng trở thành giải pháp quan trọng để giải việc thu nhận indole alkaloid từ nguyên liệu thô Những yếu tố di truyền rễ tơ, thu nhiễm với ... không cao.Ứng dụng nuôi cấy tế bào đơn để thu nhận hợp chất tự nhiên hướng cho ngành công nghệ sinh học nay.Một nhữ hợp chất thu nhận thành công từ nuôi cấy tế bào đơn hợp chất alkaloid I.TỔNG... thức Hợp chất thí dụ Apocphin Stephanin, Apomocphin Erythrinan Erythratin Pyrolidin Nicotin, Stachydrin, Hygrin Indol Reserpin, Strychnin, Echitamin Mocphinan Mocphin, Codein Purin Cafein, Theophylin... Cafein, Theophylin Pyridin Rixinin Pyroligidin Heliotridin Quinolin Dictamnin Steroit Solasodin, Tomatidin Tropan Hyosxinamin,Cocain II .THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT ALKALOID TỪ LOÀI Catharanthus roseus