Phương pháp thu nhận và ứng dụng hợp chất curcumin trong củ nghệ

Phương pháp thu nhận và ứng dụng hợp chất curcumin trong củ nghệ

1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỀ TÀI:PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG HỢP CHẤT CURCUMIN TRONG CỦ NGHỆ GVHD: NGUYỄN THỊ THỦY TIÊN SV : TRƯƠNG THỤY TRÀ MY 60801296 NGUYỄN THỤY ANH THƯ 60802186 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH I Tổng quan I.1 Giới thiệu nghệ I.1.1 Nguồn gốc – Phân bố I.1.2 Phân loại I.1.3 Đặc điểm I.1.4 Sinh trưởng I.1.5 Thành phần hóa học củ nghệ I.2 Giới thiệu curcumin I.2.1 Cấu trúc hóa học đặc tính hóa lý curcumin I.2.2 Tính chất vật lý I.2.3 Tính chất hóa học đặc trưng 10 II.Nhân giống nghệ (curcuma) phương pháp in vitro 10 II.1.Sơ lược phương pháp vi nhân giống 10 II.2.Phương pháp thực 11 II.3.Các yếu tố ảnh hưởng 11 III.Thu nhận curcumin 12 III.1.Phương pháp chưng cất lôi nước 13 III.2.Phương pháp dùng dung môi dễ bay 15 III.3.Phương pháp dùng bình Soxhlet 17 III.4.Phương pháp dùng dung dịch chất lưỡng cực (aqueous hydrotrope solution) 17 III Ứng dụng curcumin 21 III.1 Hoạt tính chống oxy hóa 21 III.2 Hoạt tính kháng viêm 22 III.3 Hoạt tính chống đông máu 23 III.4 Ngăn cản điều trị ung thư 23 III.5 Tính kháng virus, vi khuẩn, nấm kí sinh trùng 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình I.1: Cây nghệ Hình I.2: Một số lồi nghệ Hình I.3: Cấu trúc hóa học curcuminoid Hình I.4: Các hợp chất curcuminoid Hình I.5: Đồng phân hình học dạng cis-trans curcumin Hình I.6: Dạng keto enol curcumin Hình II.1: Bình Soxhlet Hình II.2: Các lớp tế bào củ nghệ Hình II.3: Sự phá vỡ cấu trúc lớp tế bào củ nghệ sau bị chất lưỡng cực thâm nhập I Tổng quan I.1 Giới thiệu nghệ Hình I.1: Cây nghệ I.1.1 Nguồn gốc – Phân bố Nghệ - curcuma chi thuộc họ Gừng (Zingiberaceae).Curcuma tên Latin xuất phát từ từ “Kourkoum”, từ mang gốc Ả Rập nghĩa “có màu vàng” Ngày nghệ vàng trồng Ấn Độ, Pakistan, Malaysia, Myanmar, Việt Nam, Thái Lan, Philippines, Nhật, Trung Quốc, Hàn Quốc, Sri Lanka, Nepal, hịn đảo Nam Thái Bình Dương, Đơng Tây Phi, đảo biển Caribbean, châu Mỹ, Ấn Độ nơi sản xuất xuất nghệ vàng chủ yếu [1] Nghệ mọc hoang dại phân bố khắp vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Tại Việt Nam, mọc hoang dại trồng khắp nơi Ở Ấn Độ, nghệ vàng sử dụng từ lâu đời: dùng làm gia vị, dùng phương thuốc truyền thống người Ấn Độ Ngày nay, cịn dùng cơng nghiệp thực phẩm (chủ yếu chất màu), công nghiệp dược phẩm (chống oxi hóa, chữa bệnh, …) mỹ phẩm (sản phẩm dưỡng, làm đẹp da) 5 I.1.2 Phân loại Chi nghệ gồm khoảng 1400 loài (a) (b) (c) (d) Hình I.2: Một số lồi nghệ (a) Curcuma aromaticum (b) Curcuma aeruginosa (c) Curcuma singularis (d) Curcuma purpurascens I.1.3 Đặc điểm Nghệ thân thảo, cao 0.6 – m Lá có hình dải trái xoan, dài 45cm, rộng 18cm, hai mặt nhẵn Cuống có bẹ mang lông Hoa mọc từ lá, hợp thành hình trụ, mang cán dài Lá bắc có màu trắng hay lục Các bắc phớt tím nhạt Đài khơng Tràng hoa hình ống khơng đều, thùy lớn có mũi nhọn Bầu có lơng, vịi nhẵn Quả nang mở van Thân rễ gọi khương hoàng, rễ củ gọi uất kim Củ nặng, dài - cm, đường kính – cm Mặt ngồi xám nâu, nhăn nheo Đơi cón lại vết tích nhánh rễ phụ Củ có mùi thơm hắc, vị cay Cắt ngang củ thấy rõ hai vùng : vỏ trụ Trụ chiếm chừng 2/3 bán kính củ I.1.4 Sinh trưởng Nghệ phát triển điều kiện nhiệt đới khác nhau, từ đồng độ cao 1500m, thích nghi tốt khoảng nhiệt độ 20-30°C Đặc biệt, nghệ phát triển tốt vùng có lượng mưa trung bình 1500mm, vùng khác phải bù thêm nước việc tưới tiêu với lượng nước tương đương Trồng trọt: Đất phải cày xới 6-8 lần để đất tơi xốp hình thành mùn Sau đó, đất đánh luống để đảm bảo việc tưới tiêu thoát nước tốt Thời gian gieo hạt từ tháng đến tháng Giống củ to, chắc, chiếm khoảng 15-20% lượng thu hoạch mùa vụ trước Trong thời gian trồng, cần làm cỏ bón phân đầy đủ Đồng thời, phải có biện pháp phòng chống bệnh thường gặp bệnh vết lá, đốm vi sinh vật bệnh sâu bệnh gây Thu hoạch: Nghệ vào khoảng tháng thu hoạch vào mùa thu Khi thu hoạch, rễ để riêng thân để riêng Để thuận tiện cho việc thu hoạch, người ta thường cắt bỏ phần nghệ bao gồm phần thân, hoa; sau cày hay cuốc cho đất vỡ cụm rễ nghệ kéo lên cách cẩn thận Nghệ sau thu hoạch ngâm nước để làm đất, rễ vảy; sau cất vào kho Muốn để nghệ lâu, người ta thường phải đồ hấp 6-12 giờ, sau để nước đem phơi nắng hay sấy khơ I.1.5 Thành phần hóa học củ nghệ Thành phần củ nghệ vàng gồm có: chất màu curcumin (curcuminoids), tinh dầu nghệ dễ bay hơi, chất xơ, chất khoáng, protein, chất béo, lượng ẩm, carbohydrate Thành phần củ nghệ vàng Turmeric Curcumin (Curcuminoids) 2–8% Tinh dầu (Volatile essential oil) 3–7% Chất xơ (Fiber) 2–7% Chất khóang (Mineral matter) 3–7% Protein 6–8% Chất béo (Fat) – 10 % Lượng ẩm (Moisture) – 13 % Carbohydrates 60-70 % Theo Ishita Chattopadhyay (2004), tinh dầu (5.8%) thu chưng cất lôi nước củ nghệ gồm có α-phellandren (1%), sabinene (0.6%), cineol (1%), borneol (0.5%), zingiberene (25%) sesquiterpines (53%) [2] I.2 Giới thiệu curcumin Curcuminoid hợp chất có tác dụng tạo nên màu vàng cho củ nghệ Cùng với tinh dầu, hợp chất curcuminoid tạo nên vị cay mùi hăng đặc trưng cho củ nghệ Ngồi curcuminoid cịn bảo vệ nghệ chống lại xâm nhập nấm vi sinh vật 7 Curcumin thành phần quan trọng linh động củ nghệ Nó có hoạt tính sinh học quan trọng hoạt tính kháng viêm; chống oxy hóa, dị ứng; liền vết thương; chống co thắt; kháng khuẩn, nấm khối u; … Ở Mỹ, curcumin dùng chất tạo màu phó mát, mustard, ngũ cốc, hoa dầm, bột khoai tây, súp, kem yogurts I.2.1 Cấu trúc hóa học đặc tính hóa lý curcumin Năm 1815, cấu trúc curcumin (C21H20O6) lần miêu tả Volger Pelletier Và năm 1913, cấu trúc hóa học curcumin Lampe xác định qua loạt phản ứng: • Khi đun curcumin với kiềm tạo thành vanilic acid ferulic acid • Curcumin nóng chảy với kiềm cho protocatechuic acid ((OH)2C6H3COOH) • Oxy hóa permanganat tạo thành vanilin • Tác dụng với hydroxylamin tạo dẫn xuất isoxozol • Hydro hóa dẫn xuất diacetyl curcumin cho hỗn hợp dẫn xuất hexahydro tetrahydro Từ phản ứng trên, cấu trúc curcumin xác định diferuloymethan Cấu trúc hóa học hợp chất curcumin nghệ (curcuminoids) Curcuminoid hợp chất phenol có củ nghệ Curcuminoid gồm chủ yếu ba hợp chất tạo màu cho củ nghệ, tồn củ nghệ với tỉ lệ khác dẫn xuất dicinnamoylmethane: 1) 1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione = diferuloylmethane = curcumin (CTHH: C21H20O6: C.A.S number: 458-37-7, M = 368) 2) 1-(4-Hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione = p-hydroxycinnamoylferuloylmethane = demethoxycurcumin (CTHH: C20H18O5: C.A.S number: 33171-16-3, M = 338) 3) 1,7-Bis-(4-hydroxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione = p,p-dihidroxydicinnamoylmethane = bisdemethoxycurcumin (CTHH: C19H16O4: C.A.S number: 33171-05-0, M = 308) Hình I.3: Cấu trúc hóa học curcuminoid 1) Curcumin: R1 = R2 = OCH3 2) Demethoxycurcumin: R1 = OCH3, R2 = H 3) Bisdemethoxycurcumin: R1 = R2 = H Hình I.4: Các hợp chất curcuminoid Trong ba hợp chất trên, curcumin thường chiếm tỉ lệ chủ yếu, sau demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin thường linh động 9 Bên cạnh ba thành phần chủ yếu, người ta tách ba thành phần phụ cho đồng phân hình học ba hợp chất Một ba thành phần phụ cho đồng phân hình học dạng cis-trans curcumin dựa phổ UV (curcumin có cấu hình trans-trans) Đồng phân có điểm nóng chảy thấp ổn định dung dịch ánh sáng so với curcumin Hình I.5: Đồng phân hình học dạng cis-trans curcumin Hình I.6: Dạng keto enol curcumin I.2.2 Tính chất vật lý • Curcumin trích từ củ nghệ có dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 184 – 185 °C • Curcumin không tan nước, tan cồn, aceton, metanol, dicloromethan, dicloetylen, benzen, acid acetic, … 10 • • • Trong mơi trường trung tính, dung dịch curcumin có màu vàng Mơi trường acid, dung dịch có màu vàng ánh lục (vàng chanh) Dung dịch có màu từ cam tới đỏ tím mơi trường kiềm Màu curcumin bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng có diện SO2 với nồng độ ≥ 10 ppm Dung dịch curcumin dung môi hữu có độ hấp thu cực đại bước sóng khoảng 420 – 430 nm I.2.3 Tính chất hóa học đặc trưng • Curcumin dễ dàng bị phân hủy tác dung ánh sáng môi trường pH thích hợp • Phản ứng cộng với Hydro • Phản ứng tạo phức với kim loại • Phản ứng nhóm OH vịng benzene • Phản ứng amin hóa II.Nhân giống nghệ (curcuma) phương pháp in vitro II.1.Sơ lược phương pháp vi nhân giống Nuôi cấy mô tế bào thực vật phạm trù khái niệm chung cho loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hồn tồn vi sinh vật, mơi trường dinh dưỡng nhân tạo, điều kiện vô trùng Nhân giống vơ tính trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) lĩnh vực ứng dụng có hiệu công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm: • Ni cấy trưởng thành • Ni cấy quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, nỗn chưa thụ tinh • Ni cấy phơi: phơi non phơi trưởng thành • Ni cấy mơ sẹo (callus) • Ni cấy tế bào đơn • Ni cấy protoplast: ni cấy phần bên trơng tế bào thực vật sâu tách vỏ gọi nuôi cấy tế bào trần Thuận lợi phương pháp vi nhân giống: Rút ngắn thời gian sản xuất Hệ số nhân giống cao Cây giống đồng Tiết kiệm không gian Không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên Chất lượng giống nâng cao Đa dạng sản phẩm Dễ vận chuyển Có thể sản xuất quanh năm 11 II.2.Phương pháp thực Nguyên liệu: Chồi non củ nghệ, cắt đoạn dài 1cm Môi trường nuôi cấy: môi trường MS Bổ sung 6µM BA, 0.3µM NAA, 3% sucrose, 0.8% agar Chỉnh pH đến 5.8 Môi trường khử trùng autoclave 121°C 20 phút Khử trùng mẫu cấy: Chồi non rửa vòi nước chảy, rửa với Tween-20 phút rửa lại vòi nước chảy phút Mẫu cấy sau nhúng ngập ethanol 70% 30-40 giây ngâm dung dịch chất tẩy rửa (0.1% HgCl2 có thêm 2-3 giọt Tween-20/100ml) Trong điều kiện vô trùng, dung dịch HgCl2 gạn mẫu cấy rửa 5-6 lần với nước cất vô trùng Mẫu sau khử trùng tách vỏ điều kiện vô trùng cắt nhỏ Sau cấy mẫu vào 25ml mơi trường Mẫu ni cấy mơi trường kích thích tạo chồi điều kiện 16 chiếu sáng tối, nhằm thu mẫu cấy vô trùng, bệnh.Sau tuần, thực cấy chuyền mẫu cấy giữ tuần để tạo chồi Các chồi cắt chuyển vào môi trường (thành phần tương tự môi trường ban đầu khơng có chất kích thích sinh trưởng) ni cấy tuần II.3.Các yếu tố ảnh hưởng Phương pháp khử trùng mẫu cấy: Phương pháp khử trùng làm đẩy mạnh việc tạo mẫu vô trùng trình tạo chồi Bằng việc kết hợp Tween-20 với 0.1% HgCl2 chất làm ẩm nhằm làm giảm sức căng bề mặt gia tăng bề mặt tiếp xúc Dưới điều kiện này, 70% mẫu vô trùng Và dường việc sử dụng Tween-20 giúp tăng % mẫu cấy vơ trùng giúp khử trùng bề mặt tốt Sucrose Ở nồng độ 9%, số lượng chồi cao (8.3 ± 0.32) Chồi lớn (0.88 ± 0.03) g thu tối, ánh sáng làm giảm nhẹ số lượng (8.3 ± 0.35) kích thước (0.82g ± 0.03) Ở nồng độ 7% giảm số lượng kích thước, khơng đáng kể mặt thống kê Tuy nhiên, nồng độ sucrose thấp (0 - 5%) cao (11%) có tác dụng hạn chế tạo chồi Kết phù hợp với báo cáo Shirgurkar (2001), Sunitibala (2001) Nayak (2000) [3] Số lượng chồi thu cao (5.6 ± 0.8 – 7.0 ± 1.1) 6% sucrose, 8% sucrose có giảm số lượng (5.6 ± 0.8 – 5.8 ± 1.1) lại tăng nhẹ kích thước [4] Ở nồng độ 3% sucrose, mẫu cấy phát sinh chồi dù tăng nồng độ BA từ 1-7 mg/l hay tăng thời gian chiếu sáng Chất kích thích sinh trưởng BA, Kn NAA BA, Kn NAA có ảnh hưởng đáng kể đến tạo chồi 12 Theo Islam (2004), 12 µM BA với 0.3 µM NAA có ảnh hưởng ứng tốt tạo chồi số lượng (8.1 ± 0.36) khối lượng (0.67 ± 0.03g) Và Kn hay kết hợp với NAA không cho kết hứa hẹn, tạo đến tối đa 4.5 ± 0.14 chồi với khối lượng chồi 0.39 ± 0.02 g Đồng thời, Islam cho thấy 0.3 µM NAA thích hợp để đạt số lượng chồi nhiều (8.7 ± 0.36) khối lượng lớn (0.82 ± 0.03) g [3] Shirgurkar (2001) khẳng định BA có tác dụng kìm hãm sinh chồi mẫu cấy củ nghệ Mặc dù nồng độ thấp 4.4 µM, BA khơng có nhiều ảnh hưởng, nồng độ cao 35.2 µM, hồn tồn kìm hãm sinh chồi [4] Tuy nhiên, Sunitibala (2001) báo cáo Kn (1mg/l) thích hợp cho tạo chồi nuôi cấy in vitro Curcuma longa L Môi trường MS Theo Islam (2004), môi trường MS nồng độ 0.75 thích hợp cho tạo chồi với số lượng (8.3 ± 0.55) khối lượng (0.81 ± 0.04) g Cả nửa nồng độ nồng độ MS toàn phần làm giảm số lượng (6.5 ± 0.53 7.1 ± 0.54) khối lượng (0.65 ± 0.04g 0.69 ± 0.04) g Nồng độ MS thấp cho số lượng khối lượng chồi nhỏ, toàn nồng độ MS cho số lượng chồi có khối lượng lớn [3] Theo Shirgurkar (2001), nửa nồng độ MS thích hợp cho tạo chồi nghệ, với sản lượng trung bình 5.8 ± 0.7 kích thước lớn 0.55 ± 0.06 g [4] Thidiazuron (TDZ) TDZ, hợp chất giống cytokinin không chứa purine, cho ảnh hưởng mạnh mẽ cyctokinin nhiều lồi thực vật TDZ kích thích hiệu phát triển chồi nách phát sinh chồi bất định (Huetteman Preece, 1993) Theo Prathanturarug (2003), việc cho ni cấy mẫu cấy với mơi trường có bổ sung TDZ với thời gian thích hợp kết hợp việc sau chuyển mẫu cấy qua mơi trường khơng có chất kích thích sinh trưởng giúp q trình tạo chồi có hiệu cao [5] TDZ nồng độ 18.17 µM cho số lượng chồi tạo thành lớn nhất: 13.25 ± 0.7 chồi/mẫu với mẫu cấy ban đầu nguyên vẹn 11.33 ± 0.86 chồi/mẫu với mẫu cấy ban đầu bị cắt (mẫu ban đầu sau cắt thành bốn mẫu trước đem cấy vào môi trường chứa TDZ) III.Thu nhận curcumin Để thu nhận hợp chất tự nhiên curcumin trực tiếp từ củ nghệ,người ta dùng phương pháp trích ly 13 III.1.Phương pháp chưng cất lôi nước Củ nghệ Xử lý Hơi nước Chưng cất lôi nước Tinh dầu Cặn rắn Nước nóng Lắng, gạn Cặn rắn Sấy Curcuminoid Sơ đồ trình thực Xử lý nguyên liệu củ nghệ Củ nghệ sau thu hoạch phơi khô ánh sáng mặt trời, đến độ ẩm đạt 69% Phương pháp phơi khơ chọn khơng có thay đổi nguyên liệu thô so với phương pháp sấy khơ lị Nghiền 1kg củ nghệ thành bột trộn lẫn với hạt thủy tinh, nhằm ngăn chặn kết khối đặc nguyên liệu thiết bị chưng cất Sau đó, cho tồn vào máy chưng cất Chưng lôi nước Thực chất trình chưng tinh dầu trước để loại tinh dầu, sau thu curcuminoid 14 Hơi nước sinh nồi hấp với áp suất kiểm sốt, cho vào thiết bị chưng cất có chứa bình chứa nguyên liệu bình ngưng Sau qua mẫu bột nghệ, ngưng lại nước lạnh nhiệt độ phòng, gom lại phễu tách với tinh dầu nước mang theo Hỗn hợp để lắng ngày; sau đó, tinh dầu cho vào bình thót cổ nút chặt nút cao su có quấn Teflon, bảo quản tủ lạnh Sau trích xong tinh dầu, van phía thiết bị chưng mở để thu chất màu (curcuminoid) chất rắn lơ lủng khác nước nóng (ống dẫn) Nước nóng sau gom lại để bảo quản lạnh tuần, cho chất rắn lơ lửng lắng xuống Sau tuần, nước gạn đi, phần cặn rắn sấy khơ lị 40°C Sau sấy khơ, phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) dùng để xác định lượng curcuminoid thu phần rắn khô Lượng curcuminoid tan nước gạn xác định phép ghi âm phổ (spectrophotometry) 425nm Các yếu tố ảnh hưởng đến trình phương pháp đảm bảo hoạt tính Q trình chưng sử dụng hai biến số: Thời gian chưng: 1-2 Áp suất nồi hấp: 1.0 × 105, 1.3 × 105 1.5 × 105 Pa Phân tích thống kê cho thấy thời gian áp suất nồi hấp khơng có ảnh hưởng đáng kể đến sản lượng tinh dầu thu Điều tương tự với tương tác thời gian chưng áp suất nồi hấp Vì gelatin hóa tinh bột diễn nhiệt độ 60°C nhiệt độ máy chưng cất theo áp suất nồi hấp theo thứ tự 101, 107 110°C, tinh bột có củ nghệ gelatin hóa, làm cho sản lượng tinh dầu thu giảm áp suất tăng Ngồi ra, cịn có mát chất dễ bay trình chưng cất nhiệt độ cao Đối với lượng chất màu, có khác khối lượng thu (theo áp suất trên, khối lượng chất màu thu 26.78, 0.39 1.29g), phần trăm curcuminoid thu ∼ 0.16% Điều xảy khả tan chất màu nước nóng Theo nghiên cứu Manzan (2003) điều kiện tối ưu để trích ly tinh dầu curcuminoid củ nghệ, sản lượng tinh dầu thu cao 0.46 % khối lượng sản lượng curcuminoid cao thu 0.16% khối lượng tương ứng với điều kiện chưng áp suất 1.0 × 105 Pa với thời gian chưng 15 III.2.Phương pháp dùng dung môi dễ bay Củ nghệ Xử lý Ether dầu hỏa Trích ly Tinh dầu Cặn rắn Ethanol Trích ly Bã rắn Dung dịch lỏng Curcuminoid Sơ đồ trình thực Xử lý củ nghệ Củ nghệ sau thu hoạch sấy khơ lị với khơng khí tuần hoàn nhiệt độ 50°C, đến đạt độ ẩm cuối 12% Củ nghệ khô nghiền bột Kích thước hạt bột định sàng rây Tyler Sau đó, tiến hành q trình phân hủy tinh bột enzym Bột nghệ sấy khô lần lò 50°C, độ ẩm đạt 10% Trích ly dung mơi dễ bay Thực chất q trình trích ly tinh dầu trước ether dầu hỏa nhằm loại tinh dầu, sau tiếp tục trích ly curcuminoid Q trình trích ly thực với máy lắc MA 830 Bình thót cổ, bít kín nút bần cao su, chứa 4g bột nghệ 50ml ether dầu hỏa, đem cân trước sau q trình trích ly nhằm xác định có mát dung mơi trích hay khơng Hỗn hợp chất rắn dung môi 16 khuấy trộn suốt q trình trích ly Sau đó, hỗn hợp lọc chân không Pha micelle (dung môi tinh dầu) chứa bình tối, đặt lị 40°C để làm bay dung mơi thu tinh dầu Lượng tinh dầu thu tính gram gram nghệ khô Để thu chất màu, lấy pha rắn thu sau trích tinh dầu cho vào bình thót cổ với 40ml ethanol Pha lỏng sau trích ly cho vào đĩa Petri để lò 40°C nhằm làm bay ethanol thu chất màu Lượng curcuminoid thu tính gram gram nghệ khô tách tinh dầu Các yếu tố ảnh hưởng phương pháp đảm bảo hoạt tính Q trình trích ly dung mơi chịu ảnh hưởng ba yếu tố: Kích thước hạt bột nghệ Nhiệt độ q trình trích ly tinh dầu (20-40°C) chất màu (30-60°C) Thời gian trích ly tinh dầu (1-6 giờ) chất màu (1-6 giờ) Đối với q trình trích ly tinh dầu ether dầu hỏa, kích thước, nhiệt độ thời gian có ảnh hưởng đáng kể đến sản lượng tinh dầu Tuy nhiên, tương tác kích thước, thời gian nhiệt độ khơng đáng kể Ngoài ra, sản lượng tinh dầu tăng nhiệt độ tăng (20-40°C) kích thước hạt bột giảm Cũng lưu ý hạt có kích thước nhỏ thời gian trích ly giảm Bên cạnh đó, giảm thời gian trích ly xuống cịn sản lượng tinh dầu giảm khoảng 25% Đối với q trình trích ly chất màu với ethanol, kích thước, nhiệt độ thời gian có ảnh hưởng đáng kể đến sản lượng chất màu Sản lượng chịu ảnh hưởng tương tác kích thước nhiệt độ, tương tác thời gian với hai yếu tố cịn lại khơng đáng kể Sản lượng chất màu tăng kích thước nhỏ lại, tăng nhiệt độ từ 30 đến 60°C làm tăng sản lượng khoảng 6.8% Ngồi ra, trích ly chất màu thực giờ, với kích thước hạt nhỏ hơn, 60°C, sản lượng thu giảm khoảng 7% Ngoài ra, phương pháp cho lượng curcumin thu cao ba loại curcuminoid, demethoxy curcumin bisdemethoxy curcumin Với phương pháp trích ly dung mơi dễ bay hơi, sản lượng tinh dầu đạt cao 5.49% khối lượng sản lượng curcuminoid cao 7.98% khối lượng ứng với điều kiện kích thước hạt 0.175, 0.124, 0.088 mm (kích thước số 80, 115, 170) nhiệt độ thời gian 40°C, (tinh dầu) 30°C, (chất màu) 17 III.3.Phương pháp dùng bình Soxhlet Hình II.1: Bình Soxhlet Phương pháp phương pháp dùng dung môi hữu để trích ly curcuminoid từ củ nghệ thiết bị Soxhlet Phương pháp thường dùng phịng thí nghiệm Củ nghệ cắt nhỏ hay nghiền thành bột, cho vào bình trích ly nằm bình thót cổ chứa dung mơi ethanol bình ngưng Dung mơi đun nóng ethanol bay di chuyển vào bình ngưng, ethanol ngưng tụ thành lỏng chảy nhỏ giọt vào bình trích ly có chứa nghệ ngun liệu Bình trích ly thiết kế cho dung môi quanh mẫu đạt đến mức định, dung môi chảy tràn nhỏ giọt trở lại vào bình thót cổ chứa dung mơi sơi Kết thúc q trình trích ly, bình thót cổ có chứa dịch trích ethanol đem bốc dung mơi ethanol Phần rắn cịn lại đem cân xác định phần trăm sản lượng curcuminoid thu III.4.Phương pháp dùng dung dịch chất lưỡng cực (aqueous hydrotrope solution) Dung dịch chất lưỡng cực Chất lưỡng cực (hydrotrope): hợp chất alkyl mạch ngắn tan nước, có tính amphipathic – có chứa phần tử háo nước (water-loving) phần tử kị nước (fat-loving) Các chất lưỡng cực sử dụng phương pháp: muối Na, K, Ca, Mg, ammonium alkyl benzene sulfonate, benzene sulfonate, toluen sulfonate, xylene sulfonate, ethyl benzene sulfonate, styrene sulfonate, …; alkyl polyglycol sulfate phosphate methyl cellosolve sulfate, ethyl cellosolve sulfate, … 18 Tính chọn lọc chất lưỡng cực curcuminoid tế bào cấu trúc phenolic chúng Mức độ xáo trộn lớp tế bào hóa bần củ nghệ phụ thuộc vào tính chất chất lưỡng cực; cumene sulfonate làm phá hủy hồn tồn lớp tế bào hóa bần, butyl mono glycol sulfate (BMGS) phá hủy làm xoắn nhiểu hơn, với Natri salicylate hay para-toluen sulfonate acid (PTSA) hay Natri saccharine ảnh hưởng khơng bật Khả xâm nhập hiệu phụ thuộc vào chất chất lưỡng cực; cumene sulfonate thâm nhập tế bào nghệ với phạm vi lớn nhất, sau BMGS, Natri salicylate, PTSA Natri saccharine Cumene sulfonate thâm nhập tốt lại tính chọn lọc, BMGS cho thấy khả xâm nhập cao tính chọn lọc với curcumin cao Điều giải thích khác hiệu trích ly chất lưỡng cực khác nhau; BMGS cho lượng curcuminoid tái thu hồi cao với độ tinh khiết cao nhất, Natri salicylate cumene sulfonate PTSA Natri saccharine cho mức thâm nhập tính chọn lọc vừa phải, cho lượng sản phẩm thấp Tác dụng dung dịch chất lưỡng cực Cấu tạo củ nghệ gồm: - Lớp lớp biểu bì (epidermis), cấu tạo từ tế bào thn hình chữ nhật; - Tiếp theo lớp tế bào (hypodermis), gồm hai hay ba lớp tế bào nhu mô không nhau; - Lớp thứ ba gồm khoảng sáu lớp tế bào hóa bần (cork cells) xếp thành hàng xuyên tâm Lớp tế bào che chở lớp vỏ (cortex) thành phần bên trong; - Lớp cortex gồm tế bào nhu mô vách mỏng chứa tinh bột, tế bào nhựa chứa curcuminoid bó mạch; - Tiếp theo cortex lớp vỏ (endodermis), gồm tế bào thuôn chữ nhật chứa giọt dầu; - Trụ bì (pericycle), sau vỏ trong, cấu tạo từ lớp tế bào thuôn chữ nhật; - Phần cùng, hay trụ trung tâm, gồm bó mạch nối tiếp trụ bì, tế bào nhu mơ chứa tinh bột, tế bào nhựa bó mạch nằm rải rác vùng mô trung tâm Như vậy, curcuminoid diện tế bào nhựa có mặt lớp cortex trụ trung tâm Trong phương pháp này, trình nghiền củ nghệ làm xáo lộn lớp biểu bì, lớp biểu bì lớp tế bào hóa bần, giúp lớp tế bào nhựa chứa curcuminoid lộ trực tiếp dung dịch chất lưỡng cực Ngồi ra, màng tế bào lớp đơi phospholipid, chất lưỡng cực phá hủy lớp đôi thâm nhập vào nội bào, làm curcuminoid có khả tan nhanh dung dịch chất lưỡng cực Lớp tế bào hóa bần cấu tạo gồm lớp cellulose ngồi, lớp chất khơ lớp cellulose Chính lớp chất khơ làm tế bào bần hồn tồn khơng có khả thấm nước Dung dịch chất lưỡng cực phá thủng lớp chất khô sau tới tế bào bần Lớp tế bào bần bị xáo trộn, bị xoắn lại chất lưỡng cực xâm nhập vào phần bên củ 19 nghệ Khi đó, chất lưỡng cực khơng làm tế bào căng lên, mà cịn giải phóng tế bào khỏi cấu trúc kết nối nó, giúp việc trích curcuminoid vùng trụ trung tâm dễ dàng Hình II.2: Các lớp tế bào củ nghệ Hình II.3: Sự phá vỡ cấu trúc lớp tế bào củ nghệ sau bị chất lưỡng cực thâm nhập Các chất lưỡng cực khác dùng để trích ly Chất lưỡng cực (muối Natri) Curcuminoid % Trích ly % Độ tinh khiết 51.5 97.0 Cumene sulfonate (Na-CS) 38.56 90.7 Salicylate (Na-S) 50.79 89.2 p-Toluen sulfonate acid (Na-PTSA) 13.79 79.3 Butyl mono glycol sulfate (Na-BMGS) 20 Củ nghệ Xử lý Dung dịch chất lưỡng cực Trích ly Gạn, lọc hay li tâm Rắn Rửa Dịch lỏng Nước Kết tinh Gạn, lọc hay li tâm Rắn Sấy Curcuminoid Sơ đồ trình thực Nước rửa Nước 21 Xử lý củ nghệ Rễ củ nghệ nghiền thành dạng bột, cho tiếp xúc trực tiếp với dung dịch chất lưỡng cực với dung môi nước, tạo hỗn hợp dạng sệt thùng có hệ thống khuấy Trích ly dung dịch chất lượng cực Sau thành phần trộn với nhau, hỗn hợp dạng sệt khuấy, lắc mạnh khoảng thời gian đủ để q trình trích curcuminoid diễn Khoảng thời gian khuấy trộn phụ thuộc vào nồng độ chất lưỡng cực tốc độ khuấy Quá trình khuấy trộn nhiệt độ cụ thể khoảng 0°C - 100°C, áp suất khí Sau khuấy trộn, phần cặn lắng rắn tách riêng khỏi dung dịch cách gạn, lọc hay li tâm Phần cặn rửa với nước phần nước rửa kết hợp với dung dịch sau lọc tiếp tục tái thu hồi curcuminoid Dung dịch sau lọc pha loãng với nước, nhằm đưa nồng độ chất lưỡng cực đến đủ thấp để kết tủa curcuminoid từ dung dịch Q trình pha lỗng thực khoảng nhiệt độ 80°C Curcuminoid kết tủa tách khỏi dung dịch cách gạn, lọc hay li tâm Sau curcuminoid rửa với nước sấy khơ Cịn dung dịch chất lưỡng cực thu hồi bước cô đặc tái chế để tiếp tục sử dụng Ở biến thể phương pháp này, sau lọc thu hỗn hợp lỏng dung dịch chất lưỡng cực curcuminoid, tiếp tục tiến hành việc pha lỗng với nước khơng Sau đó, curcuminoid tái thu hồi việc trích ly tiếp tục với dung môi hữu Các dung môi hữu thuộc nhóm hydrocarbon thơm béo benzene, alkylated benzene, heptane, hexane, octane, cyclohexane, halogenated hydrocarbon, ketone, methyl isobutyl ketone; ester ethylacetate, propylacetate; ether diethyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether; cồn butanol, hexanol; amide phosphoamide, trioctyl phosphene; hay hỗn hợp chất Các yếu tố ảnh hưởng • Nồng độ chất lưỡng cực: khoảng 0.1 mol/l đến 5.0 mol/l • Kích thước hạt bột nghệ: tốt kích thước từ số đến 300 • Nhiệt độ thực trình trộn bột nghệ với dung dịch chất lưỡng cực: khoảng 0100°C, tốt nhiệt độ phịng 30°C • Thời gian trộn trích ly curcuminoid: 15 phút đến 24 giờ, tùy vào nồng độ chất lưõng cực tốc độ khuấy trộn • Nhiệt độ thực pha loãng thu hồi curcuminoid: khoảng 0-80°C, tốt 2030°C III Ứng dụng curcumin III.1 Hoạt tính chống oxy hóa Trong q trình hít thở, oxy oxy hóa thành phần tế bào phân tử sinh học Q trình oxi hố diễn mạnh bị tác động yếu tố bên lượng hay yếu tố bên bệnh tật, tạo sản phẩm oxy hóa gốc tự Các gốc tự có khả phản ứng cao với hợp chất sinh học gây tổn thương mơ Q trình lão hóa minh họa cho tích lũy tế bào, mơ, quan bị thối hóa gây gốc tự Trong thể người tồn quan sản sinh chế chống lại tác 22 động gốc tự Theo q trình lão hóa hay bệnh tật, quan bị yếu dần Một số vitamin, khoáng chất hợp chất tự nhiên phenol, flavonoid, carotenoid có khả chuyển hóa gốc tự cách quét hay trung hòa gốc tự Curcuminoid hợp chất tự nhiên có khả chống oxy hóa Cà dịch trích lẫn curcumin có khả ngăn cản tạo gốc tự superoxide, hydroxyl Tính chống oxy hóa curcumin ngăn cản peroxide hóa lipid thể Phản ứng peroxide hóa lipid phản ứng gốc tự dây chuyền, gồm bước sau: Nguyên tử H bị tách khỏi acid béo chưa bão hòa (-CH) nhờ gốc tự do: -CH + R° → -C° + RH -C + O2 → -C-O-O Phản ứng dây chuyền: gốc tự peroxyl vừa hình thành cơng acid béo kế cận: -C-O-O + -CH → -C-O-O-H + -C Q trình tiếp diễn dẫn đến tích lũy peroxide béo màng tế bào, làm màng tế bào không ổn định cho phép xâm nhập ion có hại Gốc tự peroxyl công ion protein màng tế bào Một chất chống oxy hóa kết thúc chuỗi phản ứng dây chuyền cách kết hợp dập tắt gốc tự hay làm giảm tạo gốc tự từ đầu Phân tích cấu trúc curcumin nhóm OH vịng benzen giữ vai trị quan trọng cho khả chống oxi hóa curcumin Cơ chế chống oxy hóa curcumin gồm hay nhiều bước sau: Dập tắt hay trung hòa gốc tự Tương tác với tác nhân oxy hóa ngăn cản chúng phát triển Kết hợp với oxi làm giảm khả phản ứng oxi hóa Ngăn cản enzym oxy hóa cyctochromer P_450 Tạo phức hay phá hủy tính oxy hóa ion kim loại Fe Curcumin ngăn ngừa bệnh tim mạch gây co hẹp thành động mạch Sự co hẹp lắng đọng mảng cholesterol bị oxi hóa cao tương ứng với mức độ peroxode cao Với người khỏe mạnh, dùng 500mg curcumin ngày, vòng ngày lượng peroxide béo máu giảm 33%, tương ứng lượng cholesterol máu giảm 29% Một ứng dụng khác khả chống oxy hóa curcumin: dùng curcumin làm chất phụ gia thực phẩm, giúp thực phẩm không bị ôi thiu oxy hóa dầu mỡ suốt q trình lưu trữ bảo quản III.2 Hoạt tính kháng viêm Viêm nhiễm chuỗi phản ứng thể nhằm chống lại tổn thương mô Phản ứng cần thiết cho trình lành vết thương, đồng thời củng tạo đau đớn kết hợp với đỏ phồng vết thương Trong trình viêm nhiễm, thể sinh chất giống hormon arachidonic acid Arachidonic acid tác dụng enzym cyclooxygenase se chuyển hóa thành prostaglandin (PG) thromboxan (TX), thành hydroxyeicosatetraenoid acid (HETE) leukotrien (LT) Một số PG làm giãn mạch máu, LT làm tăng khả thấm qua mạch 23 làm trương phồng mô, dẫn đến trình viêm Lượng PG tăng lên gây mẫn đỏ, trương phồng, đau nhức vết thương; cón TX, LT ngăn cản trình cung cấp máu lượng cho tế bào Nghiên cứu cấu trúc hóa học curcumin kết hợp với hoạt tính sinh học cho thấy diện liên kết đôi C3,4 C3’,4’ nhóm OH C8,8’ vịng benzene tạo hoạt tính kháng viêm cho curcumin Chất kháng viêm có khả ngăn cản enzym cyclooxygenase lipoxygenase – nhóm enzym kết hợp với phản ứng chuyển hóa arachidonic acid thể Sự ngăn cản hoạt động enzym làm giảm sản phẩm gây viêm từ chuyển hóa arachidonic acid III.3 Hoạt tính chống đơng máu Sự kết tụ tiểu huyết cầu máu gây tượng đông máu Curcumin có khả ngăn cản hoạt động enzym cyclooxygenase tạo thêm tiểu huyết cầu, nên curcumin có tác dụng chống đông máu III.4 Ngăn cản điều trị ung thư • Curcumin ngăn các tế bào ung thư vào pha S (pha tổng hợp chu kỳ tế bào • Curcumin thúc đẩy tế bào ung thư vào chết tế bào theo chương trình • Curcumin chất ức chế tạo mạch máu mạnh • Curcumin làm hạ cholesterol huyết chống bệnh Alzheimer (mất trí nhớ người già Curcumin có nghệ vàng có tác dụng hủy diệt tế bào ung thư theo chế bước, ức chế hoạt hóa tín hiệu NF-Kappa B Ngồi ra, Curcumin cịn có tác dụng loại bỏ, săn lùng men, gốc tự gây ung thư, giúp thể vừa phòng ngừa chống ung thư tích cực III.5 Tính kháng virus, vi khuẩn, nấm kí sinh trùng Curcumin dùng điều trị HIV nhờ khả chống lại virus Dịch trích cồn nghệ cịn có tác dụng kháng khuẩn Curcumin với nồng độ 2.5 – 50 mg/100ml ngăn cản phát triển Staphylococcus aureus Natri curcuminat kháng khuẩn Micrococcus pyogen với hàm lượng 1ppm Dịch trích cloroform eter nghệ có khả kháng nấm gây viêm da Dịch trích cồn nghệ cịn ngăn cản sản xuất aflatoxin từ nấm Aspergillus parasiticus kháng amip Entamoeba histolynca Hỗn hợp curcumin, demethoxycurcumin bisdemethoxycurcumin cịn cho thấy tính kháng giun 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] Peter, K.V., Handbook of Herbs and Spices, Woodhead Publishing, 2001, p 300 Ishita Chattopadhyay, Kaushik Biswas, Uday Bandyopadhyay Ranajit K Banerjee, Turmeric and curcumin: Biological actions and medicinal applications, Current Science 87, 1, 44 - 53, 2004 [3] M A Islam, K Kloppstech and H -J Jacobsen, Efficient Procedure for In vitro Microrhizome Induction in Curcuma longa L (Zingiberaceae) – A Medicinal Plant of Tropical Asia, Plant Tissue Cult 14(2), 2004, p 123-134 [4] Mrudul V Shirgurkar, C K John & Rajani S Nadgauda, Factors affecting in vitro microrhizome production in turmeric, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 64, 2001, p 5–11 [5] S Prathanturarug, N Soonthornchareonnon, W Chuakul, Y Phaidee, P Saralamp, Highfrequency shoot multiplication in Curcuma longa L using thidiazuron, Plant Cell Rep 21, 2003, p 1054–1059 http://vi.wikipedia.org/wiki/Curcumin www.curcumin.net/ www.phytochemicals.info/ /curcumin.php http://tailieu.vn/tag/tai-lieu/curcumin.html ftp://ftp.fao.org/es/esn/jecfa/cta/CTA_61_Curcumin.pd http://www.ebook.edu.vn/?page=1.18&view=17721  ... cấy vào môi trường chứa TDZ) III .Thu nhận curcumin Để thu nhận hợp chất tự nhiên curcumin trực tiếp từ củ nghệ, người ta dùng phương pháp trích ly 13 III.1 .Phương pháp chưng cất lôi nước Củ nghệ. .. học củ nghệ Thành phần củ nghệ vàng gồm có: chất màu curcumin (curcuminoids), tinh dầu nghệ dễ bay hơi, chất xơ, chất khoáng, protein, chất béo, lượng ẩm, carbohydrate Thành phần củ nghệ vàng... hỗn hợp dẫn xuất hexahydro tetrahydro Từ phản ứng trên, cấu trúc curcumin xác định diferuloymethan Cấu trúc hóa học hợp chất curcumin nghệ (curcuminoids) Curcuminoid hợp chất phenol có củ nghệ Curcuminoid