Nghiên cứu đặc điểm và ứng dụng của hệ Enzym Pectinase

Nghiên cứu đặc điểm và ứng dụng của hệ Enzym Pectinase

LỜI GIỚI THIỆU PHẦN I ĐẶC ĐIỂM CỦA HỆ ENZYM PECTINASE I.Cơ chất pectin :[ I ] Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid galacturonic qua các liên kết α–-1,4 glucoside. Tùy thuộc nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử 800000-200000. Pectin hoà tan trong nước, ammoniac, dung dòch kiềm, carbonate natri và trong glycerine nóng. Độ hoà tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hoá trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm. Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khác nhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu. Các pectin tự nhiên đònh vò trong thành phần của tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polyssacharide và protein để tạo thành các protopectim không tan. Có thể phân hủy để làm pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid. Vì thế, các pectin tan thu nhận được là kết quả của sự phân hủy phân tử pectin không tan và chúng không đồng dạng với nhau. Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: pectin hoà tan, pectin acid và protopectin. Pectin hoà tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hoá bằng methanol. Pectin được ester hoá cao sẽ tạo gel đặc trong dung dòch acid và trong dung dòch đường có nồng độ 65%. Enzyme pectinase tác động lên các hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không đồng dạng. Cấu trúc hoá học cơ bản của pectin là α–– D-galacturonan hay α––D-galacturonoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vò D-galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu α -1,4). Mặt khác, mức độ oxy hoá trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất đònh các nhóm carboxyl bò ester hoá bởi các nhóm methoxyl. Trong một số trường hợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường, có sự ester hoá giữa các nhóm carboxyl và các nhóm acetyl. Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hoá bằng methanol. Pectinase là muối của pectinic acid. Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi một đơn vò galacturonic acid. Pectate là muối của pectic acid. Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoá học phức tạp. Trong pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+ , Mg2+ , các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bò thủy phân bằng acid thì giải phóng pectin hoà tan. II. Pectinase:[I] Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Việc kiểm soát các enzyme này trong cà chua chuyển gen là một ví dụ điển hình trong việc ứng dụng RNA đối mã để thao tác sự biểu hiện gen. Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả. Việc kiểm soát hoạt động của enzyme pectinase cũng có thể kiểm soát được độ nhớt của sản phẩm. Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng. • Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vò galaturonate nằm kề đơn vò không bò ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trò pH tối ưu khác nhau. Nếu thu từ nguồn VSV thì PH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5. Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-40oC và bò vô hoạt ở 55-62oC. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Møg2+. • Polygalacturonase còn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết α–1,4-glycosid. Các exo-PG (exo-poly 1,4-α-D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG (endo-poly1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và vi khuẩn. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất, enzym polygalacturonase được chia làm bốn loại:  Polymethylgalacturonase hay còn gọi là α-1,4-galacturonite-methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalactorunic acid đã được methoxyl hoá (tức là pectin). Enzyme này lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân tử pectin, đó là endo-glucosidáe-polymethyl galacturonase kiểu I và exo-glucosidase-polymethylgalaturonase kiểu III.  Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic, cũng được chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu IV. Enzyme endo-glucosidase-Polymethyl-galacturonase kiểu I là enzyme polymethylgalacturonase dòch hoá pectin có mức độ methyl hoá càng cao thì bò thủy phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả. Trong dung dòch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này thường bò giảm. Enzyme này rất phổ biến trong các VSV, đặc biệt là nấm mốc A. niger, A, awamori. • Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vò galacturonate không bò ester hoá. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4-α-D-galacturonide) lyase) và endo-PEL (endo-poly(1,4-α-D-galacturonic) lyase) đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động. Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm. Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật. Ngoài ra còn có: • Pectin-transeliminase hay còn được gọi là poly α–-1,4-galaturonite –methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid. • Polygalactorunate-transeliminase còn được gọi là poly α -1,4D-galaturonite –glucanoliase, là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid. • Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vò galacturonate đã bò ester hoá. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme III. Đặc điểm của các pectinase từ các nguồn khác nhau:[ I ] 1. Pectinesterase: Bên cạnh pectineaterase (PE) VSV, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enyme PE. Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme. a.Đặc điểm của pectineaterase thực vật: Cà chua chứa ít nhất hai loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín. Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái chín. PE2 có khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6. Enzyme này bò bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67oC. Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M, theo thứ tự. PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu tại pH gần 8. Polygalacturonic acid, sản phẩm hình thành do quá trình để methyl hoá, là một chất ức chế cạnh tranh. Trong thòt quả chuối có hai isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lượng phân tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3. Các enzyme này hoạt động ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dòch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dòch về 6,0. Các enzyme này bò ức chế bởi nhiều loại polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose, maltose và galactose. PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lượng phân tử 36,kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và $11,0, theo thứ tự. pH tối ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0. Thòt quả cũng chứa hai isoenzymem, một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi bò tác động của protease. Độ ổn đònh của enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân tử enzyme. Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lượng là 51kD và 36kD, theo thứ tự. Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3. Tuy nhiên, chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt. b.Đặc điểm của pectineaterase vi sinh vật:Một điểm đáng lưu ý là tất cả enzyme VSV đều không phải là protein kiềm. PE của Trichoderma reerei có điểm đẳng điện nằm trong khoảng 8,3-9,5 và pH tối ưu là 7,6. Tuy nhiên, PE của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong khoảng acid. Hoạt động của enzyme PE sinh ra bởi A. niger đạt tối đa ở pH 4,5 ở 40oC. Các PE acid và kiềm có thể đề methyl hoá cơ chất pectin theo cùng một kiểu. PE kiềm làm hình thành các pectin được đề ester hoá và pectin này có thể tạo gel yếu với ion calcium; PE acid tạo ra pectin bò đề ester hoá có khả năng tạo gel mạnh với ion calcium. c.Trình tự amino acid: Cấu trúc bậc một của PE cà chua chứa 305 amino acid với khối lượng phân tử 33 239. Enzyme này có chứa hai cầu nối disulfide (Cys98-Cys125 và Cys166-Cys200). Cys 166 có mặt trong tất cả các enzyme pectinesterase. Trình tự amino acid suy luận trên cơ sở các nucleotide cDNA cho thấy sự không nhất quán, 18 trong 27 vò trí khác nhau, có thể làm thay đổi điện tích của protein. Mặt khác, chỉ có khoảng 94% trình tự amino acid trong một phần chuỗi amino acid có tính đồng dạng với toàn bộ trình tự của cDNA. Sự không nhất quán này có thể phản ánh sự tồn tại của các isoenzyme, mặc dù chỉ có hai isoenzyme trong cà chua được biết đến. Một số gen mã hoá cho các enzyme PE đã được tách dòng và nghiên cứu đặc điểm. Gen tách dòng từ Pseudomonas mã hoá cho PE có chứa 396 amino acid với khối lượng phân tử là 41 004. d.Cơ chế để methyl hoá: PE loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử pectin bằng tương tác ái nhân của enzyme lên ester, làm hình thành hợp chất trung gian acyl-enzyme và phóng thích methanol. Tiếp theo sau là phản ứng deayl hoá, là phản ứng thủy phân của hợp chất trung gian acyl-enzyme, để giải phóng enzyme và carboxylic acid(H.6.7). E-N Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình thành các khối pectin chứa các nhóm carboxylate dọc theo mạch pectin. Enzyme của Trichoderma reesei là một protein cơ bản cho kiểu phản ứng tương tự. Enzyme của các loài Asperillus với pH tối đa trong vùng acid, xúc tác phản ứng từ bên trong. nh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme pectinesterase có thể có liên quan đến tương tác của nó với cơ chất. Polygalacturonic acid là một chất ức chế cạnh tranh trong phản ứng thủy phân nhờ sự xúc tác của PE. Pectin chứa các nhóm cacboxylate được sắp xếp như hình khối có thể tác dụng theo cách tương tự. Sự liên kết của các ion kim loại vào các nhóm carboxylate trong trường hợp này có khuynh hướng trung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme. Tuy nhiên. Lượng dư các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kim loại bò vây quanh bởi các nhóm carboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cần thiết cho phản ứng thủy phân xảy ra. 2. Polygalacturonase Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV. PG thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Phizopus arrchizus, và Fusarium osyporum. Tuy nhiên, trong thực tế, PG của thực vật bậc cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín. a.Các enzyme trong cà chua chín: Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là endo-enzyme. PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bò bất hoạt ở nhiệt độ 78oC. PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bò bất hoạt ở 57oC. PG1 có độ ổn đònh tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn đònh tối đa ở pH 5,6. Sự phân tích sử dụng SDS-PAGE cho rằng PG1 là một dimer của PG2, tuy nhiên các nghiên cứu khác lại cho rằng PG1 hình thành là do sự kết hợp của PG2 với một $–subunit. Các chuỗi polypeptide của PG đều bò glycosyl hoá. PG2 chứa 4,6 đường trung tính (D-mannose, L-gucose, D-xylose) liên kết với nhau thông qua cầu nối N-acetylglucosaminylasparaginyl. Có sự khác nhau chút ít về khối lượng phân tử, chẳng hạn các isoenzyme của PG2, PG2A va PG2B có khối lượng phân tử tương ứng là 43 và 46kD. Sự khác nhau này có thể là do quá trình sửa sai hoặc quá trình glycosyl hoá sau dòch mã. Trong thực tế, các nghiên cứu sau đó cũng đã chứng minh được rằng PG2A và PG2B là các dạng glycosyl hoá khác nhau của cùng các polypeptide. b. Trình tự amino acid: Các trình tự amino acid được suy luận trên cơ sở các nucleotic của cDNA phân lập không những từ trái cà chua mà còn từ phấn của các loài Pseudomonas solanacearum, Oenothera organesis, phấn hoa bắp, và từ trái bơ. Gen của PG2 phân lập từ trái cà chua mã hoá cho protein hoàn chỉnh có 373 amino acid, với khối lượng phân tử là 40 279. Enzyme này được tổng hợp từ một tiền chất, sau đó đi qua quá trình sửa chửa sau dòch mã, gồm cả các quá trình loại bỏ các peptide tín hiệu, bò glycosyl hoá tại bốn điểm có khả năng glycosyl, và sửa chữa ở đầu C cuối. Các gen PG đơn mã hoá cho các loại isoenzyme khác nhau, dẫn đến kết luận rằng PG1 và PG2 đều xuất phát từ cùng một chuỗi polypeptide, và rằng PG1 được tạo thành nhờ sự kết hợp của PG2 với β-subunit. β-subunit. Sự chuyển đổi PG2 và PG1 trong quá trình chín của cà chua là một vấn đề gây được nhiều chú ý. β-subunit, một yếu tố bền nhiệt, đầu tiên được phân lập từ cà chua xanh, có khả năng chuyển đổi PG2 thành PG1 trong ống nghiệm. Yếu tố này sau đó được xác minh là một glycoprotein rất đặc trưng với polypeptide PG về mặt miễn dòch. Phân tử PG1 được tạo thành từ một phân tử PG2 và một phân tử β-subunit; tuy nhiên, chỉ có polypeptide PG có hoạt tính enzyme. cDNA mã hoá cho –subunit có trong cà chua là một tiền chất có kích thước phân tử lớn (69kD, 630 amino acid). Trong phân tử này, thêm vào phân tử protein hoàn chỉnh là một trình tự tín hiệu kò nước (30 amino acid), một polypeptide chứa đầu cuối N-(78 amino acid), và một tiền peptide chứa đầu cuối C-(233 amino acid). Protein hoàn chỉnh chứa glycosyl hoá là chứa 289 amino acid nặng 31,5 kD, điểm đẳng điện 4,9. Protein này chứa lượng lớn amino acid gly, tyr, phe, và một motif lặp có cấu trúc liên ứng FTNYGxxGNGGxxx, trong đó “x” phần lớn là các amino acid phân cực. Chức năng của motif này trong protein vẫn chưa được biết rõ. c.Vai trò của PG trong quá trình làm chín trái cây. Hoạt độ của enzyme trong giai đoạn đầu của quá trình làm chín chủ yếu là nhờ PG1. PG1 tiếp tục tăng trong quá trình chín, và có mặt trong tất cả các giai đoạn của quá trình chín. PG2 có khối lượng phân tử thấp hơn và ít bền nhiệt, PG2 xuất hiện trong giai đoạn cuối của quá trình, và chiếm lượng lớn trong giai đoạn chín. Sự xuất hiện kế tiếp nhau của hai enzyme này là kết quả của hoạt động điều hoà của –subunit, yếu tố này được tìm thấy với lượng ít trong cà chua xanh, sau đó tăng lên trong giai đoạn chín. PG2 được coi như một endo-enzyme trong cà chua chín, PG1 được hình thành trong suốt quá trình chín khi β–subunit được sinh ra để phản ứng với PG2. Bằng cách điều chỉnh những thay đổi trong các phân tử PG trong các dòch chiết khác nhau có các nồng độ khác nhau của NaCl và pH đệm khác nhau. Trên thực tế gen mã hoá cho polypeptide PG trong một số nghiên cứu trước đây đã chứng minh điều này. Gần đây, các nghiên cứu về các kiểu biểu hiện gen của β–subunit và các phân tử PG cho thấy mRNA của β–subunit xuất hiện sớm trong quá trình phát triển của trái cây(10 ngày sau khi thụ phấn) và tăng đến mức tối đa trong 30 ngày, cũng là lúc trái cây chín. Sau đó, lượng mRNA của β-subunit giảm nhanh chóng, trong khi lượng mRNA của PG tăng một cách đáng kể. Vì tất cả các kết quả nghiên cứu đạt được ở trên, ta có thể cho rằng endo-enzyme PG2 được hình thành trong các giai đoạn sớm của quá trình chín phải được chuyển về PG1 do sự có mặt của β–subunit. Sự tích lũy của PG2 trong các giai đoạn sau của quá trình chín là do β–subunit bò cạn kiệt. Vai trò của quá trình chuyển đổi này là nhằm điều hoà hoạt động của PG trong các giai đoạn của quá trình chín. β–subunit phản ứng và neo phân tử PG2 vào thành tế bào, tạo ra phân tử PG1 dưới dạng hoạt động để phân hủy pectin. Một số nghiên cứu khác cũng chứng minh được rằng PG1, chứ không phải PG2 có chức năng trong việc làm phân huỷ và ổn đònh polyuronide, có nghóa là sự phân hủy của polyuronide dưới tác động của enzyme PG là nguyên nhân dẫn đến quá trình mềm của cà chua.Tuy nhiên, khi nghiên cứu về sự xen đoạn và biểu hiện của gen PG trong cà chua chuyển gen thì kết quả cho thấy polyuronide bò phân hủy nhưng không làm cho trái cà chua mềm đi. d.Cơ chế và kiểu tác dụng: Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ra galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế(H.6.8). Sự thủy phân polymer này bò gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất. Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với các exo-PG ở cà rốt và đào. Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dòch cơ chất. Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chín không gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có liên quan. Các endo-PG phân hủy pectic acid từ bên trong mạch, làm giảm nhanh độ nhớt của dung dòch cơ chất. Tính đặc hiệu và kiểu tác dụng của endo-enzyme được xác đònh bởi trạng thái của điểm hoạt động. Mức độ thủy phân của endo-PG ở nấm men giảm cùng với sự giảm độ dài mạch cơ chất. Vò trí liên kết của endo-PG ở Aspergillus niger được cấu thành từ 4 điểm và sự phân cắt xảy ra giữa các điểm 1 và 2(H.6.9). Một cơ chất tetramer chòu sự phân cắt(3+1) thành trigalacturonic acid galacturonic. Một cơ chất pentamer cho ra hai sản phẩm phức tạp hơn, cả hai đều đáp ứng sự chiếm giữ hoàn toàn của 4 điểm liên kết, tạo sự phân cắt (4+1) và (3+2). Cũng tương tự, đối với cơ chất là hexagalacturonic acid, sản phẩm sẽ tạo thành lối phân cắt (5+1), (4+2) và (3+3). Trigalacturonic acid bám vào điểm hoạt động để tạo thành các phức hợp hữu ích hoặc không hữu ích. Liên kết hữu ích trong trường hợp này làm sinh ra sự phân cắt (2+1). Liên kết không hữu ích được tạo thành khi ba đơn vò đơn lẽ bám vào ba điểm 2, 3 và 4 là không hề tương tác với các nhóm xúc tác đònh vò bên trong điểm 1 và 2. Cơ chất trong trường hợp này đóng vai trò là một chất ức chế cạnh tranh (K = 0,67mM). 3.Pectate lyase: Pectate lyase (PEL) là các enzyme VSV ngoại bào. Các enzyme của giống Erwina và Bacillus được biết đến là tác nhân gây ra triệu chứng soft-rod ở thực vật. Tuy nhiên, chúng cũng được tìm thấy phổ biến ở Aeromonas, Pseudomonas, Xanthomonas, Aspergillus và Fusarium. Erwinia chrysanthemi sinh ra các enzyme pectate lyase ở dạng isoenzyme có thể được phân thành các nhóm trên cơ sở điểm đẳng điện của chúng: acid (pH 4-5), trung hoà (pH 7-8,5) và kiềm (pH 9-10). Số lượng các isoenzyme trong mỗi nhóm có thể thay đổi tùy theo loài. Đa số các loài được nghiên cứu cho năm hay ít nhất bốn isoenzyme: một acid (PELA), hai trung hoà (PELA và C), hai kiềm (PELD và E). Tất cả các isoenzyme này đều cần Ca++ để làm tăng độ hoạt động và có pH tối ưu 8-10. Các nghiên cứu trên chủng EC16 cho thấy rằng tất cả 4 isoenzyme trên đều là endo-enzyme (PELA(pI 4,2), PELA (pI 8,8), PELC (pI 9,0), và PELD (pI 10,0)). Các PEL kiềm rất đặc hiệu trong việc gây ra sự giầm nước của các mô thực vật, tiếp theo là các isoenzyme trung hoà, trái lại các PEL acid không gây ảnh hưởng gì. ƠÛ các chủng Erwinia carotovara, có ít nhất ba PEL được tiết ra, tất cả đều có điểm đẳng điện ở pH kiềm: PELI (pI 9,7), PELII (pI 10,2), và PELIII (pI 10,35). Cả ba isoenzyme này đều có pH tối ưu là 9,0. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PELII và PELIII là 50 và 60oC, theo thứ tự. PELI có độ bền nhiệt thấp. ƠÛ chủng GIR726, có bốn loại endo-PEL isoenzyme với các điểm đẳng điện ở các pH rất kiềm (10,0, 10,6, 10,3 và 10,9) và khối lượng phân tử nằm trong khoảng từ 28-33 kD. pH tối ưu cho hoạt động là 9,3 cho PELII 9,5 cho PELIV và 9,7 cho PEL I và III. Cũng như với các PEL từ các nguồn khác, những isoenzyme này được kích hoạt bởi Ca++. Hoạt độ enzyme tăng 50-70% khi có mặt của Ca++ ồng độ 0,5mM. Isoenzyme với pI>10 chứa 2,5-4.8% đường trung tính. Các PEL từ một số loài Bacillus cũng có khả năng gây ra sự giảm nước ở mô thực vật. IV. Các đặc tính kỹ thuật quan trọng của enzyme pectinase:[ I ] 1. Pectinesterase: Các PE ở thực vật tấn công vào hoặc đầu không khử hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các khối galacturonic acid không bò ester hoá rất mẫn cảm với calcium. Các cấu trúc khác nhau của chuỗi galacturonan, chẳng hạn như các monomer acetyl hoá, các nhóm ester bò chuyển đổi thành amide hay bò khử đến rượu bậc một, hay sự tồn tại của các vùng có nhiều mạch nhánh, ức chế hoạt động của PE. PE có tính đặc hiệu cao đối với nhóm methylester của polygalacturonic acid. Các ester khác chỉ bò tấn công rất chậm, còn các nhóm methylester của polymanuronic acid thì không hề bò tấn công. Tốc độ đề ester hoá trên mạch pectin phụ thuộc vào độ dài của mạch; trimethyl trigalacturonate không bò tấn công. Các PE của nấm khác với PE của thực vật theo cơ chế đa mạch, các nhóm mehtoxyl bò lấy đi một cách ngẫu nhiên. 2. Polygalacturonase: Việc xác đònh hoạt tính của enzyme này bằng cách đo độ nhớt của dung dòch pectic acid gồm methylester và glycolester cho thấy sự giảm nhanh tốc độ và mức độ thuỷ phân, đồng thới tăng mức độ ester hoá. Các nhóm acetyl có mặt làm giảm mức độ thủy phân bằng cách giảm ái lực của các phân tử cơ chất qua các khối chứa các điểm liên kết. Sự thủy phân bò hạn chế do sự có mặt của các nhóm acetyl có thể được xác minh bằng cách sử dụng pectin củ cải đường làm cơ chất. PG tạo bởi nấm có thể thủy phân đến 70% pectin bò acetyl hoá. Tuy nhiên, kiểu tác dụng lên cơ chất của các PG có từ các nguồn khác nhau thì khác nhau. Cơ chất tốt nhất cho sự phân hủy của endo-pectin-lyase ở pH>7 là pectin hoàn toàn bò ester hóa. Tuy nhiên,ở các giá trò pH nhỏ hơn, enzyme này vẫn hoạt động đối với pectin bò ester hóa ít hơn, đồng thời cần Ca++ để kích hoạt. Điều này có ý nghóa thực sự đối với các quá trình chế biến trái cây. Những enzyme này cần các nhóm methylester để hoạt động, trái lại chúng bò bất hoạt khi có mặt các nhóm glycolester và các pectate bò amidate hóa. [...]... thủng vỏ trái nho và để nước trong nho bay hơi, và để nho bò nhiễm nấm PHẦN II ỨNG DỤNG CỦA HỆ ENZYM PECTINASE I Tình hình ứng dụng enzym trong công nghiệp trên thế giới :[I ] Từ khi phát hiện ra enzym và khả năng chuyển hóa của enzym loài người đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzym trong công nghiệp Số lượng enzym phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzym được ứng dụng vào công nghiệp... III. 1Ứng dụng enzym pectinase sản xuất nước quả và rượu vang: III.1.1-Các chế phẩm enzym: [I] Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzym là một tiến bộ khoa học rất lớn Các chế phẩm enzym được sử dụng trong sản xuất nước quả và rượu vang có thể là một hỗn hợp nhiều loại enzym và cũng có thể chỉ là một loại enzym riêng biệt Việc sử dụng hỗn hợp enzym hay từng loại enzym riêng biệt phụ thuộc vào... tính ở 70OC và chúng hoạt động mạnh ở 45-50OC Tuy nhiên, ở nước quả lên men, người ta sử dụng enzym để xử lý nước quả ngay ở nhiệt độ thường (trùng với nhiệt độ lên men) Hiệu quả của việc sử dụng enzym Đã có nhiều nghiên cứu và kết quả áp dụng trong sản xuất nước quả và rượu vang cho thấy khi sử dụng enzym pectinase cho hiệu suất nước quả và chất lượng rượu vang rất cao Khi tiến hành ứng dụng enzym trong... độ chắc của thòt quả, cũng như thành phần đònh tính và đònh lượng của pectin chứa trong dòch bào và trong thành tế bào của mô quả Để sử dụng vào việc chế biến nước quả trong thì chế phẩm pectinase phải có enzym endo và exo-polygalacturonse, enzym pectinesterase và proteinaza Trong chế phẩm loại này thì những enzym vừa kể trên là những enzym quyết đònh hiệu quả tác dụng của chế phẩm Vì endo và exo-PG... nhớt của dòch quả; còn enzym PE cũng góp phần vào tác dụng của enzym này Enzym proteinase của chế phẩm sẽ thủy phân vỏ protein của vỏ nguyên sinh tế bào, kết quả là làm cho sự thoát của dòch quả dễ dàng Sự có mặt của xenluase và hemixenlulase ở trong chế phẩm cũng tốt nhưng không bắt buộc Khi sử dụng cho các loại quả như táo, lê thì trong chế phẩm không được phép có enzym pectinaseliminase, và enzym. .. 13% 13% 3% 10% Bảng 2:Mức độ ứng dụng của một số enzym quan trọng hiện nay trên thế giới Qua bảng trên ta thấy các enzym thuộc nhóm protease hiện đang được ứng dụng nhiều nhất Trong đó enzym protease kiềm được ứng dụng trong chất tẩy rửa với số lượng lớn nhất so với các loại emzym khác Trong số các enzym được sản xuất và ứng dụng trên thế giới, các nước châu Âu sản xuất và bán ra thò trường thế giới... thường sử dụng chế phẩm enzym bao gồm pectintrancelinutase, hemicellulase, cellulase Trong đó, enzym pectintrancelinutase đóng vai trò quan trọng nhất Trong hỗn hợp chế phẩm enzym trên, tuyệt đối không được có mặt enzym polygalacturonase, đặc biệt không được chứa enzym endopolygalacturonase Những enzym này thường làm giảm độ nhớt của nước quả và phá vỡ độ đồng nhất của nước quả Việc ứng dụng enzymvào chế... III.1.3 Hiệu quả của việc sử dụng enzym pectinase Những bất lợi khi sử dụng enzym: [I] Nước quả được sử dụng enzym có nhiều ưu điểm, tuy nhiên việc sử dụng enzym cũng có những nhược điểm như xảy ra những biến đổi bất lợi về VSV Nếu xử lý trong thời gian ngắn, quá trình oxy hóa và sự nhiễm VSV không thành vấn đề lớn Nhưng nếu xử enzym trong thời gian dài sẽ xảy ra quá trình oxy hoá và sự nhiễm VSV Người... trường enzym châu u Stt Loại enzym Giá trò buôn bán enzym (triệu USD) 83,2 1 Carbohydrase 187,2 2 Protease 31,6 3 Lipase 41,6 4 Pectinase 20,8 5 Những loại enzym đặc biệt 41,6 6 Các loại enzym khác Riêng trong công nghệ thức phẩm, lượng enzym được tiêu thụ nhiều nhất Số lượng enzym được ứng dụng trong công nghiệp thức phẩm chủ yếu ở các nước châu Mỹ, châu Âu Stt 1 2 Lónh vực công nghiệp và enzym Chuyển... polymyxa Loại enzym Endo - PMG Endo - PMG Endo - PG Endo - PG Endo - PG Endo PTE Endo PTE PH tối ưu 5,2 7,4 – 8,2 4,7 – 4,8 3,7 – 4,2 4,4 5,5 8,9 – 9,1 5- exoenzym là những enzym giải phóng axit galacturonic bắt đầu từ điểm cuối của phân tử pectin Enzym pectinase được ứng dụng chủ yếu để phá vỡ thành tế bào của quả nhằm giải phóng các chất có trong tế bào của quả ra ngoài Việc ứng dụng pectinase để . PHẦN II ỨNG DỤNG CỦA HỆ ENZYM PECTINASE I. Tình hình ứng dụng enzym trong công nghiệp trên thế giới :[I ] Từ khi phát hiện ra enzym và khả. tại của các isoenzyme, mặc dù chỉ có hai isoenzyme trong cà chua được biết đến. Một số gen mã hoá cho các enzyme PE đã được tách dòng và nghiên cứu đặc điểm.