thu nhận và ứng dụng các chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển

Bài mở ñầu• Tên học phần: Thu nhận và ứng dụng các chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển • Thời lượng: 30 tiết • Mục tiêu học phần: – Sau khi học xong học phần này, học viên sẽ hi

Bài mở ñầu

• Tên học phần: Thu nhận và ứng dụng các

chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển

• Thời lượng: 30 tiết

• Mục tiêu học phần:

– Sau khi học xong học phần này, học viên sẽ hiểu

rõ tiến trình khai thác và ứng dụng các hợp chất

có hoạt tính sinh học trong tự nhiên

– Học viên có thể tự chiết tách, tinh chế, ñánh giá

hoạt tính sinh học và ñề xuất khả năng ứng dụng của một số hợp chất tự nhiên từ những sinh vật biển phổ biến

• Mô tả học phần:

– Cung cấp những kiến thức chung về tách

chiết và ứng dụng các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học

– Thảo luận một số chuyên ñề chuyên sâu về

chiết tách, tinh chế và ñánh giá hoạt tính

sinh học của các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển có khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và thủy sản

Ớ Nội dung chi tiết học phần:

Chương 1: Giới thiệu chung

Chương 2: Các bước cơ bản trong thu nhận và ứng

dụng hợp chất có hoạt tắnh sinh học từ sinh vật biển

Chương 3: đánh giá hoạt tắnh sinh học của các hợp

chất tự nhiên Chương 4: Một số kỹ thuật cơ bản ựược ứng dụng

trong chiết tách, tinh chế và xác ựịnh cấu tạo các hợp chất tự nhiên

Chương 5: Chiết tách và ứng dụng một số hợp chất

có hoạt tắnh sinh học từ sinh vật biển

Ớ Tài liệu học tập và tham khảo:

[1] đái Duy Ban (2008) Các hợp chất thiên nhiên có

hoạt tắnh sinh học phòng chống một số bệnh cho

người và vật nuôi NXB Khoa h c T nhiên và Công

ngh, Hà Nội.

[2] Bhakuni D.S., Rawat D.S (2005) Bioactive Marine

Natural Products Springer Publisher 400 p.

[3] Hiromasa Kiyota (2006) Marine Natural Products

Springer Publisher 287 p.

[4] Baroww C., Shahidi F (2002) Marine Nutraceuiticals

and Functional Foods CRC Press 494p.

[5] Rajeev K.J., Xu Z.R (2004) Biomedical Compounds

from Marine organisms Marine Drugs 2, 123-146.

[6] Takamatsu S., Hodges T.W., Rajbhandari I., Gerwick

W H., Hamann M.T., Nagle D.G (2003) Marine Natural Products as Novel Antioxidant Prototypes

Journal of Natural Products 66, 605-608.

• Phương pháp ñánh giá học viên:

– Kiểm tra, seminar: 30%

– Thi hết học phần: 70%

GIỚI THIỆU CHUNG Chương 1:

Khái quát chung v ề hợp chất tự

• Khái niệm

Hợp chất tự nhiên có tác dụng trị bệnh hoặc hỗ trợ sức khỏe

• Phân loại

– Theo chức năng sinh học

• Nhóm các hợp chất chuyển hóa bậc 1: Protein, Lipid, Gluxit,

• Nhóm các hợp chất chuyển hóa bậc 2: Saponin, Terpenoid,

Flavonoid, Alkaloid, Tinh dầu, anthocyamin

– Theo cấu tạo hóa học

ðặc ñiểm, môi trường sống và sự

trao ñổi chất của sinh vật biển

• Sinh vật biển tạo ra một quần thể sinh thái rất ña

dạng

• Môi trường thủy sinh rất rộng lớn và có nhiều thay

ñổi rất khác thường

• Sinh vật biển hình thành con ñường chuyển hóa thứ

cấp ñể sản sinh ra các hợp chất có cấu trúc hóa học ñặc biệt làm thích nghi với môi trường sống

• Các chất ñã ñược xác ñịnh như terpenes,

shikimates, polyketides, acetogenins, peptides,

alkaloids và còn rất nhiều chất chưa nhận diện ñược hoặc chưa xác ñịnh ñược cấu trúc

Tiềm năng ứng dụng của các

sinh vật biển

• Cấu trúc của hơn 5.000 hợp chất tự nhiên từ sinh vật

biển ñã ñược công bố trong thập niên qua

• Các chất này có khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh

vực khác nhau, ñặc biệt là ứng dụng trong dược

phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm

• Hầu hết các hợp chất ñã ñược chiết tách và tinh chế

ở quy mô lớn

• Quy trình chiết tách và tinh chế rõ ràng

• Áp dụng công nghệ tiên tiến

Hoạt tính sinh học của sản phẩm

• Tảo biển

– Dẫn xuất halogen có hoạt tính kháng khuẩn, kháng mốc từ

Symphyocladia gracilis, Rhodomela larix, Polysiphonia lanosa

1) 2,3-dibromobenzyl alcohol, 4,5-disulphate dipotassium 2) 2,3-dibromo-4,5dihydroxybenzaldehyde

3) 2,3-dibromo-4,5-dihydroxybenzyl alcohol 4) 3,5-dibromo-p-hydroxybenzyl alcohol 5) 5-bromo-3,4dihydroxybenzaldehyde

– Dẫn xuất halogen của các hợp chất dị vòng chứa oxy có

hoạt tính diệt ấu trùng của muỗi ñược chiết tách từ rong ñỏ

Laurencia glandilufera và L nipponica

– Hợp chất dị vòng chứa nitơ có hoạt tính diệt giun ñược

chiết tách từ rong Chondria armata, Digenea simplex,

Corallina officinalis

Acid domoic

Acid kainic

– Acid amin và amin có tác dụng hạ huyết áp, ñược chiết

tách từ rong Laminaria angustata và Chondria amata

Laminine

– Sterol có tác dụng hạ làm giảm cholesterol trong máu, làm giảm mỡ ở gan và tim, ñược chiết tách từ các loài rong ñỏ

Rhodymenia palmata, Porphyra purpurea, P umbilicalis,

Halosaccion ramentaceum, Hypnea japonica

22-dehydrocholesterol Demosterol

Fucosterol Chondrillasterol

Poriferasterol

– Polysaccharide sulfat hóa

• Acid alginic và muối alginate: alginate canxi có tác dụng cầm

máu, alginate natri có tác dụng hỗ trợ tạo miễn dịch kháng virus cúm, tiêu sỏi thận,

• Polysaccharide sulfat hóa

– Carrageenan: chất kháng nguyên, kích thích sự phát triển của mô

liên kết, kháng virus cúm B, virus bệnh quai bị, chống viêm loét

dạ dày,

– Agar: kháng virus cúm B, virus bệnh quai bị – Laminarin: có tác dụng chống ñông máu

• ðộng vật không xương sống

– Steroid hormone kích thích sự lột xác ở côn trùng, ñược

chiết tách từ các loài giáp xác

Callinecdysone A Callinecdysone B

20-Hydroxyecdysone

β-ecdysone

– Saponin ñược chiết tách từ hải sâm có tác dụng chống

mốc, làm tan huyết, hỗ trợ thần kinh cơ, chống ung thư

: Oxidoholothurinogenin : 17-deoxyholothurinogenin

– Isoprenoids như vitamin A, Vitamin D, carotenoid, phân bố rộng rãi trong các loài sinh vật biển

– Terpenoid ñược chiết tách san hô sừng Eunicea mammosa

có tính kháng khuẩn Clostridium feseri và Staphylococcus

– Trong vỏ san hô Plexaura homomalla có chứa prostaglandin

có hoạt tính tương tự hormone trong ñiều khiển chức năng sinh sản

Diester PGA2

PGA

Những khó khăn trong chiết tách các chất có

• Không chắc chắn trong việc phân loại

– Tính ña dạng của sinh vật

– Tính khác biệt giữa các cá thể

• Lượng sản phẩm của quá trình trao ñổi chất rất nhỏ

10,7mg spongistatin 4 chiết từ 2,5 tấn bọt

biển Spirastrella spinispirulifera / vùng bi1n

Nam Phi, tinh ch2 b3ng HPLC kích thư7c

c8t 3 m × 15 cm

1mg dolastatin 10 chiết từ 2 tấn sên biển Dolabella auricularia ở

ñảo Mauritius Ấn ðộ dương, tách chiết gồm 20.000 phân ñoạn,

áp dụng 23 bước phân tách bằng các kỹ thuật sắc ký khác nhau

• Sản phẩm của quá trình trao ñổi chất thường không

ổn ñịnh, dễ bị phân hủy

– Sinh vật biển rất dễ bị biến ñổi, hư hỏng sau khi ñánh bắt

– Những yếu tố ảnh hưởng ñáng chú ý: nhiệt ñộ, ánh sáng, không khí, pH

– Biến ñổi do phản ứng với vật liệu sử dụng trong chiết tách, tinh chế

• Oxit nhôm xúc tác cho phản ứng ña tụ, thay ñổi cấu trúc, hydrat

hóa hoặc dehydrat hóa aldol

• Silica làm tăng sự oxy hóa, thay ñổi cấu trúc, N- và

O-demethylation

• Các dung môi acetone, MeOH, ethylene glycol, thúc ñẩy phản

ứng khép vòng

• Tính acid yếu của các dung môi sử dụng trong phân tích NMR

như DCCl3 có thể là nguyên nhân gây phân hủy các hợp chất có

ñộ nhạy cảm cao với pH

• Ảnh hưởng của muối và nước ñến quá trình tinh chế

các hợp chất hòa tan trong nước

– ðể chiết tách các hợp chất hòa tan trong nước phải dùng

nước hoặc dung môi có ñộ phân cực cao như MeOH

– Trong môi trường nước:

• Sự phát triển của vi sinh vật có thể gây sai lệch kết quả ñánh giá

hoạt tính sinh học

• Cô ñặc khó khăn

• Khử muối rất phức tạp

– Trong dung môi hữu cơ

• Dịch chiết có lẫn các tạp chất không ưa nước

• Làm biến tính hoặc thúc ñẩy các các phản ứng gây biến ñổi cấu

trúc

• Dư lượng dung môi có thể gây sai lệch kết quả ñánh giá hoạt

tính sinh học

• Một số hợp chất không có sắc phổ cực tím

– “UV-detector” cho ñộ nhạy cao trong phân tích các hợp chất

tự nhiên

– Hạn chế của “UV-detector”:

• Không phát hiện ñược những hợp chất không có sắc phổ cực tím

• Dung môi sử dụng có ñộ hấp thu ánh sáng cực tím mạnh

– Phân tích bằng “RI-detector”

• ðộ nhạy thấp

• Chỉ dùng ñược trong trường hợp tách rửa bằng dung môi ñồng

nhất

• Khi tách rửa bằng gradient của hỗn hợp nhiều dung môi khác

nhau thì chỉ số khúc xạ (Refractive Index) sẽ khác nhau, làm tăng

ñộ lệch của vạch biên ngang (baseline), khó phát hiện ñược những hợp chất không có sắc phổ ở nồng ñộ thấp

• Chi phí và thời gian

– Tốn thời gian

– Tẻ nhạt, buồn chán

– ðắt tiền

CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG THU

SINH VẬT BIỂN Chương 2:

Các bước cơ bản trong chiết tách và ứng dụng

• Biến ñổi hóa học

• Mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt

Thu mẫu, xử lý và bảo quản sinh vật biển

Ớ Hồ sơ thu mẫu

Ờ đánh số mẫu

Ớ Ngày tháng năm

Ớ Người thu mẫu

Ớ Số riêng của mẫu

Ờ Vị trắ thu mẫu

Ớ Vị trắ trên bản ựồ/ựịnh vị toàn cầu (ựộ chắnh xác 10 m)

Ớ Mô tả ựiều kiện sống

Ớ Hệ sinh thái của môi trường xung quanh

Ờ đặc ựiểm của sinh vật

Ớ Nhận diện giống, loài

Ớ Hình thái

Ớ Kắch cỡ

Ớ Những biến ựổi trong quá trình thu mẫu

Ớ Phương pháp xử lý và bảo quản mẫu

Ờ Bảo quản bằng hóa chất

Ờ Bảo quản ở nhiệt ựộ thấp

• Hồ sơ thu mẫu của nhóm nghiên cứu Trường ðại học California

Chiết tách và tinh chế hợp chất có hoạt tính

Kiểm tra hoạt tính sinh học

• Kỹ thuật chiết tách

cấu trúc

Thay ñổi cấu trúc

Thử ñộc tính

Tổng hợp

Chiết tách hợp chất có hoạt tính sinh học từ

sinh vật biển

• Chiết tách bằng dung môi

– Xay nghiền/ñồng hóa

– Chiết bằng dung môi hữu cơ/nước

– Lọc/ly tâm

– Cô ñặc khử dung môi

• Chiết tách bằng ñá khô (National Cancer Institute)

– Xay nghiền mẫu ñông với ñá khô

– Chiết bằng nước ở 4oC/MeOH-CH2Cl2 (v/v=1:1)/MeOH

– Sấy chân không thăng hóa/Cô ñặc khử dung môi

• Chiết tách bằng phương pháp SCF (Supercritical

Fluid)

Chiết tách bằng phương pháp SCF

Phân ñoạn dịch chiết thô theo ñộ phân cực

n-BuOH Tăng ñộ phân cực H2O

Kiểm tra hoạt tính sinh học

Đ

Đ phân c phân c phân c c th c th c th p/trung b p/trung b p/trung bìììình nh Đ Đ phân c phân c phân c c cao c cao

Tinh chế hợp chất có hoạt tính sinh học

Đ

Đ phân c phân c c th phân c c th p/trung b c th p/trung b p/trung bìììình nh Đ Đ phân c phân c phân c c cao c cao

H2O MeOH

1) Sắc ký trao ñổi ion

1) H2O 2) MeOH

Muối khoáng Hợp chất hữu cơ

Hợp chất có hoạt tính

1) Sắc ký lọc gel 2) Sắc ký ái lực

Kiểm tra Hoạt tính sinh học

Hợp chất có hoạt tính

sinh học tinh khiết

1) Sắc ký hấp phụ 2) Sắc ký phân chia 3) Sắc ký ái lực

Kiểm tra

Hoạt tính

sinh học

Những phương pháp và kỹ thuật cơ bản ñược áp dụng trong xác ñịnh cấu trúc

Xác ñịnh cấu trúc

Phương pháp quang phổ

Phương pháp hóa học lập thể tuyệt ñối

Phương pháp hóa học

MS NMR

X-Ray NMR

Phản ứng Phân giải Tổng hợp

Nhận diện v à xác ñịnh cấu trúc bằng

phương pháp sắc ký lỏng

ðÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Chương 3:

Nguyên tắc chung

Ớ Có nhiều phương pháp khác nhau ựể ựánh giá hoạt

tắnh sinh học của các hợp chất tự nhiên

Ớ Các tiêu chắ ựể lựa chọn phương pháp ựánh giá hoạt

tắnh sinh học của các hợp chất tự nhiên

Ờ đơn giản

Ờ Kinh tế

Ờ đáng tin cậy

Ờ Có thể phát hiện ựược những hoạt tắnh mới

Ờ Khách quan và ựại diện

Ớ Những thông tin cơ bản cần thu thập khi ựánh giá

hoạt tắnh sinh học của các hợp chất tự nhiên

Ờ Ảnh hưởng của liều lượng sử dụng

Ờ độc tắnh ở liều lượng cao

Ờ Tác dụng phụ/hoạt tắnh mới

Ờ Mối quan hệ giữa hoạt tắnh và cấu trúc/cơ chế tác dụng

Ớ Những khó khăn thường gặp

Ờ Lượng dịch chiết/hợp chất tinh chế ựược rất ắt

Ờ Phương pháp phân tắch rất ựắt tiền

Ờ Rất ắt PTN có thể thực hiện ựược tất cả các phương pháp ựánh giá

Ờ đánh giá in vitro và in vivo

Ờ Thời gian ựể ựánh giá tắnh an toàn rất dài

Phân loại các phương pháp

Ớ đánh giá hoạt tắnh riêng

Ờ Phương pháp phát hiện một hoạt tắnh sinh học cụ thể của dịch chiết/hợp chất tinh chế

Ờ Vắ dụ: Tắnh kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, Ờ Thực hiện ựược ở các PTN chuyên về các lĩnh vực này

Ớ đánh giá tiềm năng sinh học

Ờ Phương pháp phát hiện các hoạt tắnh sinh học và khả năng ứng dụng của dịch chiết/hợp chất tinh chế

Ờ Thực hiện ựược ở các Trung tâm nghiên cứu, Viện nghiên cứu,

Phương pháp ñánh giá ñộc tính

• ðộc tính theo quy ñịnh của các văn bản mang tính

pháp lý

• ðộc tính ảnh hưởng ñến sinh sản

• ðộc tính gây quái thai

• ðộc tính trước và sau khi sinh

• ðộc tính gây ung thư

• ðộc tính gây ñột biến

MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN ðƯỢC ỨNG DỤNG TRONG CHIẾT TÁCH,

Chương 4:

Kỹ thuật sắc ký áp dụng trong chiết tách, tinh

• Kỹ thuật sắc ký ñược nhà khoa

học Nga Tswett thực hiện ñầu tiên

vào năm 1906

• IUPAC (International Union of pure

and applied Chemistry), 1993:

S@c ký là m8t phương pháp vDt lý

dùng ñ1 phân tách các chGt có

trong hIn hJp d a vào s phân

bK cLa chúng giNa 2 pha, m8t pha

tĩnh và m8t pha ñ8ng chuy1n

ñ8ng qua pha tĩnh

Mikhail Tswett, 1872-1919

• Phân loại sắc ký

– Dựa theo pha ñộng:

• Sắc ký lỏng (Liquid chromatography, LC)

• Sắc ký khí (Gas chromatography, GC)

– Dựa vào pha tĩnh:

• Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography, TLC)

• Sắc ký giấy (Paper chromatography, PC)

• Sắc ký cột (Column chromatography, CC)

– Dựa vào nguyên lý phân tách

• Sắc ký hấp phụ (Adsorption chromatography)

• Sắc ký phân chia (Partition chromatography)

• Sắc ký trao ñổi ion (Ion exchange chromatography)

• Sắc ký lọc gel (Gel filtration chromatography)

• Sắc ký ái lực (Affinity chromatography)

• Phân loại sắc ký lỏng

Pha tĩnh

Nguyên lý phân tách

• Nguyên lý phân tách và tinh chế

bằng phương pháp sắc ký

– ðộ phân cực

– ðiện tích

– Kích thước phân tử

Phân tách dựa vào ðộ phân cực

Cyanopropylsilyl- [CN], n-octylsilyl- [C8], n-octadecylsilyl- [C18, ODS]

Sắc ký lớp mỏng (TLC)

• Nguyên lý phương pháp dựa vào :

– ðộ hòa tan của các chất trong pha ñộng

– Lực hấp phụ của các chất trên pha tĩnh

• Ứng dụng:

– Nhận diện

– Kiểm tra ñộ tinh khiết

• Ưu nhược ñiểm

– Nhanh

– Ít tốn mẫu

– Khả năng phân tách thấp

Sắc ký giấy

Sắc ký cột

Phân ñoạn

Sắc ký trao ñổi ion

Sắc ký lọc gel (gel permeation)

• Nguyên lý phương pháp

Hệ thống HPLC (Isocratic)

Hệ thống HPLC (High-Pressure-Gradient)

Hệ thống HPLC (Low-Pressure-Gradient)

Hệ thống HPLC (Preparative Chromatography)

Hệ thống HPLC ñầy ñủ

Cột sắc ký

Sắc ký ái lực

...

sinh vật biển< /b>

• Cấu trúc 5.000 hợp chất tự nhiên từ sinh vật

biển cơng bố thập niên qua

• Các chất có khả ứng dụng nhiều... 37

Chiết tách hợp chất có hoạt tính sinh học từ< /b>

sinh vật biển< /b>

• Chiết tách dung mơi

–... chất hữu cơ

Hợp chất có hoạt tính< /b>

1) Sắc ký lọc gel 2) Sắc ký lực

Kiểm tra Hoạt tính sinh học< /b>

Hợp chất