h sinh học và các chất chuyển hóa th cấp v i các ng dụn dược phẩm tiềm năn mang lại kết quả đầy h a hẹn. Theo những nghiên c u gần đây ho thấy Hải miên ở vùng biên Việt Nam rất phon phú, đ dạng, trữ ượng l n ch a hàng loạt các hoạt chất sinh học tiềm năn và d ch chiết từ Hải miên biểu hiện khả năn h n huẩn, kháng ung thư. Những tiềm năn v ý n h thực tiễn của Hải miên đó ũn do thực hiện đề tài “Tách chiết v đ nh h t ho t t nh s nh họ t ải miên Haliclona sp. “ 1.2 n h ho họ ủ đề tài Kết quả nghiên c u củ đề tài cho thấy tiềm năn ủa Hải miên nói chung và Hải miên Haliclona sp nói riêng. Đón óp thêm ơ sở khoa học về điều kiện tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học từ Hải miên Haliclona sp và hoạt t nh h n un thư ủa Hải miên Haliclona sp. Góp phần khuyến khích các công trình nghiên c u từ Hải miên, các sinh vật biển nói chung và Hải miên Haliclon sp nói riêng từh sinh học và các chất chuyển hóa th cấp v i các ng dụn dược phẩm tiềm năn mang lại kết quả đầy h a hẹn. Theo những nghiên c u gần đây ho thấy Hải miên ở vùng biên Việt Nam rất phon phú, đ dạng, trữ ượng l n ch a hàng loạt các hoạt chất sinh học tiềm năn và d ch chiết từ Hải miên biểu hiện khả năn h n huẩn, kháng ung thư. Những tiềm năn v ý n h thực tiễn của Hải miên đó ũn do thực hiện đề tài “Tách chiết v đ nh h t ho t t nh s nh họ t ải miên Haliclona sp. “ 1.2 n h ho họ ủ đề tài Kết quả nghiên c u củ đề tài cho thấy tiềm năn ủa Hải miên nói chung và Hải miên Haliclona sp nói riêng. Đón óp thêm ơ sở khoa học về điều kiện tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học từ Hải miên Haliclona sp và hoạt t nh h n un thư ủa Hải miên Haliclona sp. Góp phần khuyến khích các công trình nghiên c u từ Hải miên, các sinh vật biển nói chung và Hải miên Haliclon sp nói riêng từh sinh học và các chất chuyển hóa th cấp v i các ng dụn dược phẩm tiềm năn mang lại kết quả đầy h a hẹn. Theo những nghiên c u gần đây ho thấy Hải miên ở vùng biên Việt Nam rất phon phú, đ dạng, trữ ượng l n ch a hàng loạt các hoạt chất sinh học tiềm năn và d ch chiết từ Hải miên biểu hiện khả năn h n huẩn, kháng ung thư. Những tiềm năn v ý n h thực tiễn của Hải miên đó ũn do thực hiện đề tài “Tách chiết v đ nh h t ho t t nh s nh họ t ải miên Haliclona sp. “ 1.2 n h ho họ ủ đề tài Kết quả nghiên c u củ đề tài cho thấy tiềm năn ủa Hải miên nói chung và Hải miên Haliclona sp nói riêng. Đón óp thêm ơ sở khoa học về điều kiện tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học từ Hải miên Haliclona sp và hoạt t nh h n un thư ủa Hải miên Haliclona sp. Góp phần khuyến khích các công trình nghiên c u từ Hải miên, các sinh vật biển nói chung và Hải miên Haliclon sp nói riêng từ
MỤC LỤC I Phần mở đầu .3 1.1 Lý chọn đề tài n h ho họ ủ đề tài 1.3 Mụ tiêu đề tài .3 Đối tượng phạm vi đề tài n hiên u tron v n o i nư II Phươn ph p n hiên .4 u Sơ đồ nghiên c u chung 2.2 Thuyết minh quy trình 2.2.1 Khảo s t phươn ph p hiết Hải miên haliclona sp 2.2.2 Khảo sát dung môi chiết đối v i phươn ph p hiết Soxhlet 10 hiết phân đoạn v i dun môi h nh u 10 Đ nh i hoạt t nh d h hiết ải miên Haliclona sp 11 m ượn prot in tổng 11 m ượn ph no i 12 m ượn m ượn st roid 14 vonoid 13 Phươn ph p thực 15 Đ nh i hoạt t nh ây độc lên tế b o Un thư 15 IV Dự kiến nội dung luận văn 19 KẾT LUẬN 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 DANH MỤC HÌNH ình Sơ đồ nghiên c u chung .8 ình Quy trình đ nh i năn ây độc lên tế b o Un thư m u K 16 ình Quy trình đ nh i năn ây độc tế bào bằn phươn ph p MTT .18 DANH MỤC BẢNG Bản Đường chuẩn BSA (0-2mg/ml) 11 Bản Bản Đường chuẩn Quercetin (0 – 0.1 mg/ml) 13 Bản Đường chuẩn Choleslerol (0 – 0,12 mg/ml) 15 Đường chuẩn Acid Galic (0-0,12mg/ml) 12 I Phần mở đầu 1.1 Lý chọn đề tài Việc nghiên c u, khảo sát thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi sinh vật biển coi nhữn hư ng nghiên c u quan trọng kỉ th Dược liệu Biển nguồn cung cấp dồi chất có hoạt tính sinh học đ n thu hút quan tâm đặc biệt nhà khoa học gi i Tron đó, hải miên (Pori r ) đ n đượ ưu tiên n hiên u phát loạt thành phần hóa học hoạt tính sinh học chất chuyển hóa th cấp v i ng dụn dược phẩm tiềm năn mang lại kết đầy h a hẹn Theo nghiên c u gần ho thấy Hải miên vùng biên Việt Nam phon phú, đ dạng, trữ ượng l n ch a hàng loạt hoạt chất sinh học tiềm năn d ch chiết từ Hải miên biểu khả năn h n thư Những tiềm năn v ý n h thực tiễn Hải miên ũn “Tách chiết v đ nh n h 1.2 - ho họ h t ho t t nh s nh họ t huẩn, kháng ung thực đề tài ải miên Haliclona sp “ ủ đề tài Kết nghiên c u củ đề tài cho thấy tiềm năn Hải miên nói chung Hải miên Haliclona sp nói riêng - Đón óp thêm sở khoa học điều kiện tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học từ Hải miên Haliclona sp hoạt t nh h n un thư Hải miên Haliclona sp - Góp phần khuyến khích cơng trình nghiên c u từ Hải miên, sinh vật biển nói chung Hải miên Haliclon sp nói riêng từ h i th v nân o i tr , lợi ích tiềm tang mà chúng mang lại 1.3 Mụ t đề tài - Tách chiết thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học từ Hải miên Haliclona sp - Đ nh i h m ượng hợp chất có hoạt tính sinh học từ phân đoạn d ch cao chiết - Đ nh i năn ây độc lên tế b o un thư máu K562 phân đoạn d ch cao chiết 1.4 Đố tượng ph m v đề tài Hải miên Haliclona sp lấy từ vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa Dòng tế b o un thư m u K562 tế b o un thư m u v dòn tế bào biểu mô thận n ười HEK làm đối ch ng 1.5 n h ên u tron v n o nư Kết nghiên c u cho thấy hợp chất phân lập từ giống Haliclona thể số hoạt t nh đ n qu n tâm ây độc tế bào, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, chốn oxy ho …Tron đó, bật hoạt t nh ây độc tế bào v i khả năn c chế mạnh nhiều dòn tế b o un thư h nh u Hai hợp chất (halicloic acid A) (halicloic acid B) phân lập từ loài hải miên Haliclona sp thu thập v n biển Philippine Trong thử nghiệm in vitro hún thể khả năn c chế tái tổ hợp sử dụn để hư ng dẫn việc thiết kế tổng hợp chất c chế IDO (Indoleamine-2,3-dioxygenase) [1] Từ loài hải miên Haliclona sp., Christine cộng phân lập sáu hợp chất terpene Tron đó, h i hợp chất (adociasulfate 2) (adociasulfate 6) phát chất có khả năn ìm h m đặc hiệu enzyme ATPase [2] Tám hợp chất m i Yu cộng phân lập từ loài H oculata Tám hợp chất n y đượ đ nh i năn ây độ đối v i b dòn tế b o: un thư m u L- 60 un thư phổi A-549 Kết cho thấy, hợp chất 2-ethoxycacbonyl- β-hydroxy-Anor-ergosta5,24(28)-dien-4-one thể khả năn ây độc mạnh đối v i dòn tế bào un thư n ười HL-60 (IC50 = 0,32 µg/mL) A-549 (IC50 = 0,47 µg/mL) [3] Hai hợp chất (densanin A) (densanin B) phân lập từ loài hải miên H densaspicula (Hàn Quốc) Hai hợp chất n y phát có khả năn sản sinh NO đại thực bào v i giá tr I , v c chế mạnh , μM [4 ] Một nghiên c u khác cho biết hợp chất (papuamine) (haliclonadiamine) phân lập từ loài hải miên Haliclona sp thuộc biển Indonesia thể hoạt tính c chế phát triển tiền liệt LN dòn tế b o un thư n ười: un thư vú M p, un thư đại trực tràng Caco-7 v i i tr I tron -7, un thư tuyến hoảng 0,93~4,44 µM [5] Hợp chất (haliclonacyclamine A) phân lập từ loài hải miên Haliclona sp (thu quần đảo Solomon) Hợp chất thể hoạt t nh h n vi tr n sốt rét Plasmodium falciparum FCB1 (haliclonacyclamine A) có khả năn Và thử nghiệm in vivo, hợp chất hống lại vi tr n sốt rét Plasmodium vinckei petteri chuột Hợp chất (haliclonin A) Kyoung cộng phân lập từ loài hải miên thuộc giống Haliclona Hợp chất n y thơng báo có hoạt tính ây độc tế bào trung bình kháng sinh mạnh đối v i chủng vi khuẩn khác [6] Từ loài hải miên H nigra (v n biển Papua New Guinea), Mohamad cộng đ phân ập hợp chất (haligramide A) (haligramide B) Cả hai hợp chất n y có hoạt t nh ây độc tế b o đối v i số dòn tế b o un thư n ười (un thư phổi A- 49, un thư ruột kết T- v un thư n o SN - 9) i tr I haligramide A khoảng 5,17- 15,62 µg/mL (haligramide B) khoảng 3,89- 8,82 µg/mL[7] Hợp chất (haliclorensin) Gainit cộng phân lập từ loài hải miên H tulearensis thu v n v nh Sodw n , Durb n, N m Phi độ sâu loài hải miên n y đượ đ nh i bạch cầu chuột P-388 v i i tr I m D h hiết thơ ó hoạt t nh ây độc tế bào mạnh tế b o un thư , mL [8] Hai alkaloid isoquinolin (1-hydroxymethyl-7-methoxyisoquinolin-6-ol) (mimosamycin) phân lập từ loài hải miên thuộc chi Haliclona (Philippine) Trong thử nghiệm hoạt t nh ây độc tế bào, hợp chất mimosamycin thể hoạt tính h n u đối v i khối u t nh LOX v dòn tế bào khối u buồng tr n n ười OVCAR-3[9] Từ loài hải miên Haliclona sp thu v nh (haliclonyne) ceramide m i i t, polyacetylen m i (N-docosanoyl-D-erythro-(2S,3R)-16- methylheptadecasphing-4 (E)-enine) phân lập từ loài hải miên Haliclona koremella Hợp chất n y thông báo có hoạt tính chống gỉ chống nấm tảo [30] Tình hình nghiên c u lồi Hải miên Việt Nam Mặ d o i hải miên đ nhà khoa học gi i quan tâm nghiên c u từ s m, nhiên Việt N m d đượ oi ó v n biển giàu tài nguyên đ dạng lồi sinh vật biển song cơng trình nghiên c u hải miên m i có Năm , nhóm n hiên u củ S hâu Văn Minh v ộng đ phân lập từ loài hải miên Ircinia echinata hợp chất sesterterpene m i 7E, 12E, 20E-variabilin n v i hợp chất đ biết variabilin Các thử nghiệm hoạt tính chất cho thấy, hợp chất th thể hoạt t nh ây độc tế b o dòn tế b o un thư K v p v i i tri I tươn ng 1,2, 3,3µg/ml, hợp chất th có giá tri IC50 lần ượt 5,0, 2,3 µg/ml [10] đ ũn tron năm phân ập ba hợp chất steroid: ostreasterol, isofucosterol 5,8- , nhóm n hiên S hâu Văn Minh cộng u củ epidioxycholest-6-en-3β-ol từ loài hải miên Dysidea cinerea Kết nghiên c u hoạt t nh ây độc tế bào cho thấy, hợp chất th thể hoạt tính mạnh ba dòng tế b o un thư n ười thử nghiệm: un thư biểu mô K (I , m ), un thư gan HepG2 (IC50 = 2,4 µg/ml) [2] Năm 8, nhóm n hiên u củ S hâu Văn Minh đ phân ập từ loài hải miên Xestospongia testudinaria, hai hợp chất xit béo đ nối đôi h a brom m i: 20bromo-(11E,15E,19E)-eicosa-11,15,19-triene-7,9,17-triynoic (17E,21E)-docosa-17,21-diene-9,11,19-triynoic Hợp chất th kháng vi sinh vật kiểm đ nh acid 22- bromo- thể hoạt tính hủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus nấm mốc Fusarium oxyporum v i giá tr MIC 50,0 µg/ml [3] Năm 9, nhóm n hiên u củ S hâu Văn Minh phối hợp v i nhà khoa học Hàn Quố đ phân ập đượ năm hợp chất sterol từ loài hải miên Ianthella sp tron có hợp chất m i là: petrosterol-3,6-dione, ,6α-epoxypetrosterol aragusterolketal B hợp chất đ biết petrosterol aragusterol B Ba hợp chất m i thể hoạt t nh ây độc tế b o dòn tế b o un thư A-549, HL-60, MCF-7, SK-OV-3 U937 v i giá tri IC50 khoảng 8,4-22,1 µM [11] Ngồi ra, hai hợp chất th hợp chất petrosterol thể hoạt t nh ây độc tế b o b dòn tế bào un thư n ười MCF-7, SK-Hep1, HeLa v i giá tri IC50 khoảng 12,8-27,8 µM [12] Từ lồi hải miên Mycale plumose, nhóm nghiên c u củ P S Ph n Văn Kiệm cộng đ tiến hành phân lập bốn hợp chất st ro : β-hydroxycholest-5en7-one, β, α, 6β-triolcholest-7-en , saringosterol cholesterol [13] Tron năm , th o n hiên u GS hâu Văn Minh v ộng n ười Nga phân lập hợp chất alkaloid m i từ loài hải miên Penares sp Tiếp tụ thử nghiệm hoạt tính chất phân lập Kết cho thấy, hợp chất thể hoạt t nh ây độc tế b o dòn un thư n ười HL-60 Hela v i i tr I lần ượt 16,1 33,2 µM [14] S hâu Văn Minh v Theo nghiên c u khác củ ộng n ười Nga, từ loài hải miên Penares sp phân lập hợp chất triterpenoid m i Một hợp chất thể hoạt t nh ây độc tế b o dòn tế b o un thư L-60 v i giá tri IC50 9,7 µM [41] Năm , th o n hiên u củ P S Ph n Văn Kiệm cộng n ười Hàn Quố đ phân ập hợp chất sesquiterpene m i từ loài hải miên Dysidea cinerea [16,17] II Phươn pháp nghiên c u 2.1 Sơ đồ nghiên c u chung Quy trình tách chiết hoạt chất sinh học từ hải miên Haliclona sp [18] Hải miên Haliclona Xử lý mẫu Khảo s t phươn ph p hiết Khảo sát dung môi chiết Tách chiết D ch chiết Cô quay Phân đoạn Methanol Đ nh i phân đoạn d ch chiết m ượng protein m ượng phenol m ượng flavonoid m ượng sterol ây độc lên tế b o un thư Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu chung 2.2 Thuyết minh quy trình - Mẫu hải miên Haliclona s u hi thu thập từ vùng biển Nha Trang Khánh Hòa bảo quản -20 o S u đó, mẫu ân để x đ nh khối ượn b n đầu - Mẫu xử ý đôn hô, tiến hành tiền đôn hô nhiệt độ -80oC khoảng hô nhiệt độ -49 oC, áp suất 0.045 mbar 24 S u đó, mẫu đượ đư v o m y đơn thời gian 2-3 ngày - Sau kết thú qu trình đơn hơ, mẫu bảo quản kín túi zip nhiệt độ phòng - 10g mẫu Hải miên đ xử ý đôn hô đượ d n để khảo s t phươn ph p hiết dung môi chiết 2.2.1 Khảo s t phươn ph p hiết Hải miên haliclona sp Phươn ph p n âm h ết (ngâm l nh) 10g Bột Hải miên haliclona đ đôn hô, n âm 300ml methanol nhiệt độ phòng, khuấy trộn, thời gian 24 giờ, s u ắng, lọc thu lấy d ch chiết, cô quay đuổi b t dung môi, v phơi hô, x đượ đ nh ượn : m ượn prot in, m ượng sterol v Đ nh i năn đ nh hiệu suất chiết D ch chiết thu m ượn ph no , m ượng flavonoid, ây độc lên tế b o un thư K Phươn ph p h ết Soxhlet: - 10g Bột Hải miên haliclona đ xử ý đôn hô hô gói túi giấy lọ , đặt trực tiếp vào ống - Qua cổ ống sinh hàn rót dung mơi chiết vào bình cầu, ượng dung mơi phải đủ thấm t bột nguyên liệu m i chảy xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thơng (khoảng 2/3 thể tích bình cầu) - Sau kiểm tra hệ thống kín, mở nư c chảy ho n ưu tron ốn n ưn ật bếp cách thủy điều chỉnh nhiệt độ cho dung môi sôi nhẹ Dung mơi tinh khiết đượ đun nón dun mơi sơi, b y ặp lạnh, n ưn tụ tháp trích ly ch a nguyên liệu thời gian này, dung môi ngấm vào nguyên liệu chiết chất hữu ó thể hòa tan vào dung mơi bột hải miên, đến hi dun môi tron th p tr h y vượt đầu ống xi phông tràn bình cầu kéo theo chất chiết r , qu trình ặp lại theo chu trình Các hợp chất rút xuống bình cầu nằm lại hỉ có dung mơi tinh khiết bố để tiếp tục trình chiết - Sau trình chiết kết thúc, bỏ túi giấy lọc tiến hành cất dung môi tron th p để thu hồi dung môi d ch cao chiết - S u hi t h d ch chiết Hải miên, tiến h nh ô qu y hân hôn để đuổi dun môi, đến thể t h dư i m , s u mẫu sấy 60oC - D ch chiết thu đượ đ nh ượn : m ượn vonoid, m ượng protein, m ượng sterol Đ nh i khả năn m ượng phenol, ây độc lên tế bào ung thư K 2.2.2 Khảo sát dung môi chiết đối v - phươn ph p h ết Soxhlet đ xử ý đôn Lấy 10g Hải miên haliclona hô, n hiền thành bột, gói giấy lọc thực chiết máy Soxhlet v i dung môi methanol, ethanol, hexan 60oC 6-9 Thu hồi dung môi d ch cao chiết, tiến hành cô quay mẫu m y ô qu y hân hôn để đuổi dun môi, đến thể t h dư i m , s u mẫu sấy 60o để thu cao chiết, x đ nh khối ượng, hiệu xuất chiết dung môi chiết D ch chiết thu đượ đ nh ượn : ph no , m ượn vonoid, m ượn prot in, m ượng sterol v Đ nh i năn m ượng ây độc lên tế bào ung thư K 2.1.4 Ch ết phân đo n v - dun mô h nh u Hòa tan cao chiết v i dung mơi chiết b n đầu S u , tiến h nh phân đoạn (lắc v i dung môi khác nhiệt độ phòng phiễu chiết), phân đoạn v i dung môi: x n, ut no , ty t t, Nư c v i tỉ lệ d ch cao chiết : dung môi 1:1, nhiệt độ phòng Mẫu o hiết s u hi sấy hơ x M th no ắ phiễu hiết v i t h, thu phân đoạn đượ x n nhiệt độ phòn , tỉ ệ : Đợi x n, qu y x qu y, sấy hơ hò t n v i độ phòn , tỉ ệ : Phân đoạn ty Phân đoạn nư ả đ nh hối ượn đượ hò ại v i dun mơi phân đ nh hối ượn Đối v i phân đoạn m th no m nư ắ phiễu hiết v i ty t t đượ ô qu y sấy hô, x t t , nhiệt đ nh hối ượn tiếp tụ ắ phiễu hiết v i but no , nhiệt độ phòn , tỉ ệ : Thu phân đoạn, ô qu y, sấy hô, x đ nh hối ượn v hò ại v i m th no Tất ả phân đoạn ủ qu trình phân đoạn đượ hò v i ại v i m th no nồn độ hối ượn dự hối ượn x đoạn d h năn m o hiết đượ x n đ nh đượ s u hi sấy hơ S u đó, đ nh: h m ượn prot in, ph no , vonoid, st ro v phân ây độ tế b o un thư Đối v i mẫu hiết từ h x n s u hi thu d h hiết, mẫu đượ m th no tiến h nh phân đoạn v i ty hiết ại v i t t trư , quy trình tươn tự mẫu đượ hiết v i m th no 10 Đ nh ho t tính d h h ết ải miên Haliclona sp m ượn prot n tổng N uyên tắ Phươn ph p n y dự th y đổi bư Coomassie hi hư đại ri nt u hi tạo ph són hấp thu ự đại ủ thuố nhuộm hợp v i prot in Tron dun d h m n t nh ết nối v i prot in thuố nhuộm dạn m u đỏ ó bư 46 nm v id sốn thấp thu ự hi ết hợp v i prot in thuố nhuộm huyển s n dạn m u x nh dươn v hấp thu ự đại m nm ó iên hệ ự đại bư són nm Độ hấp thu bư són h trự tiếp v i nồn độ prot in Bảng 2.1 Đường chuẩn BSA (0-2mg/ml) Nồn độ BSA(µg/ml) BSA (2mg/ml) H2O (µl) 25 125 250 500 750 1000 1500 2000 10 20 20 20 20 20 30 40 20 20 20 20 20 20 200 200 µl BSA nồn độ (mẫu)/ giến ( đ 96 iếng) Thuốc thử Bradford(µl) 200 200 200 200 200 200 Ủ 25oC, 15 phút Phươn ph p thực hiện: - S u hi qu y - Ph - Pha lỗng mẫu v i - 4µl mẫu đ ph o n hoặ - 200µl thuốc thử Bradford/giếng - Ủ nhiệt độ phòng tối( gói giấy bạc) 15 phút phân đoạn, thu m (g) cao chiết phân đoạn mẫu d ch chiết nồn độ theo khối ượng MeOH độ pha loãng 1:10 1:50, v/v hất huẩn ( SA m m ) iến ( đ 96 iến ) 11 - Đo mật độ quang máy UV-vis bư c sóng 595nm m ượn ph no N uyên tắ Phươn ph p o in-Ciocalteu (F- ) đượ đề xuất phươn ph p tiêu huẩn để đ nh ượng tổng Polyphenols chiết xuất thực vật Phươn ph p n y dựa vào phản ng hợp chất phenolic v i thuốc thử Folin-Ciocalteu Thuốc thử folin-ciocalteu hỗn hợp củ n tri vo r m t v n tri mo ybđ t hi ó mặt phenol xảy phản ng oxi hóa-khử, nhóm –OH phenolic chuyển thành nhóm quinol tạo thành ph c hợp có màu xanh ph c tạp đượ đ nh ượng mật độ quang bư c sóng 760 nm [19] Bảng 2 Đường chuẩn Acid Galic (0-0,12mg/ml) Nồn độ Gallic acid (µg/ml) Gallic acid 1mg/ml (µl) H2O (µl) 20 40 60 80 100 120 12 16 20 24 196 192 188 184 180 176 10 µl Galic acid nồn độ ( mẫu)/giến ( đ 96 iếng) Folin – Ciocalteu (1:10) (µl) 50 50 50 50 50 50 40 40 40 40 phút Na2CO3 10% (µl) 40 40 Ủ 25oC, 2h OD760nm Phươn ph p thực hiện: - S u hi ô qu y - Ph - Pha loãng mẫu v i phân đoạn, thu m (g) cao chiết phân đoạn mẫu d ch chiết nồn độ theo khối ượng MeOH độ pha loãng 1:10 1:50, v/v 12 - 10 µl mẫu chất chuẩn (Galic acid 1mg/ml) giến ( đ 96 iếng) - 50 µl thuốc thử Folin – Ciocalteu (pha lỗng 1:10, v/v)/giếng - Sau phút, thêm 4µl Na2CO3 (10% w/v)/giếng - Ủ nhiệt độ phòng tối ( Ủ giấy bạ ) h để phản ng - Đo mật độ quang máy UV-vis bư c sóng 760 nm [19] m ượn vono d N uyên tắ m ượng tổn vonoids đượ x đ nh th o phươn ph p tạo ph c v i nhôm Phươn ph p n y dựa việ nitr t hó vòn thơm ó h a nhóm catechol Sau bổ sung Al(III), dung d ch màu vàng ph c hợp tạo thành, dung d ch chuyển s n m u đỏ sau bổ sung NaOH giá tr hấp thụ đượ đo bư c sóng 510 nm [19] Bảng 2.3 Đường chuẩn Quercetin (0 – 0.1 mg/ml) Nồn độ Quercetin 20 40 60 80 100 Quercetin 1mg/ml (µl) 10 H2O (µl) 98 96 94 92 90 (µg/ml) 20 µl Quercetin nồn độ/ giến (Đ 96 iếng) H2O (µl) 20 20 20 20 20 NaNO2 5% (µl) 6 6 6 phút AlCl3 10% (µl) 6 6 40 40 40 40 40 54 54 54 phút NaOH 1M (µl) 15 phút H2O (µl) 54 54 Ủ 25oC, 15 phút ∆OD 510nm 13 - S u hi ô qu y v - Ph - Pha loãng mẫu v i - Cho 20µl mẫu đ ph o n chất chuẩn (Quercetin 1mg/ml)/giến ( đ phân đoạn d ch chiết, thu m (g) cao chiết chiết phân đoạn mẫu d ch chiết nồn độ theo khối ượng độ pha loãng 1:10 1:50, v/v 96 giếng) - 20 µl nư c cất/giếng - 6µl NaNO2 5%/giếng - Sau phút, thêm vào 6µl AlCl3 10% (pha MeOH)/giếng - Sau phút, thêm vào 40 µl NaOH 1M/giếng - Chờ 15 phút, cho vào 54 µl nư c cất/giếng - Đo mật độ quang máy UV-vis bư c sóng 510nm m ượn steroid N uyên tắ Đ nh Thực phản ng Liebermann-Burchard mẫu sterol tổng mẫu chuẩn cholesterol (Merck): Sterol / CHCl3 + thuốc thử Liebermann-Burchard (Thuốc thử : 1ml Ac2O ,1ml CHCl3 để lạnh 0oC ,thêm vài giọt H2SO4 ) ph c màu xanh lục Mẫu thử d nh chiết hòa tan cloroform cho vào vài giọt thuốc thử đ ph sẳn Đo độ hấp thụ máy quang phổ hấp thụ UV-vis bư c sóng 620 nm, từ t nh toán hàm ượng sterol tổng bằn phươn ph p so s nh: [20] 14 Bảng 3.4 Đường chuẩn Choleslerol (0 – 0,12 mg/ml) Nồn độ Choleslerol (µg/ml) 20 40 60 80 100 120 Choleslerol 1mg/ml (µl) 10 12 MeOH (µl) 98 96 94 92 90 88 µl Choleslerol nồn độ/ giến (đ 96 iếng) 100 µl thuốc thử Liebermann-Burchard Ủ 25oC, phút OD620nm Phươn ph p thực - S u hi ô qu y - Ph phân đoạn, thu m (g) cao chiết phân đoạn mẫu d ch chiết nồn độ theo khối ượng MeOH - Pha loãng mẫu v i độ pha loãng 1:10 1:50, v/v - 4µl mẫu đ ph o n hoặ hất Choleslerol (1mg/ml) iến ( đ 96 iến ) - 100µl thuốc thử Liebermann-Burchard /giếng - Ủ nhiệt độ phòng tối phút - Đo mật độ quang máy UV-vis bư c sóng 620nm 15 .5 Đ nh ho t t nh ây độc lên tế b o Un thư Ni cấy dòng tế bào ung máu K562 -R đơn từ bình nito lỏng Qu n s t dư i kính hiển vi Tế b o un thư Thu hồi vào falcon Ly tâm Đếm tế bào - Đ 96 iếng Thêm 100𝜇𝑙 tế bào/ giếng - Buồn đếm hồng cầu - 104 tế bào - 24h, 37oC , 5% CO2 Ủ Thêm 𝜇𝑙 d ch chiết Ủ X - 72h, 37oC , 5% CO2 đ nh độ sống/ chết - Phươn ph p MTT Hình 2.2 Quy trình đánh giá khả gây độc lên tế bào Ung thư máu K562 16 Thuyết quy trình - Thực khảo s t t độn ây độc d ch chiết hải miên s u hi phân đoạn v i dung mơi dòng tế b o un thư m u K - Các dòng tế b o đượ r đôn từ ống stock tế bào nito lỏn , ủ bể ủ nhiệt 37oC Bổ sung 2- m mơi trường vào falcon có ch a tế b o, s u đ m y tâm loại bỏ d ch - S u tế b o ni cấy bình flask, v i môi trường nuôi cấy RPMI 1640 bổ sung 10 % Fetal Bovine Serum (FBS) 1% kháng sinh Penicillin + St ptomy in (PS), điều kiện nuôi cấy 37oC, 5% CO2 - Sau – ngày tế b o đ bắt đầu tăn sinh, thực qu n s t dư i kính hiển vi ượng mật độ ũn qu n s t tạp nhiễm Sau mật độ tế b o đạt % thực thu hồi tế bào cho việc khảo sát khả năn ây độc d ch chiết hải miên cấy chuyền [21] - Thực huyền ph để tách rời cụm tế bào - Thu hồi dòng tế bào vào ồng falcon Ly tâm 1000rpm, nhiệt độ phòng, phút loại bỏ d ch thu cặn tế bào Bổ sun m môi trường RPMI huyền ph để tách rời tế bào - S u đó, mật độ các dòng tế b o đượ x đ nh buồn đếm hồng cầu thuốc nhuộm trypan blue - Pha lỗng tế bào v i mơi trườn để đạt mật độ tế bào 104 tế bào/ giếng v i thể tích 100 - Ủ vòng 24h, 37oC, 5% CO2 Các tế bào xử lý v i v i nồn độ đ đượ x đ nh s u hi đ khảo sát IC50 - Tế bào sau xử ý ủ khoảng thời i n 4h, 48h, h để x thời gian xử lý thuốc phù hợp - S u năn Phươn ph p đ nh ây độc tế b o đượ đ nh i bằn phươn ph p MTT [21] độ sống chết tế bào : Phươn ph p MTT 17 đ nh Phươn ph p MTT phươn ph p phổ biến d n để đ nh i sống chết tế bào ng tạo màu thuốc thử Nguyên lý củ phươn dựa phản ph p vòn tetrazolium thuốc thử bám chặt vào ti thể tế bào hoạt độn , dư i tác dụng củaenzym dehydrogenase tế bào, màu vàng MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết đượ đọc máy quang phổ, ó độ xác cao [22] Phươn ph p t ến hành : - Ni tron đ 96 iếng Dòng tế b o xử lý d ch chiết - 72h, 37oC, 5%CO2 Thêm 20 𝜇𝑙 MTT 5mg/ml Loại bỏ môi trường Thêm 100 𝜇𝑙 DMSO 100% Đọc kết bư c sóng 540nm Hình 2.3 Quy trình đánh giá khả gây độc tế bào phương pháp MTT Dòng tế b o xử lý v i tron vòn h bổ sun phân đoạn d ch chiết Hải miên haliclona B003 μ dun d ch MTT có nồn độ mg/mL tiếp tục ủ Enzyme dehydrogenase tế bào sống sót chuyển hóa MTT thành tinh thể màu tím formazan khơng b hò t n tron mơi trường ni cấy Formazan hòa tan bằn DMSO v đo độ hấp thu bư c sóng 540 nm Tỷ lệ tế bào sống sót biểu th khả năn ây độc lên tế bào cao chiết Khả năn ây độc cao số ượng tế bào sống sót thấp Tỷ lệ phần trăm tế bào sốn sót đượ x đ nh cách so sánh giá tr đo độ hấp thụ OD540nm giếng thử nghiệm (có xử lý d ch chiết) v i giá tr đo độ hấp thụ giến đối ch ng (không xử lý v i d ch chiết) [23] Tỷ lệ c chế = X 100% 18 IV Dự kiến nội dung luận văn MỞ ĐẦU hươn : Tổng quan 1.1 Gi i thiệu chung Hải miên Đặ điểm cấu tạo sinh lý Đặ điểm sinh sản 1.1.3 Hệ thống phân loại 1.2 Haliclona sp 1.3 Thành phần hoạt tính sinh học Hải miên Haliclona.sp 1.3.1 Các hợp chất terpene 1.3.2 Các hợp chất alkaloid 1.3.3 Các hợp chất có ch a mạch dài 1.3.4 Hoạt tính sinh học loài Hải miên Haliclona sp 1.4 Tình hình nghiên c u tron v n o i nư c Hải miên Haliclona sp hươn vật ệu v phươn ph p vật iệu 2.1.1 phươn ph p hươn ết v b n uận KẾT LUẬN Hải miên vùng biển Việt Nam phon phú, đ dạng, trữ ượng l n ch a hàng loạt hoạt chất sinh học tiềm năn v d ch chiết từ Hải miên biểu khả năn khuẩn, h n un thư Việc nghiên c u, xây dựng quy trình t h sinh họ từ hất ó hoạt t nh ải miên Haliclona sp bằn phươn ph p Soxh t v i dun môi m th no , s u qu y d h hiết, phân đoạn v i h h n dun môi , thu đượ d h hiết ó hất ó hoạt t nh sinh họ V i mon muốn đạt đượ hiệu suất t h hiết 19 % v số phân đoạn thu đượ b o Un thư n dụn v o n hiên hoạt hất ó năn ây độ đặ hiệu ên tế u thuố điều tr un thư từ h i th giá tr , lợi ích tiềm tàng mà Hải miên Haliclon sp mang lại đặc biệt tron v nân o nh vự dược phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO D E Williams, A Steino, N J de Voogd, A G Mauk, R J Andersen, Halicloic acids A and B isolated from the marine sponge Haliclona sp collected in the Philippines inhibit indoleamine 2,3-dioxygenase, J Nat Prod., 2012, 75 (8), 1451-1458 Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Hoang Thanh Huong, Nguyen Xuan Cuong, Pham Quoc Long, Nguyen Hoai Nam, Tap Chi Hoa Hoc, 2005, 43 (4), 499-502 Nguyễn Thi Phươn hi, o n Th nh ươn , hâu Văn Minh, Tap Chi Dươc Hoc, 2005, 345, 10-12 B.S Hwang, J.S Oh, E.J Jeong, C.J Sim, J.R Rho, Densanins A and B, new macrocyclic pyrrole alkaloids isolated from the marine sponge Haliclona densaspicula, Org.Lett., 2012, 14 (24), 6154-6157 H Yamazaki, D.S Wewengkang, S Kanno, M Ishikawa, H Rotinsulu, R.E.Mangindaan, M Namikoshi, Papuamine and haliclonadiamine, obtained from an Indonesian sponge Haliclona sp., inhibited cell proliferation of human cancer cell lines, Nat Prod Res., 2013, 27 (11), 1012-1015 K.H Jang, G.W Kang, J.E Jeon, C Lim, H.S Lee, C.J Sim, K.B Oh, J Shin, Haliclonin A, a new macrocyclic diamide from the sponge Haliclona sp, Org.Lett., 2009, 11 (8), 1713-1716 M.A Rashid, K.R Gustafson, J.L Boswell, M.R Boyd, Haligramides A and B, two new cytotoxic hexapeptides from the marine sponge Haliclona nigra, J Nat Prod., 2000, 63 (7), 956-959 20 G Koren-Goldshlager, Y Kashman, M Schleyer, Haliclorensin, a novel diamino alkaloid from the marine sponge Haliclona tulearensis, J Nat Prod., 1998, 61 (2), 282284 M.A Rashid, K.R Gustafson, M.R Boyd, A new isoquinoline alkaloid from the marine sponge Haliclona species, J Nat Prod., 2001, 64 (9), 1249-1250 10 S Yu, Z Deng, P Proksch, W Lin, Oculatol, oculatolide, and A-nor sterols from the sponge Haliclona oculata, J Nat Prod., 2006, 69 (9), 1330-1334 11 T Hattori, K Adachi, Y Shizuri, New ceramide from marine sponge Haliclona koremella and related compounds as antifouling substances against macroalgae, J.Nat Prod., 1998, 61 (6), 823-826 12 Nguyen Huu Tung, Chau Van Minh, Tran Thu Ha, Phan Van Kiem, Hoang Thanh Huong, Nguyen Tien Dat, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, J.-H Hyun, H.- K Kang, Y.H Kim, C29 sterols with a cyclopropane ring at C-25 and 26 from the Vietnamese marine sponge Ianthella sp and their anticancer properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2009, 19 (16), 4584-4588 13 Nguyen Huu Tung, Chau Van Minh, Phan Van Kiem, Hoang Thanh Huong, Tran Thu Ha, Nguyen Tien Dat, Nguyen Xuan Nhiem, Nguyen Xuan Cuong, J.-H Hyun, H.K Kang, Y.H Kim, A new C29-sterol with a cyclopropane ring at C-25 and 26 from the Vietnamese marine sponge lanthella sp, Archives of Pharmacal Research, 2009, 32, (12), 1695-1698 14 Hoang Le Tuan Anh, Phan Van Kiem, Pham Hai Yen, Chau Van Minh, Dan Thi Thuy Hang, Nguyen Thi Cuc, Durong Thi Hai Yen, Duong Thi Dung, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huru Tai, Tran Hong Quang, Steroids from Vietnamese marine sponge Mycale plumose, Tap Chi Hoa Hoc, 2012, 50 (6), 737-741 15 E.G Lyakhova, S.A Kolesnikova, A.I Kalinovsky, S.S Afiyatullov, S.A Dyshlovoy, V.B Krasokhin, C.V Minh, V.A Stonik, Bromine-containing alkaloids from the marine sponge Penares sp, Tetrahedron Letters, 2012, 53 (45), 6119-6122 16 S.A Kolesnikova, E.G Lyakhova, A.I Kalinovsky, M.A Pushilin, S.S Afiyatullov, E.A Yurchenko, S.A Dyshlovoy, C.V Minh, V.A Stonik, Isolation, Structures, and 21 Biological Activities of Triterpenoids from a Penares sp Marine Sponge, Journal of Natural Products, 2013, 76 (9), 1746-1752 17 Phan Van Kiem, Nguyen Xuan Nhiem, Ngo Van Quang, Chau Van Minh, Nguyen Hoai Nam, Nguyen Thi Cuc, Hoang Le Tuan Anh, Bui Huu Tai, Pham Hai Yen, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Thi Hoai, N.Y Kim, S.J Park, K.S Hyun, New butenolide and pentenolide from Dysidea cinerea, Natural product communications, 2013, (12), 1751-1752 18 Isolation and Structure Elucidation of Bioactive Secondary Metabolites from Indonesian Marine Sponges, 29-31 19 A Pę : K Pyrzyns , D p rtm nt o h mistry, Univ rsity o W rs w, v u tion of Aluminium Complexation Reaction for Flavonoid Content Assay 20 Wall, M E and Kelley, E G., Determination and nature of leaf sterols, Anal Chem 19: (1990), 677-683 21 ATCC ANIMAL CELL CULTURE GUDE.: Globally Delivered 22 Terry L Riss, PhD, Richard A Moravec, BS, Andrew L Niles, MS, Sarah Duellman, PhD, Hélène A Benink, PhD, Tracy J Worzella, MS, and Lisa Minor., "Cell Viability Assays," 2013 23 Vandana Patravale, Prajakta Dandekar ,Ratnesh Jain, - Nanotoxicology: evaluating toxicity potential of drug-nanoparticles., 2014 22 ... Hải miên Haliclona sp nói riêng - Đón óp thêm sở khoa học điều kiện tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học từ Hải miên Haliclona sp hoạt t nh h n un thư Hải miên Haliclona sp - Góp phần khuyến... chất sesquiterpene m i từ loài hải miên Dysidea cinerea [16,17] II Phươn pháp nghiên c u 2.1 Sơ đồ nghiên c u chung Quy trình tách chiết hoạt chất sinh học từ hải miên Haliclona sp [18] Hải miên. .. Các hợp chất alkaloid 1.3.3 Các hợp chất có ch a mạch dài 1.3.4 Hoạt tính sinh học loài Hải miên Haliclona sp 1.4 Tình hình nghiên c u tron v n o i nư c Hải miên Haliclona