Thu nhận enzyme cellulase thô từ chủng Bacillus spp. trong tự nhiên

Thu nhận enzyme cellulase thô từ chủng Bacillus spp. trong tự nhiên Mạch Trần Phương Thảo 1. Đặt vấn đề Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulose có vai trò quan trọng trong đời sống tự nhiên. Và hiện nay nhu cầu sử dụng enzyme này rất phổ biến trong đời sống hiện đại. Cellulase thường được sinh tổng hợp từ nấm, vi khuẩn, thực vật và động vật nhưng trong ứng dụng thường sử dụng nguồn gốc từ vi sinh. Hệ enzyme từ nấm gồm có endoglucanese (hoặc CMCase), exoglucanases (cellobiohydrolase) và β-glucosidases (hoặc cellobiases) đóng vai trò trong việc thủy phân hoàn toàn cellulose. Loài nấm được ứng dụng để sinh cellulase như Trichoderma viride, Aspergillus spp Đối với hệ enzyme trong vi khuẩn thường thấy ở vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas và Actinomyces, kị khí thường thấy ở Bacillus và Cellulomonas, đặc biệt là loài Clostridium.Hầu hết các chủng đều sinh endoglucanases. Cellulase được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm như chế biến cà phê. Nó sẽ thủy phân cellulose trong quá trình tách vỏ cà phê. Ngoài ra, cellulase còn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp vải sợi, sản xuất giấy hay ứng dụng trong dược phẩm. Hiện nay, nó còn được quan tâm rộng rãi hơn trong lên men sản xuất nhiên liệu sạch thay thế cho xăng dầu hiện nay. 2. Phương pháp và nguyên liệu Chuẩn bị môi trường Môi trường nuôi vi khuẩn Bacillus spp.: NA 2g Nước 100ml pH=6,8 Môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase Pepton 1g CMC 1g Nước 100ml pH=6,8 2.1 Chuẩn bị mẫu Vi khuẩn được chọn lọc từ nguồn tự nhiên trong cơm nấu để qua 24h ở nhiệt độ phòng. Trước khi đi cấy chọn vi khuẩn, mẫu được đun cách thủy ở nhiệt độ 100 o C trong 15 phút nhằm tiêu diệt các loại vi khuẩn sinh dưỡng. Baccilus spp. là chủng vi khuẩn có khả năng sinh bào tử và chịu được nhiệt độ cao nên với phương pháp trên sẽ hạn chế bớt các vi khuẩn không mong muốn. 2.2 Phân lập vi khuẩn Chuẩn bị môi trường thạch dinh dưỡng NA (Nutritional agar) để cấy khuẩn. Các đĩa peptri, ống nghiệm được sấy khử trùng ở nhiệt độ 160 o C trong 2 giờ. Môi trường được hòa tan theo định mức 2g NA pha với 100ml nước cất và hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 o C trong 15 phút. Vi khuẩn được cấy ria nhằm phân lập khuẩn lạc theo đúng phương pháp nhằm tránh để bị nhiễm. Các đĩa peptri cấy khuẩn được ủ trong 37 o C với thời gian 24h để khuẩn lạc phát triển. Vi khuẩn được phân lập sẽ đem đi kiểm tra hình thái nhằm xác định có phải là chủng Baccilus spp. hay không. Thí nghiệm sử dụng phương pháp nhuộm gram sau đó soi kính hiển vi điện tử. 2.3 Giữ chủng Sử dụng môi trường thạch dinh dưỡng NA (Nutritional agar) pha với tỉ lệ 2g NA trong 100ml nước cất. Môi trường được hấp khử trùng trong 121 o C trong 30 phút sau đó cho vào từng ống nghiệm 5ml thạch. Ống nghiệm được đặt nghiêng 30 o và để nguội. Sau đó cấy chuyền vi khuẩn vào ống nghiệm và bảo quản ở nhiệt độ 4 o rồi cách 1 tháng cấy chuyền tiếp tục một lần nhằm giữ giống. 2.4 Nuôi tăng sinh Chuẩn bị môi trường để cấy vi khuẩn sinh enzyme như trên. Đối với CMC cần hòa tan trong nước nóng 70 o C trước khi hòa chung các chất khác. Hấp môi trường ở nhiệt độ 121 o C trong 30 phút. Sau đó cho ống nghiệm chứa vi khuẩn vào và tiếp tục nuôi cấy trên máy lắc trong thời gian 2ngày. Để thu nhận enzyme cellulase thô thì đưa dịch đi ly tâm lạnh với tốc độ 3500 vòng/phút trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 4 o C, gạn kết tủa thu dịch lọc đem đi xác định hoạt độ. 2.5 Đo hiệu quả thủy phân của enzyme Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa thạch peptri với phương pháp đục lỗ thạch và chấm điểm khuẩn trên bề mặt. Sau đó tiến hành đo vòng phân giải và so sánh, lựa chọn chủng vi khuẩn sinh enzyme cellulase tốt nhất. 3 Kết quả và đề xuất Hình Vi khuẩn Bacillus spp. Hình Cấy ria vi khuẩn trên đĩa peptri Hình Giữ chủng trên thạch nghiêng Hình Tuyển chọn chủng thu nhận enzyme cellulase Hình Tuyển chọn chủng theo phương pháp đục lỗ thạch Kết quả quá trình định lượng đường khử so với mẫu chứng không bổ sung enzyme là 0,4ml KMnO 4 , mẫu thử là 2,4ml, chênh lệch là 2ml. Tra bảng quy đổi đường khử đạt 1,8mg Glucose cho thấy dấu hiệu khả quan khi sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Bacillus spp. Qua quá trình thử nghiệm thì có thể thấy kết quả khả quan khi vi sinh vật sinh enzyme cellulase. Tuy nhiên thí nghiệm khảo sát còn hạn chế về thời gian nên đề xuất thêm các phương pháp tối ưu để sinh enzyme có hoạt tính cao hơn. -Sử dụng nhiều nguồn thu nhận Bacillus spp. để lựa chọn được chủng nào sinh enzyme mạnh hơn. -Tối ưu hóa môi trường sinh enzyme, bổ sung các chất khoáng vi lượng, đa thành phần. Có thể lựa chọn môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn để thử nghiệm. -Kiểm tra hoạt tính enzyme cellulase trên đĩa thạch bằng phương pháp đổ dung dịch Lugon trên bề mặt nhằm so sánh vòng tròn thủy phân cơ chất. -Sử dụng phương pháp Miller đo lượng đường khử để suy ra hoạt độ enzyme nhằm đưa kết quả chính xác hơn phương pháp Bertran. -Thực hiện các thí nghiệm khảo sát các tính chất của enzyme như yếu tố nhiệt độ tối ưu,tính bền nhiệt, pH tối ưu, ion kìm hãm, chất hoạt hóa… . Thu nhận enzyme cellulase thô từ chủng Bacillus spp. trong tự nhiên Mạch Trần Phương Thảo 1. Đặt vấn đề Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulose có vai trò quan trọng trong. sinh enzyme cellulase tốt nhất. 3 Kết quả và đề xuất Hình Vi khuẩn Bacillus spp. Hình Cấy ria vi khuẩn trên đĩa peptri Hình Giữ chủng trên thạch nghiêng Hình Tuyển chọn chủng thu nhận enzyme cellulase Hình. trên máy lắc trong thời gian 2ngày. Để thu nhận enzyme cellulase thô thì đưa dịch đi ly tâm lạnh với tốc độ 3500 vòng/phút trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 4 o C, gạn kết tủa thu dịch lọc