Lipase thu nhận từ thực vật có rất nhiều tính năng nổi bật và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Trong đó chúng được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu xúc tác cho các phản ứng thủy phân và tổng hợp chất béo Trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ bằng các phương pháp khác nhau Kết quả cho thấy hoạt lực của chế phẩm enzyme lipase thu nhận từ mủ đu đủ ở phương pháp sấy thăng hoa cho cả giai đoạn sấy mủ trước và sau khi hòa tan là cao vượt trội so với các phương pháp khác Do đó sử dụng phương pháp này để thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ và để nghiên cứu cho quá trình thủy phân dầu cá hồi Kết quả xác định các chỉ tiêu chất lượng cho thấy dầu cá hồi thu được đảm bảo yêu cầu chất lượng để sử dụng Kết quả phân tích thành phần dầu cá hồi trước và sau khi thủy phân cho thấy tỉ lệ các thành phần axit béo không thay đổi lớn nên có thể kết luận enzyme lipase thu nhận từ mủ đu đủ không có tính đặc hiệu với các axit béo mạch dài phổ biến trong dầu cá Điều kiện tối ưu về nhiệt độ và pH tỉ lệ lượng nước cơ chất và nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme lipase từ mủ đu đủ đã được xác định bằng quy hoạch thực nghiệm Kết quả đã tìm được nhiệt độ pH tối ưu cho quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme lipase từ mủ đu đủ là nhiệt độ 29oC và pH 7 6 lượng nước cơ chất và nồng độ enzyme tối ưu cho quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme lipase từ mủ đu đủ là ở tỉ lệ nước cơ chất là 4 36 1 và nồng độ enzyme là 1 34 Thời gian thủy phân đạt hiệu suất thủy phân cao đồng thời đạt hiệu quả về kinh tế là trong vòng 48h Nghiên cứu này sẽ là tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng lipase từ mủ đu đủ để làm giàu DHA EPA trong dầu cá hồi phục vụ cho ngành sản xuất thực phẩm chức năng
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME LIPASE THƠ TỪ MỦ ĐU ĐỦ VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ LÀM GIÀU DHA VÀ EPA TỪ DẦU CÁ HỒI Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Sương Số thẻ sinh viên: 107140145 Lớp: 14H2B Đà Nẵng – Năm 2019 TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Sương Số thẻ sinh viên: 107140145 Lớp: 14H2B Lipase thu nhận từ thực vật có nhiều tính bật ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Trong đó, chúng ứng dụng nhiều nghiên cứu xúc tác cho phản ứng thủy phân tổng hợp chất béo Trong nghiên cứu tiến hành nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ phương pháp khác Kết cho thấy hoạt lực chế phẩm enzyme lipase thu nhận từ mủ đu đủ phương pháp sấy thăng hoa cho giai đoạn sấy mủ trước sau hòa tan cao vượt trội so với phương pháp khác Do đó, sử dụng phương pháp để thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ để nghiên cứu cho trình thủy phân dầu cá hồi Kết xác định tiêu chất lượng cho thấy dầu cá hồi thu đảm bảo yêu cầu chất lượng để sử dụng Kết phân tích thành phần dầu cá hồi trước sau thủy phân cho thấy tỉ lệ thành phần axit béo không thay đổi lớn nên kết luận enzyme lipase thu nhận từ mủ đu đủ khơng có tính đặc hiệu với axit béo mạch dài phổ biến dầu cá Điều kiện tối ưu nhiệt độ pH, tỉ lệ lượng nước/cơ chất nồng độ enzyme đến trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định quy hoạch thực nghiệm Kết tìm nhiệt độ, pH tối ưu cho trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ nhiệt độ 29oC pH=7,6, lượng nước/cơ chất nồng độ enzyme tối ưu cho trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ tỉ lệ nước/cơ chất 4,36:1 nồng độ enzyme 1,34% Thời gian thủy phân đạt hiệu suất thủy phân cao đồng thời đạt hiệu kinh tế vòng 48h Nghiên cứu tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng trình thủy phân dầu cá hồi lipase từ mủ đu đủ để làm giàu DHA, EPA dầu cá hồi phục vụ cho ngành sản xuất thực phẩm chức ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: BÙI THỊ SƯƠNG Lớp: 14H2B Khoa: Hóa Số thẻ sinh viên: 107140145 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Tên đề tài đồ án: “Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi” Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Các số liệu liệu ban đầu: Nội dung phần thuyết minh tính tốn: - Lời mở đầu - Chương 1: Tổng quan - Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận - Chương 4: Kết luận kiến nghị - Tài liệu tham khảo - Phụ lục Các vẽ: Không Họ tên người hướng dẫn: PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà Ngày giao nhiệm vụ : 02/02/2019 Ngày hoàn thành nhiệm vụ : 30/05/2019 Thông qua môn Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019 TRƯỞNG BỘ MÔN (Ký, ghi rõ họ tên) PGS.TS Đặng Minh Nhật Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019 NGƯỜI HƯỚNG DẪN (Ký, ghi rõ họ tên) PGS.TS Đặng Minh Nhật LỜI CẢM ƠN Sau tháng nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi.”, hướng dẫn tận tình thầy Đặng Minh Nhật, với giúp đỡ cô Phan Thị Việt Hà, thầy cô môn bạn sinh viên phịng thí nghiệm, em hồn thành đồ án tốt nghiệp Trước hết cho phép em bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến thầy Đặng Minh Nhật, thầy giúp đỡ em từ việc chọn đề tài hoàn thành đồ án tốt nghiệp Trong suốt thời gian em thực đồ án, thầy ln định hướng, góp ý sửa chữa chỗ sai, để từ giúp em nắm bắt kĩ lưỡng, chi tiết nội dung, vấn đề liên quan đến đồ án, hoàn thành đồ án cách tốt Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến cô Phan Thị Việt Hà, cô hướng dẫn, hỗ trợ động viên em, tạo điều kiện tốt để em hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Nhờ cô mà em tiếp xúc với môi trường thực hành trang thiết bị đại trường Đại học Duy Tân Cô nhắc nhở góp ý lúc giúp em tích lũy thêm nhiều kinh nghiệm cho thân Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn Công nghệ Thực phẩmSinh học, thầy phịng thí nghiệm tất bạn bè, người thân giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi, khích lệ động viên em suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Cuối cho em xin cảm ơn thầy cô hội đồng bảo vệ tốt nghiệp dành thời gian quý báu để đọc nhận xét cho đồ án em i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp thành từ nghiên cứu hoàn toàn thực tế sở số liệu thực tế thực theo hướng dẫn giáo viên hướng dẫn Đồ án thực hoàn toàn thành riêng tôi, không chép theo đồ án tương tự Mọi tham khảo sử dụng đồ án trích dẫn nguồn tài liệu báo cáo danh mục tài liệu tham khảo Mọi chép không hợp lệ, vi phạm quy chế nhà trường, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Sinh viên thực Bùi Thị Sương ii MỤC LỤC TÓM TẮT NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii LỜI MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đu đủ 1.1.1 Nguồn gốc phân bố 1.1.2 Hình thái sinh lý đu đủ 1.1.3 Giá trị dinh dưỡng, ý nghĩa kinh tế đặc tính dược lý đu đủ 1.1.4 Mủ đu đủ 1.2 Tổng quan enzyme lipase 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Nguồn gốc 1.2.3 Cấu tạo lipase 1.2.4 Cơ chế xúc tác enzyme lipase 1.2.5 Một số phản ứng đặc trưng 10 1.2.6 Tình hình nghiên cứu nước lipase 11 1.3 Tổng quan cá hồi 12 1.3.1 Hình thái 13 1.3.2 Thành phần dinh dưỡng cá hồi 14 1.3.3 Phân bố 15 1.3.4 Tình hình khai thác, chế biến xuất cá hồi giới 15 1.4 Quy trình làm giàu DHA EPA phương pháp thủy phân xúc tác enzyme lipase 16 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng, hóa chất thiết bị nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Dụng cụ, hóa chất thiết bị sử dụng 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ 22 2.2.2.Phương pháp xác định hiệu suất thu hồi chế phẩm enzyme lipase thô 24 2.2.3.Phương pháp đo quang 25 iii 2.2.6 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác enzyme lipase thô từ mủ đu đủ 30 2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân 30 2.2.8 Phương pháp đánh giá chất lượng dầu cá hồi 30 2.2.9 Phương pháp xử lý số liệu 30 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô 31 3.1.1 Kết thu nhận chế phẩm lipase thô theo phương pháp sấy kết thúc 31 3.1.2 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp sấy khô mủ đu đủ tươi 31 3.2 Ứng dụng chế phẩm lipase thô để thủy phân dầu cá hồi 34 3.2.1 Kết đánh giá tiêu chất lượng dầu cá hồi 34 3.2.2 Thành phần axit béo dầu cá hồi trước sau thuỷ phân enzyme lipase thô từ mủ đu đủ 35 3.2.3 Tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzym lipase từ mủ đu đủ 41 3.2.4 Kết ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân 46 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 52 iv DANH SÁCH CÁC BẢNG, HÌNH VẼ Danh sách bảng Bảng 1 Sản lượng đu đủ theo vùng địa lý Bảng Đặc điểm loại cá hồi 13 Bảng Thành phần dinh dưỡng cá hồi 100g 15 Bảng Dụng cụ, hóa chất 21 Bảng 2 Khoảng biến thiên yếu tố thực nghiệm 27 Bảng Ma trận quy hoạch thực nghiệm 28 Bảng Khoảng biến thiên yếu tố thực nghiệm 29 Bảng Ma trận quy hoạch thực nghiệm 29 Bảng 3.1 So sánh hiệu suất thu nhận hoạt lực chế phẩm lipase thô phương pháp sấy khác 31 Bảng 3.2 So sánh hiệu suất thu nhận hoạt lực chế phẩm lipase thô phương pháp thu nhận khác 32 Bảng 3.3 Các tiêu chất lượng dầu cá 35 Bảng 3.4: Phần trăm axit béo có dầu cá hồi trước sau thủy phân 40 Bảng 3.5 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm 41 Bảng 3.6 Giá trị hệ số b phương trình hồi quy, kiểm định T xác suất p tương ứng 41 Bảng 3.7: Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm 44 Bảng Giá trị hệ số b phương trình hồi quy, kiểm định T xác suất p 44 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân Error! Bookmark not defined Danh sách hình vẽ Hình 1.1 Hình ảnh đu đủ Hình 1.2 Cấu trúc không gian lipase từ Candida rugosa [ Hình 1.3 Mơ hình chế xúc tác lipase bề mặt tiếp xúc hai pha dầu–nước Hình 1.4 Sự hoạt hóa enzyme Hình 1.5 Hình thành phức hợp enzyme - chất 10 Hình 1.6 Phản ứng thủy phân 10 Hình 1.7 Phản ứng este hóa 10 Hình 1.8 Phản ứng trao đổi ester 11 Hình 1.9 Phản ứng chuyển ester 11 Hình 1.10 Cá hồi (Salmon/Oncorhynchus spp) 12 v Hình 1.11 Sản lượng cá hồi Đại Tây Dương năm 2005 – 2020 (dự báo) (Nguồn: Rabobank, Uncommtrade, Eurostat, 2015) Error! Bookmark not defined Hình 1.12 Sơ đồ quy trình làm giàu DHA EPA 17 Hình 2.1 Vườn thu nhận mủ đu đủ 18 Hình 2.2 Lườn cá hồi thu mua Cơng ty TNHH chế biến thực phẩm D&N 19 Hình 2.3 Sơ đồ thu nhận dầu cá hồi 20 Hình 2.4 Máy lắc 21 Hình 2.5 Máy đo pH 21 Hình 2.6 Máy ly tâm 22 Hình 2.7 cân phân tích số 22 Hình 2.8 Máy đo quang 22 Hình 2.9 Cân kỹ thuật điện tử 22 Hình 2.10 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase thô theo phương pháp sấy khác giai đoạn kết thúc 23 Hình 2.11 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase thô theo phương pháp sấy mủ khác 24 Hình 2.12 Sơ đồ quy trình phân đoạn dầu cá hồi sau thủy phân enzym lipase từ mủ đu đủ 26 Hình 3.1 Hình ảnh mủ đu đủ khơ sau sấy theo phương pháp 32 Hình 3.2 Biểu đồ so sánh hoạt lực chế phẩm liapse thô từ phương pháp thu nhận khác 33 Hình 3.3 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase thô 34 Hình 3.4 Dầu cá hồi thu từ lườn cá hồi 34 Hình 3.5 Kết đo sắc ký khí mẫu dầu cá hồi ban đầu 36 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu dầu cá ban đầu 37 Hình 3.7 Kết sau đo sắc kí khí phân đoạn dầu khơng bị thủy phân 38 Hình 3.8 Sắc ký đồ phân đoạn dầu không bị thuỷ phân 39 Hình 3.9 Biểu đồ đường mức (contour plot) biểu thị ảnh hưởng nhiệt độ, pH đến hiệu suất thủy phân 42 Hình 3.10 Biểu đồ bề mặt biểu thị ảnh hưởng nhiệt độ, pH đến hiệu suất thủy phân 42 Hình 3.11 Biểu thị điểm tối ưu sau phân tích 43 Hình 3.12 Biểu đồ đường mức (contour plot) biểu thị ảnh hưởng lượng nước/ chất nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân 45 Hình 3.13 Biểu đồ bề mặt( surface plot) biểu thị ảnh hưởng lượng nước/ chất nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân 45 Hình 3.14 Biểu thị điểm tối ưu sau phân tích 46 Hình 3.15 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân 46 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT DHA: Docosahexaenoic acid EPA: Eicosapentaenoic acid PUFA: Polyunsaturated fatty acid (axit béo khơng bão hịa nhiều nối đôi) TAG: Triacylglycerol FFA: Free Fatty acid (axit béo tự do) p-NPP: p-nitrophenyl palmitate p-NP: p-Nitrophenol vii Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Hình 3.8 Sắc ký đồ phân đoạn dầu không bị thuỷ phân Từ kết thu được, xác định tỷ lệ phần trăm khối lượng axit béo dạng methyl ester có mẫu dầu cá hồi ban đầu phân đoạn dầu cá không bị thuỷ phân lipase mủ đu đủ sau: SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 39 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Bảng 3.4: Phần trăm axit béo có dầu cá hồi trước sau thủy phân Axit béo methyl ester STT % % phân đoạn mẫu ban đầu dầu không thuỷ phân Myristic acid methyl ester 3,23 2,64 C16:0 Palmitic acid ester 12,17 10,59 C16:1 Palmitoleic acid methyl ester 3,22 2,96 C18:0 Stearic acid methyl ester 2,99 2,9 C18:1 Oleic acid methyl ester 40,89 40,93 C18:2 Linoleic acid methyl ester 16,78 15,96 C20:0 Arachidic acid methyl ester 0,36 C18:3 Linolenic acid methyl ester 6,08 5,83 C20:1 cis-11-Eicosenoic acid methyl ester 0,99 2,59 10 C20:2 cis-11,14-Eicosadienoic acid methyl ester 2,52 0,95 11 C20:5 5,1 4,97 5,66 7,73 Kí hiệu Tên thông thường C14:0 cis-5,8,11,14,17-Eicosanpentaenoic acid methyl ester (EPA) Cis-4,7,10,13,16,19- 12 C22:6 Docosanpentaenoic acid methyl ester (DHA) 13 C20:3 cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid methyl ester 0,25 14 C20:3 cis-11,14,17-Eicosatrienoic acid methyl ester 0,83 15 C22:1 Erucic acid methyl ester 0,32 16 C20:4 Arachidonic acid methyl ester 0,56 Kết bảng cho thấy tỷ lệ axit béo có dầu khơng có thay đổi lớn Axit béo chủ yếu có dầu oleic, theo sau axit linoleic palmitic Có giảm nhẹ tỷ lệ axit béo no myristic, palmitic stearic, bên cạnh tăng nhẹ phần trăm axit béo eicosenoic, erucic arachidonic Riêng với axit béo quan trọng nghiên cứu DHA EPA có thay đổi khác Trong thành phần EPA thay đổi, DHA có tăng nhẹ Tổng phần trăm axit béo dầu ban đầu 10,8 % sau thuỷ phân 12,7% SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 40 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Từ đó, ta kết luận enzyme lipase từ mủ đu đủ khơng có tính đặc hiệu rõ rệt với axit béo Dường có ưu tiên thuỷ phân EPA số axit béo không no khác, axit béo no ưu tiên thuỷ phân 3.2.3 Tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzym lipase từ mủ đu đủ 3.2.3.1 Tối ưu hóa nhiệt độ pH trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ Tham khảo kết nghiên cứu trước, chọn khảo sát nhiệt độ khoảng 28-42oC pH từ 6,6 đến 9,4 Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay Box-Hunter mô tả mục 2.2.5.1, thu kết Bảng 3.5 Bảng 3.5 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm Số thí Yếu tố thí nghiệm Yếu tố thí nghiệm hệ tọa độ khơng thứ ngun nghiệm Hiệu suất (%) X1 X2 X1 X2 Y 40 +1 +1 25,835 30 -1 +1 35,035 40 +1 -1 32,860 30 -1 -1 38,930 42 +α 32,160 28 -α 37,675 35 9,4 +α 24,860 35 6,6 -α 36,690 T1 35 0 36,895 T2 35 0 37,800 Bảng 3.6 Giá trị hệ số b phương trình hồi quy, kiểm định T xác suất p tương ứng Hệ số Giá trị Sai số chuẩn Kiểm định T Xác suất p bo -221,46 1,2207 30,59 0,000* b1 3,84 0,8589 -4,732 0,009* b2 53,92 0,8589 -5,656 0,005* b12 -0,16 1,6921 -1,383 0,416 b11 -0,06 1,6032 -3,967 0,239 b22 - 3,24 1,6032 -0,906 0,017* (*) nhân tố có ý nghĩa (p < 0,05) SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 41 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Xử lý số liệu đo hàm Y bảng phần mềm Minitab 16.0 để kiểm tra tính có nghĩa hệ số phương trình hồi quy theo chuẩn Student, mức độ tin cậy hệ số phương trình hồi qui đánh giá qua giá trị p với mức độ tin cậy 95%, thu kết bảng 3.6 Các hệ số xác định là: b0 =-221,46; b1 = 3,84; b2 = 53,92; b12 = -0,16; b11= -0,06; b22 = -3,24 Bảng 3.6 cho thấy có hệ số b0, b1, b2, b22 có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Các hệ số cịn lại b11, b12 khơng tác động đến giá trị hàm mục tiêu (p>0,05) Loại bỏ hệ số khơng có nghĩa thu phương trình hồi quy thể ảnh hưởng yếu tố đến mục tiêu sau: Y = -221,46 + 3,84X1 + 53,92X2 – 3,24X22 Tiếp tục đánh giá tính phù hợp phương trình hồi quy dựa xác suất p thu mức độ phù hợp với mơ hình thí nghiệm phép kiểm định Test of Lack of Fit Kết thu p=0,235 lớn nhiều so với mức ý nghĩa (0,05) cho thấy phương trình hồi quy tương thích với thực tế, khẳng định đắn mơ hình với ý nghĩa thống kê cao Hệ số tương quan mô hình hồi quy R2 = 94,67% cao cho thấy tính chặt chẽ mơ hình tương quan Do đó, phương trình hồi quy sử dụng để tìm điểm tối ưu Biểu đồ đường mức biểu đồ bề mặt phương trình hồi quy thể hình 3.9 3.10 Hình 3.9 Biểu đồ đường mức (contour plot) biểu thị ảnh hưởng nhiệt độ, pH đến hiệu suất thủy phân SVTH: Bùi Thị Sương Hình 3.10 Biểu đồ bề mặt (surface plot) biểu thị ảnh hưởng nhiệt độ, pH đến hiệu suất thủy phân GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 42 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Từ biểu đồ đường mức cho thấy vùng có hiệu suất thủy phân cao nằm khoảng pH (6,6-8), nhiệt độ (28-35oC) Nhưng để xác định xác điểm tối ưu, ta sử dụng cơng cụ tìm điểm tối ưu phần mềm minitab Sau xử lí có kết Hình 3.11 Biểu thị điểm tối ưu sau phân tích Sau tối ưu hóa điều kiện thủy phân ta thu nhiệt độ tối ưu 29oC pH tối ưu 7,6 3.2.3.2 Kết tối ưu yếu tố lượng nước/cơ chất nồng độ enzyme đến hiệu suất trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ Tham khảo kết nghiên cứu trước, chọn khảo lượng enzyme/cơ chất khoảng 2,6-5,4 nồng độ enzyme khoảng 0,29-1,71%, kết hợp với kết thu sau tối ưu yếu tố nhiệt độ pH đến hiệu suất trình thủy phân dầu cá hồi xúc tác enzyme lipase từ mủ đu đủ mục 3.2.3.1 Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay Box-Hunter mô tả mục 2.2.5.2, thu kết Bảng 3.7 SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 43 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Bảng 3.7 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm Số thí Yếu tố thí nghiệm Yếu tố thí nghiệm hệ tọa độ khơng thứ ngun nghiệm Hiệu suất (%) X1 X2 X1 X2 Y 1,5 +1 +1 46,4 1,5 -1 +1 39,01 0,5 +1 -1 44,02 0,5 -1 -1 24,80 5,4 +α 40,00 2,6 -α 24,03 1,71 +α 48,01 0,29 -α 24,54 T1 0 46,71 T2 0 45,73 Xử lý số liệu đo hàm Y bảng phần mềm Minitab 16.0 để kiểm tra tính có nghĩa hệ số phương trình hồi quy theo chuẩn Student, mức độ tin cậy hệ số phương trình hồi qui đánh giá qua giá trị p với mức độ tin cậy 95%, thu kết sau: Bảng 3.8 Giá trị hệ số b phương trình hồi quy, kiểm định T xác suất p Hệ số Giá trị Sai số chuẩn Kiểm định T Xác suất p bo 46,20 3,087 14,968 0,000* b1 6,15 1,543 3,987 0,016* b2 6,22 1,543 4,036 0,016* b12 -2,95 2,183 -1,352 0,0248 b11 -5,99 2,042 -2,936 0,043* b22 -3,87 2,042 -1,895 0,131 (*) nhân tố có ý nghĩa (p < 0,05) Các hệ số xác định là: b0 = 46,20; b1 = 6,15; b2 = 6,22; b12 = -3,87; b11= -2,95; b22 = -5,99 Bảng 3.8 cho thấy có hệ số b0, b1, b2, b11 có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Các hệ số cịn lại b12, b22 khơng tác động đến giá trị hàm mục tiêu (p>0,05) Loại bỏ hệ số khơng có nghĩa thu phương trình hồi quy thể ảnh hưởng yếu tố đến mục tiêu sau: SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 44 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Y = 46,20 + 6,15X1 + 6,22X2 – 5,99X12 Tiếp tục đánh giá tính phù hợp phương trình hồi quy dựa xác suất p thu mức độ phù hợp với mơ hình thí nghiệm phép kiểm định Test of Lack of Fit Kết thu p=0,103 lớn nhiều so với mức ý nghĩa ( 0,05) cho thấy phương trình hồi quy tương thích với thực tế, khẳng định đắn mơ hình với ý nghĩa thống kê cao Hệ số tương quan mơ hình hồi quy R2 = 91,51% cao cho thấy tính chặt chẽ mơ hình tương quan Do đó, phương trình hồi quy sử dụng để tìm điểm tối ưu Biểu đồ đường mức biểu đồ bề mặt phương trình hồi quy thể hình 3.12 3.13 Hình 3.12 Biểu đồ đường mức (contour plot) biểu thị ảnh hưởng lượng nước/cơ chất nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân Hình 3.13 Biểu đồ bề mặt( surface plot) biểu thị ảnh hưởng lượng nước/cơ chất nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân Từ biểu đồ đường mức cho thấy tỉ lệ nước/cơ chất nồng độ enzyme ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thủy phân Vùng có hiệu suất thủy phân cao tỉ lệ nước/cơ chất 0,5-1, nồng độ enzyme (0,5-1) Nhưng để xác định xác điểm tối ưu, ta sử dụng cơng cụ tìm điểm tối ưu phần mềm minitab Sau xử lí có kết SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 45 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Hình 3.14 Biểu thị điểm tối ưu sau phân tích Sau tối ưu hóa điều kiện thủy phân ta thu lượng nước/ chất tối ưu 4,36 nồng độ enzyme nước tối ưu 1,34% 3.2.4 Kết ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân 60 e Hiệu suất (%) 50 d c b a 120 168 f 40 30 20 10 g 0 24 48 72 96 Thời gian (giờ) Hình 3.15 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân Ghi chú: Các giá trị đánh dấu chữ giống khác khơng có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05) Đồ thị cho thấy hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác enzyme lipase từ mủ đủ tăng dần theo thời gian SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 46 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Hiệu suất tăng nhanh 48h đầu đạt hiệu suất lên đến 49,84% Sau thời gian hiệu suất tăng chậm, khả vài lí sau: - Enzyme lipase từ mủ đu đủ khơng đặc hiệu với loại axit béo (đã chứng - minh mục 3.2.2) Sau thủy phân đạt hiệu suất 50% lượng axit béo sinh nhiều có xu hướng kết hợp với nhau, xảy phản ứng thuận nghịch Do đó, để trình thủy phân đạt hiệu kinh tế cao không ảnh hưởng đến chất lượng thành phẩm nên đề nghị thủy phân thời gian 48 SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 47 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua q trình nghiên cứu, chúng tơi thu số kết sau: ➢ Xác định hoạt lực chế phẩm ezyme lipase thu nhận từ mủ đu đủ phương pháp sấy thăng hoa cao vượt trội so với phương pháp khác Do đó, phương pháp sấy thăng hoa dùng để thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ để nghiên cứu cho trình thủy phân dầu cá hồi ➢ Enzyme lipase thu nhận từ mủ đu đủ có khả thủy phân tốt dầu cá hồi, nhiên enzyme khơng có tính đặc hiệu rõ rệt với loại axit béo, tương tự enzyme lipase Cadida rugosa từ vi sinh vật ➢ Đã xác định nhiệt độ, pH tối ưu cho trình thủy phân dầu cá hồi lipase từ mủ đu đủ, nhiệt độ 29oC pH=7,6 ➢ Đã xác định tỉ lệ lượng nước/cơ chất nồng độ enzyme tối ưu cho trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ, tỉ lệ nước / chất 4,36:1 nồng độ enzyme 1,34% ➢ Đã xác định thời gian thủy phân cho hiệu suất thủy phân cao đồng thời hiệu kinh tế 48 giờ, tương ứng với hiệu suất thủy phân đạt 49,84% 4.2 Kiến nghị Qua q trình nghiên cứu cho phép tơi đề xuất số ý kiến việc nghiên cứu tiếp tục sau: - Xây dựng quy trình làm giàu DHA EPA dầu cá hồi phương pháp thủy phân xúc tác enzyme lipase từ mủ đu đủ - So sánh hiệu suất làm giàu phương pháp thủy phân dầu cá xúc tác enzyme lipase từ mủ đu đủ chất xúc tác khác SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 48 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo nước [1] Đặng Minh Nhật, Phan Thị Việt Hà, Trần Thị Bích Hà (2016), Nghiên cứu chiết tách khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ, Báo cáo nghiên cứu khoa học Khoa hóa Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng năm 2015 – 2016 [2] Lại Mai Hương (2007), “Kết tinh phân đoạn acid béo khơng no nhiều nối đơi từ dầu cá trích cá basa”, Tạp chí Hóa học, T.45 (5), Tr 559 – 564 [3] Đặng Thị Thu (2004), Nghiên cứu công nghệ sản xuất số loại dầu béo lipase, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật, Bộ Khoa học Công nghệ Viện Công nghệ thực phẩm Hà Nội [4] Trần Thế Tục – Đoàn Thế Lư (2004), Cây đu đủ Kỹ thuật trồng, Nhà xuất Lao Động Xã Hội [5] Thái Hà – Đặng Mai (2008), Kỹ thuật trồng chăm sóc đu đủ, Nhà xuất Hồng Đức [6] Hồ Đình Hải, Cây đu đủ, Rau Cây thân gỗ lớn, Rau Rừng Việt Nam [7] Trần Thị Bé Lan, Nguyễn Phương Phi Phan Ngọc Hòa (2012), “Nghiên cứu enzyme lipase từ Candida rugosa Porcine pancreas xúc tác phản ứng transerter dầu dừa”, Tạp chí Khoa học 2012:23b 105-114 [8] Nguyễn Diên Sanh (2005), Nghiên cứu khả làm giàu DHA (Docosahexaenoic) EPA (Eicosapentaenoic) dầu mỡ cá basa (Pangsius bocourti) phương pháp dùng enzyme lipase chưng cất phân đoạn, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Khoa sinh học, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên [9] PGS.TS Đặng Thị Thu (2004), Đề tài nhánh cấp nhà nước: Nghiên cứu công nghệ sản xuất số loại dầu béo lipase, Báo cáo tổng kết Khoa học Kỹ thuật, Bộ Khoa học công nghệ Viện Công nghệ thực phẩm, Hà Nội, Mã số: KC 04 – 07 [10] Quyền Đình Thi (2009), Phân lập số vi khuẩn nấm Việt Nam có khả sinh tổng hợp lipase mới, nghiên cứu tái tổ hợp ứng dụng chúng công nghệ sinh học, Viện khoa học công nghệ Việt Nam – Viện công nghệ sinh học, Hà Nội [11] Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 6127 : 1996; ISO 660 :1983), 1996, Dầu mỡ Động Vật Thực Vật – Xác định số acid độ acid, NXB, Hà Nội [12] Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN 6126 : 2007; ISO 3657 : 2002), 2007, Dầu mỡ Động Vật Thực Vật – Xác định số xà phòng, NXB, Hà Nội [13] Nguyễn Thị Tuyết Như, Nguyễn Thị Nguyên, Phan Ngọc Hòa (2015), “Nghiên cứu sử dụng enzyme lipase Candida rugosa làm xúc tác cho phản ứng tổng hợp bidiosel từ SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 49 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi dầu cá tra (Pangasius hypophtalmus)”, Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 18, Số K22015 [14] Trần Duy (2014), “Tận dụng phụ phẩm từ chế biến thủy sản”, VietFish Tài liệu tham khảo nước [15] Matheus H.M Avelar, Débora M.J Cassimiro, Kádima C Santos , Rui C.C Domingues , Heizir F de Castro , Adriano A Mendes (2013), Hydrolysis of vegetable oils catalyzed by lipase extract powder from dormant castor bean seeds, Industrial Crops and Products 44, 452–458 [16] Slim Abdelkafi, Nathalie Barouth (2011), Carica papaya lipase: A naturally immobilized enzyme with interesting biochemical properties, Plant foods hum nutri Vol 66, Page 67-70 [17] Teixeira da Silva (2007), Papaya (Carica papaya L.) Biology and Biotechnology, Tree and Forestry Science and Biotechnology, Global Science Books [18] Patrícia de O Carvalho, Paula R B Campos, Maximiliano D’Addio Noffs, Patrícia B L Fregolente and Leonardo V Fregolente (2009), Enzymatic Hydrolysis of Salmon Oil by Native Lipases: Optimization of Process Parameters, J Braz Chem Soc., Vol 20, No 1, 117-124 [19] T.A Foglia and P Villeneuve (1997), Carica papaya Latex-Catalyzed Synthesis of Structured Triacylglycerols, JAOCS, Vol.74, no.11 [20] Pablo Domínguez de María, José V Sinisterra, Shau-Wei Tsai, Andrés R Alcántara (2006), Carica papaya lipase (CPL): An emerging and versatile biocatalyst, Biotechnology Advances,Volume 24, Issue 5, Pages 493–499 [21] Annamalai N., Elayaraja S., Vijayalakshmi S and Balasubramanian T (2011), Thermostable alkaline tolerant lipase from Bacillus licheniformis using peanut oil cake as a substrate, African Journal of Biochemistry Research [22] Nathalie Barouth, Slim Abdelkafi (2010), Neutral lipit characterization of Non – water – soluble fractions of Carica papaya latex, J Am Oil Chem Soc, Page 87-88 [23] Nathalie Barouth, Slim Abdelkafi (2010), Neutral lipid characterization of Non – water – soluble fractions of Carica papaya latex, J Am Oil Chem Soc, Page 87-88 [24] C Dhuique-Mayer, Y Caro, M Pina, J Dornier, J Graille (2001), Biocatalytic properties of lipase in crude latex from babaco fruit (Carica prntagona), Biotechnology Letters 23: 1021 – 1024 [25] Pierre Villeneuve, Emanuelle Cambon, Nathalien Barouh, Fanny Gouzou, Regina Lago, Michel Pina, Jenny Ruales, Bruno Barea,Shau-wei Tsai (2006), Comparison of the Lipase Activity in Hydrolysis and Acyl Transfer Reactions of Two Latex Plant SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 50 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Extracts from Babaco (Vasconcellea × Heilbornii Cv.) and Plumeria rubra: Effect of the Aqueous Microenvironment, J Agric Food Chem 2006, 54, 2726-2731 Tài liệu tham khảo từ trang web [26] [27] https://vi.wikipedia.org/wiki/Cá_hồi, ngày truy cập 15/4/2019 http://fr.wikipedia.org/wiki/Indice_de_saponification, ngày truy cập 15/4/2019 [28] http://vietnamtradeoffice.net/tinh-hinh-thuong-mai-thuy-san-the-gioi/, ngày truy cập 15/4/2019 SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 51 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi PHỤ LỤC Xác định số acid 1.1 Định nghĩa Chỉ số acid lipid số mg KOH cần để trung hòa acid bé tự 1g chất béo 1.2 Nguyên tắc Hòa tan phần mẫu thử dung môi hỗn hợp dietyl ete/ etanol 96% (v/v) (1÷1), sau chuẩn độ acid béo tự với dung dịch kali hydroxit etanol điểm kết thúc biết chất thị (màu hồng phenolphtalein giữ vững 10 giây) Phản ứng xảy sau: RCOOH + KOH → RCOOK + H2O Dựa vào lượng KOH dùng để trung hịa acid béo để tính số acid Công thức xác định số acid (AV): 𝐴𝑉 = 56 x V x c 𝑚 Trong : - V thể tích dung dịch chuẩn KOH sử dụng, (ml) - c nồng độ xác dung dịch chuẩn KOH sử dụng, (mol/l) - m khối lượng mẫu thử, (g) Xác định số xà phòng 2.1 Định nghĩa Chỉ số xà phịng hóa lượng mg KOH cần để trung hịa acid béo tự liên kết có 1g chất béo 2.2 Nguyên tắc Đun sôi mẫu thử với dung dịch KOH etanol, cho hoàn lưu phận sinh hàn, lượng xác định chất béo phản ứng với lượng dư dung dịch KOH thời gian để xà phịng hóa hồn tồn chất béo, sau chuẩn độ KOH dư dung dịch chuẩn HCl 0.5N với thị phenolphtalein Điểm tương đương nhận dung dịch chuyển từ màu hồng sang không màu Phản ứng xảy sau: RCOOH + KOH → RCOOK + H2O KOHdư + HCl → KCl + H2O SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 52 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Lượng kiềm dư xác định HCl Dựa vào lượng kiềm phản ứng, tính số xà phịng hóa Cơng thức xác định số xà phịng (SV) 𝑆𝑉 = (Vo−V1)×𝑐×56.1 𝑚 Trong đó: - Vo thể tích dung dịch HCl 0.5N sử dụng cho phép thử trắng, (ml) - V1 thể tích dung dịch HCl 0.5N sử dụng cho phép xác định, (ml) - C nồng độ xác dung dịch HCl, (mol/lít) - m khối lượng phần mẫu thử, (g) Xác định số ester 3.1 Định nghĩa Chỉ số ester số mg KOH cần để xà phịng hóa glycerol có 1g chất béo 3.2 Nguyên tắc Chỉ số ester = Chỉ số xà phòng – Chỉ số acid Chỉ số Iod 4.1 Định nghĩa Chỉ số Iod dầu béo số gam iod cần thiết để cộng vào nối đơi có chứa 100g dầu béo 4.2 Nguyên tắc Là phương pháp dùng thuốc thử có iod clorua (dung dịch Wijs) kết hợp với nối đôi có dầu béo (dầu béo hịa tan CCl4) Lượng ICl phản ứng với KI để giải phóng iod dạng tự định phân dung dịch Na2S2O3 chuẩn, thị hồ tinh bột Điểm tương đương nhận biết dung dịch chuyển từ màu tím xanh sang khơng màu Phản ứng xảy sau: R1 R2 R1 – HC = CH – R2 + ICl → CH – CH I Cl ICl + KI → I2 + KCl I2 + 2S2O32- → I- + S4O62Công thức xác định sô iod (IV): 𝐼𝑉 = (V1−V2)×𝑁×12.69 𝑚 Trong đó: - c nồng độ dung dịch chuẩn natri thiosulfat dùng, (mol/l) - V1 thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat dùng phép thử trắng, (ml) - V2 thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat dùng phép xác định, (ml) - m khối lượng phần mẫu thử, (g) SVTH: Bùi Thị Sương GVHD:PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 53 ... enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô Enzyme lipase từ mủ đu đủ ? ?enzyme. .. 29 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi 2.2.6 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác enzyme lipase thô từ mủ đu đủ. .. 19 Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi Lườn cá hồi Rửa làm nước lạnh (Cắt nhỏ – mm) Hấp cách thủy lườn cá hồi (20 phút) Ép học Dầu cá