Nghiên cứu tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase

Mục đích của đề tài là tinh sạch một phần enzyme lipase có trong mủ đu đủ và xác định các đặc tính vốn có của lipase đu đủ xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của lipase như nhiệt độ pH Kết quả nghiên cứu cho thấy Đã xác định được hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ bằng phương pháp chuẩn độ trên cơ chất cá basa Lipase từ mủ đu đủ là một enzyme chịu kiềm chịu nhiệt tốt Hoạt động tối ưu đối với dầu cá ba sa ở nhiệt độ 400C và pH 8 Đã tìm được nồng độ hòa tan của enzyme thô so với dung dịch gồm Tris HCl pH 8 muối natri lauroyl sacrcosine 0 5 với tỉ lệ là 0 01 w v Đã xác định được điểm đẳng điện của lipase là 6 5 Đã tìm ra được nồng độ muối NH4 2SO4 cho tủa protein enzyme lipase nhiều nhất là từ 60 70 Đã tinh sạch thành công 2 enzyme lipase có trong mủ đu đủ bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion bằng cột Q Sepharose Fast Flow và điện di ở nồng độ muối NH4 2SO4 bão hòa từ 50 70 với kích thước phân tử kích thước nằm trong khoảng 35 45 kDa

n ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: Cơng nghệ thực phẩm CHUYÊN NGÀNH: Công nghệ thực phẩm ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYME LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE Người hướng dẫn : PGS TS ĐẶNG MINH NHẬT Th.S PHAN THỊ VIỆT HÀ Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ QUỲNH Số thẻ sinh viên : 107120152 Lớp : 12H2 Đà Nẵng , 06/2017 TÓM TẮT Tên đề tài: “Nghiên cứu tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase” Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Quỳnh Số thẻ sinh viên: 107120152 Lớp: 12H2 Nội dung đồ án tốt nghiệp bao gồm: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận kiến nghị Mục đích đề tài tinh phần enzyme lipase có mũ đu đủ xác định đặc tính vốn có lipase đu đủ, xác định yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase như: nhiệt độ, pH Kết nghiên cứu cho thấy: ✓ Đã xác định hoạt độ lipase từ mủ đu đủ phương pháp chuẩn độ chất cá basa ✓ Lipase từ mủ đu đủ enzyme chịu kiềm, chịu nhiệt tốt Hoạt động tối ưu dầu cá ba sa nhiệt độ 400C pH= ✓ Đã tìm nồng độ hịa tan enzyme thơ so với dung dịch gồm Tris-HCl pH=8, muối natri lauroyl sacrcosine 0,5% với tỉ lệ 0,01 (w/v) ✓ Đã xác định điểm đẳng điện lipase 6,5 ✓ Đã tìm nồng độ muối (NH4)2SO4 cho tủa protein (enzyme lipase) nhiều từ 60-70% ✓ Đã tinh thành cơng enzyme lipase có mủ đu đủ phương pháp sắc ký trao đổi ion cột Q Sepharose Fast Flow điện di nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hịa từ 50-70% với kích thước phân tử kích thước nằm khoảng 35-45 kDa ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA: HĨA CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Quỳnh Số thẻ sinh viên : 107120152 Lớp : 12H2 Khoa : Hóa Ngành : Cơng nghệ thực phẩm Tên đề tài đồ án: - “Nghiên cứu tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase” Nội dung phần thuyết minh tính tốn: - Lời mở đầu - Chương : Tổng quan - Chương : Đối tượng phương pháp nghiên cứu - Chương : Kết thảo luận - Chương : Kết luận kiến nghị - Tài liệu tham khảo Các vẽ : Không Cán hướng dẫn PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày hoàn thành đồ án : 02/02/2017 20/05/2017 Trưởng Bộ môn …………………… Đà Nẵng, ngày tháng năm 2017 Người hướng dẫn LỜI CẢM ƠN Để đồ án tốt nghiệp đạt kết tốt đẹp, em nhận hỗ trợ, giúp đỡ nhiều quan, tổ chức, cá nhân Với tình cảm sâu sắc, chân thành, cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cá nhân quan tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập nghiên cứu đề tài Trước hết em xin gửi tới thầy khoa Hóa, trường Đại học Bách KhoaĐại học Đà Nẵng lời chào trân trọng, lời chúc sức khỏe lời cảm ơn sâu sắc Với quan tâm, dạy dỗ, bảo tận tình chu đáo thầy cơ, đến em hồn thành đồ án tốt nghiệp, đề tài: “Nghiên cứu tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase” Cảm ơn ba, mẹ sinh thành, nuôi dưỡng cho em ngày hôm Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo PGS TS Đặng Minh Nhật cô Phan Thị Việt Hà quan tâm giúp đỡ, hướng dẫn em hoàn thành tốt đồ án thời gian qua Trong suốt trình làm đồ án, thầy cô cung cấp cho em nhiều kiến thức bổ ích, ln định hướng, góp ý sửa chữa chỗ sai, để từ giúp em nắm bắt kĩ lưỡng, chi tiết nội dung, vấn đề liên quan đến đồ án, hoàn thành đồ án cách tốt Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến lãnh đạo Trường Đại học Bách Khoa- Đại học Đà Nẵng, Khoa Phòng ban chức trực tiếp gián tiếp giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn Công nghệ Thực phẩm – Sinh học, thầy phịng thí nghiệm tất bạn bè giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi, khích lệ động viên em suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Với điều kiện thời gian kinh nghiệm hạn chế sinh viên, đồ án khơng thể tránh thiếu sót Em mong nhận bảo, đóng góp ý kiến thầy để em có điều kiện bổ sung, nâng cao ý thức mình, phục vụ tốt công tác thực tế sau Cuối em xin cảm ơn thầy cô hội đồng bảo vệ tốt nghiệp dành thời gian quý báu để đọc nhận xét cho đồ án em Em xin chân thành cảm ơn! i CAM ĐOAN Em xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng em Các số liệu, kết luận văn trung thực Nếu có trích dẫn em thích rõ ràng Nếu khơng trên, em xin hồn tồn chịu trách nhiệm đề tài Sinh viên thực Nguyễn Thị Quỳnh ii MỤC LỤC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP C LỜI CẢM ƠN i CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC BẢNG, HÌNH VẼ v DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đặc điểm enzyme lipase 1.1.1 Định nghĩa lipase 1.1.2 Phân loại cấu trúc lipase 1.1.2.1 Phân loại 1.1.2.2 Trình tự amino acid 1.1.2.3 Cấu trúc không gian lipase 1.1.3 Tính chất enzyme lipase 1.1.4 Cơ chế xúc tác 1.1.5 Một số phản ứng đặc trưng enzyme lipase 1.1.6 Ứng dụng lipase 1.1.7 Tình hình nghiên cứu nước lipase 1.1.7.1 Tình hình nghiên cứu lipase nước 1.1.7.2 Tình hình nghiên cứu lipase nước 10 1.2 Tổng quan đu đủ 12 1.2.1 Nguồn gốc, phân bố 12 1.2.2 Hình thái sinh lý đu đủ 13 1.2.3 Giá trị dinh dưỡng, ý nghĩa kinh tế đặc tính dược lý đu đủ 13 1.2.4 Mủ đu đủ 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng, hóa chất thiết bị nghiên cứu 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.1.1 Nguồn thu nhận: 15 2.1.1.2 Thu nhận mủ đu đủ 15 2.1.2 Dụng cụ, hóa chất thiết bị sử dụng 16 2.1.3 Thiết bị phục vụ nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp thu nhận chế phẩm lipase thô 19 2.2.1.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 19 2.2.1.2 Thu nhận enzyme thô 19 2.2.1.3 Phương pháp xác định hiệu suất thu hồi chế phẩm lipase thô 20 2.2.2 Phương pháp tinh enzyme thô 20 2.2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 20 2.2.2.2 Phương pháp chiết tách tinh enzyme lipase khỏi cấu trúc nhựa đu đủ………………… 21 2.2.3 Phương pháp chuẩn độ xác định hoạt độ lipase 21 iii 2.2.4 Phương pháp đo quang 23 2.2.5 Khảo sát đặc tính chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ 23 2.2.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính lipase 24 2.2.5.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase 24 2.2.6 Nghiên cứu tinh enzyme lipase từ nhựa đu đủ 24 2.2.6.1 Q trình hịa tan muối Natri lauroyl sarcosin 24 2.2.6.2 Xác định điểm đặng điện 24 2.2.6.3 Tủa muối (NH4)2SO4 24 2.2.6.4 Nghiên cứu tinh phân đoạn sắc ký ion 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Thu nhận mủ đu đủ từ trái đu đủ xanh 28 3.2 Thu chế phẩm lipase thô 28 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase 29 3.4 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase 31 3.5 Kết xác định đường chuẩn 32 3.6 Kết nghiên cứu tinh enzyme lipase từ nhựa đu đủ 33 3.6.1 Kết trình hòa tan muối Natri lauroyl sarcosin 33 3.6.2 Điểm đẳng điện 34 3.6.3 Kết tủa muối Amoni sunfat 35 3.6.4 Nghiên cứu tinh phân đoạn sắc ký ion 36 3.6.5 Kiểm tra lại lipase phương pháp điện di 37 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 iv DANH SÁCH CÁC BẢNG, HÌNH VẼ Bảng 1.1 Cho biết tính đặc hiệu số enzyme lipase Bảng 1.2 Sản lượng đu đủ theo vùng địa lý 12 Bảng 2.1 Tóm tắt bước tiến hành để xác định hoạt độ enzyme lipase 22 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ .29 Bảng 3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ .31 Bảng 3.3 Kết đo quang để xác định đường chuẩn 32 Bảng 3.4 Khối lượng, thể tích hoạt lực enzyme thô, enzyme sau tinh xử lý hòa tan .33 Bảng 3.5 Kết đo độ đục dung dịch enzyme lipase bước sóng 620 nm 34 Bảng 3.6 Nồng độ muối cần dùng hàm lượng lipase thu 35 Bảng 3.7 Kết hoạt lực lipase đo phương pháp đo quang sau chạy sắc ký nồng độ muối NaCl 0M, pH= .37 Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể lipase Hình 1.2 Mơ hình hoạt động lipase chất hồ tan khơng tan nước Sự thay đổi hình thể lipase trình hoạt động xúc tác Mơ hình Verger đề xuất (1980) Hình 1.3 Phản ứng thủy phân Hình 1.4 Phản ứng este hóa Hình 1.5 Phản ứng trao đổi este .6 Hình 1.6 Phản ứng chuyển este .7 Hình 2.1 Vườn đu đủ lấy mủ Đại Lộc, Quảng Nam 15 Hình 2.2 Máy đồng hóa siêu âm………………………………………………………….…21 Hình 2.3 Máy đo pH .18 Hình 2.4 Máy đo quang…………………………… ……………… .21 Hình 2.5 Máy sấy thăng hoa 18 Hình 2.6 Máy li tâm lạnh ……………………………………………………………………21 Hình 2.7 Cân phân tích ( bốn số) 18 Hình 3.1 Mủ đu đủ sau sấy thăng hoa 28 Hình 3.2 Lipase thơ .28 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ 30 Hình 3.4 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ .32 Hình 3.5 Đường chuẩn đo quang hợp chất p-NP 33 Hình 3.6 Hình ảnh thu dung dich lipase sau sắc ký trao đổi ion 37 Hình 3.7 Kết chạy điện di SDS-PAGE 38 v DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT: AS : Amoni sunfat ( NH4)2SO4 p-NP : p-Nitrophenol p-NPP : p-Nitrophenyl pamitateo Gly : acid amin glycine Ser : acid amin serine vi Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Lipase (EC 3.1.1.3) enzyme đóng vai trị xúc tác sinh học cho phản ứng thủy phân triglyceride tạo thành tri-, di-, mono- glyceride, glycerol acid béo tự nhờ hoạt động bề mặt phân pha dầu nước Lipase enzyme linh hoạt sử dụng để xúc tác nhiều loại phản ứng khác nhau, có khả chịu kiềm chịu nhiệt Chính thế, lipase ứng dụng rộng rãi công nghiệp công nghiệp thực phẩm, cơng nghiệp hóa học, cơng nghiệp mỹ phẩm, công nghiệp thuộc da, y học ngành cơng nghiệp khác [7] Lipase có nguồn gốc đa dạng thực vật, động vật vi sinh vật Dù vi sinh vật nguồn cung cấp enzyme giá thành rẻ tạo sinh khối nhiều enzyme từ thực vật động vật góp phần làm phong phú nguồn enzyme [10] Lipase từ thực vật chưa ứng dụng nhiều ngành công nghiệp với nhiều ưu điểm giá thành thấp, nguồn nguyên liệu dồi từ đu đủ, sung, vả, cám gạo, nên gần enzyme lipase từ thực vật ngày ý nghiên cứu nhà khoa học [29] Đu đủ loại thích hợp với khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới, mà Việt Nam đu đủ trồng nhiều, nhiên đu đủ trồng chủ yếu để lấy papain phần enzyme tan nước cịn lipase khơng tan xem chất thải, xem nguồn lipase tiềm [7] Từ nhu cầu sử dụng lipase ngày nhiều nước ta, với nguồn nguyên liệu sẵn có, dễ kiếm tận dụng nguồn chất thải từ sản xuất papain, chất khác lipase thể hoạt độ khác mà chọn đề tài “Nghiên cứu tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase” Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình tinh enzyme lipase đơn giản - Xác định cấu trúc lipase từ mủ đu đủ - Khảo sát yếu tố nhiệt độ, pH, ảnh hưởng đến hoạt độ chế phẩm enzyme lipase từ mủ đu đủ - Tinh lipase phương pháp tủa (NH4)2SO4 kết hợp với sắc ký trao đổi ion - Xác định điểm đẳng điện enzyme lipase từ mủ đu đủ SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase Nhiệt độ yếu tố tác động mạnh mẽ tới hoạt độ enzyme Khi nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng đến giai đoạn vận tốc đạt cực đại, tiếp tục tăng vận tốc enzyme giảm Nhiệt độ mà enzyme hoạt động mạnh gọi nhiệt độ tối ưu Mỗi enzyme có vùng hoạt độ khác Kết nhiệt độ tối ưu cho hoạt động phân giải lipid lipase khảo sát trình bày bảng 3.1 hình 3.3 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ Nhiệt độ (0C) Hoạt độ (UI/g enzyme) 25 77,78g 30 88,89e 35 102,78c 40 177,78a 45 161,11b 50 122,22d 55 80,55f 60 22,22h *Ghi chú: Trong cột, giá trị đánh dấu chữ giống khác khơng có ý nghĩa theo phân tích thơng kê ANOVA (α = 0,05) ❖ Nhận xét: Đồ thị cho thấy hoạt độ lipase tăng dần ta tăng nhiệt độ từ 25 0C đến 400C, sau giảm dần tiếp tục tăng nhiệt độ từ 450C đến 600C Hoạt độ lipase đạt giá trị cao 177,78 UI/g 400C Điều tuân theo quy tắc phản ứng enzyme nghĩa tăng nhiệt độ tốc độ phản ứng enzyme tăng nhiệt độ tăng cao protein enzyme bị biến tính làm cho enzyme bị vô hoạt Nhiệt độ tối ưu thấp công bố nghiên cứu Abdelkafi S cộng sự, với nhiệt độ hoạt động tối ưu lipase thu từ mủ đu đủ 500C [29] SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 29 UI/g Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 a b c d e g f h 20 25 30 35 40 45 50 55 60 0C 65 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ ❖ Giải thích kết thí nghiệm: Có thể thấy rằng, nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme có tác động trực tiếp đến cấu trúc không gian hình thể trung tâm hoạt động enzyme Tử 25÷450C hoạt động enzyme tăng dần, điều giải thích dựa vào động lực học phản ứng enzyme Khi nhiệt độ tăng làm cho động enzyme chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều Các phức chất enzymecơ chất hình thành nhiều hơn, vận tốc phản ứng thủy phân tăng theo đạt cực đại tương ứng nhiệt độ tối ưu điểm khảo sát 400C Từ 40÷600C hoạt độ enzyme lipase giảm dần enzyme có chất protein nên tăng nhiệt độ đến giới hạn nhiệt độ tối ưu vận tốc phản ứng enzyme bị giảm Khi vùng nhiệt độ tối ưu (400C), tác dụng nhiệt độ cao enzyme bị biến tính Trong q trình xử lý nhiệt độ cao, trước tiên số liên kết hydro mạng lưới liên kết hydro tham gia vào việc giữ vững cấu trúc lipase bị đứt gãy, dẫn đến cấu trúc lipase bị biến đổi, enzyme bị biến tính duỗi mạch để lộ nhóm chức kị nước đồng thời tăng cường lực tĩnh điện nhóm chức mạch bên, nhóm chức trái dấu hút ngược lại, nhóm chức dấu đẩy Nếu xử lý enzyme nhiệt độ cao phá vỡ liên kết hydro enzyme chất Kết lớp hydrate bao quanh enzyme bị phá vỡ, hình thể trung tâm hoạt động enzyme khơng cịn phù hợp với chất nên hoạt lực enzyme giảm dần Mức độ giảm dần hoạt động enzyme phụ thuộc vào tăng nhiệt độ bị hồn tồn hoạt tính gọi nhiệt độ tới hạn, enzyme có khả phục hồi lại hoạt độ SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 30 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase 3.4 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase pH có ảnh hưởng lớn đến vận tốc phản ứng enzyme, enzyme hoạt động mạnh dải pH khác Ở giá trị pH mà enzyme hoạt động mạnh gọi pH tối ưu pH môi trường phản ứng ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme ảnh hưởng đến mức độ ion hóa chất, độ bền cấu trúc protein enzyme có nguồn gốc protein nên pH thay đổi ảnh hưởng tới độ phân ly nhóm chức cấu tạo nên trung tâm hoạt động enzyme - OH, - SH Kết pH tối ưu cho hoạt động phân giải lipid lipase khảo sát thể bảng 3.2 hình 3.4: Bảng 3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ Hoạt độ pH (UI/g enzyme) 19,44h 6,5 38,89g 52,78f 7,5 55,56e 127,778a 8,5 77,78b 72,22c 9,5 61,11d 10 55,55e *Ghi chú: Trong cột, giá trị đánh dấu chữ giống khác khơng có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05) ❖ Nhận xét: Kết hình 3.2 cho thấy pH tăng dần từ đến hoạt độ lipase tăng dần, sau hoạt độ lipase giảm dần pH tăng từ đến 10 Trên hình 3.2, dễ dàng nhận thấy lipase từ mủ đu đủ hoạt động khoảng pH 8-9 với hoạt độ lớn đạt 127,78 UI/g giá trị pH=8 Giá trị pH thấp kết Abdelkafi S cộng nghiên cứu lipase từ mủ đu đủ, với pH tối ưu giá trị [29] SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 31 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase 140 a 120 UI/g 100 80 b 60 d e f 40 c e g 20 h pH 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10 10,5 Hình 3.4 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ ❖ Giải thích kết thí nghiệm: Khi pH thay đổi từ 6-10 hoạt tính lipase tăng dần đạt cao pH=8 Điều giải thích dựa vào trạng thái ion hóa enzyme chất, pH tăng đồng thời trạng thái ion hóa enzyme chất thay đổi theo hướng hình thành phức hợp enzyme–cơ chất bền dẫn đến làm tăng vận tốc phản ứng Sau khoảng pH=8-9, hoạt lực enzyme giảm nhanh ion hóa nhóm chức trung tâm hoạt động enzyme, làm thay đổi điện tích cần thiết cho tạo thành phức hợp enzyme–cơ chất trì cấu hình khơng gian enzyme nên tương tác với chất 3.5 Kết xác định đường chuẩn Tiến hành xác định đường chuẩn trình bày mục 2.2.4.2 Thu kết đo quang bảng 3.3 Hình 3.5 Bảng 3.3 Kết đo quang để xác định đường chuẩn Cm Lần đo Lần đo 0.009 0.140 0.138 0.136 0.138000 0.010 0.147 0.148 0.149 0.148000 0.012 0.168 0.177 0.175 0.173367 0.015 0.214 0.210 0.219 0.214333 0.021 0.291 0.307 0.304 0.300667 0.030 0.429 0.424 0.42 0.424333 0.060 0.831 0.837 0.826 0.831333 SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 Lần đo Tb GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 32 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase Đường chuẩn thể mối quan hệ tuyến tính giưa nồng độ p-NP độ hấp thụ bước sóng 410nm Dựa xác định nồng độ p-NP tương ứng sau phản ứng enzyme lipase chất p-NP, từ xác định hoạt lực enzyme p-NP(mM) y = 13,669x + 0,012 R² = 0,9999 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,02 0,04 0,06 0,08 OD Hình 3.5 Đường chuẩn đo quang hợp chất p-NP 3.6 Kết nghiên cứu tinh enzyme lipase từ nhựa đu đủ 3.6.1 Kết q trình hịa tan muối Natri lauroyl sarcosin Đây phát việc tách lipase khỏi cấu trúc mủ đu đủ muối Natri lauroyl sarcosine Kết trình ta thu bảng 3.4 Bảng 3.4 Khối lượng, thể tích hoạt lực enzyme thơ, enzyme sau tinh xử lý hòa tan Enzyme thô Enzyme từ phần lỏng Enzyme từ phần rắn Lượng thu 1g 97ml 0,498g Hoạt độ riêng 175UI/g 7,63UI/ml 20,83UI/g Hoạt độ tổng U 175 750 10,37 ❖ Nhận xét: Kết cho thấy phần rắn lỏng có hoạt lực lipase, từ bảng 3.3 thấy hoạt độ tổng phần lỏng tăng lên nhiều so với lipase thơ trước hịa tan, phần rắn hoạt lực bị giảm nhiều so với lipase thơ Điều chứng tỏ phần enzyme lipase đu đủ cố định tự nhiên “lớp bọc cao su tự nhiên” giải phóng bên ngồi dung dịch lỏng, phát có ý nghĩa lớn, làm sở để thu nhận enzyme lipase đu đủ tinh khiết Từ đó, tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu đặc tính cấu trúc enzyme ❖ Giải thích kết thí nghiệm: SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 33 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase Muối natri lauroyl sarcosine hòa Tris HCl 0,05M pH=8 thu dung dịch có hoạt động bề mặt, tương tác với lớp mủ nhựa cao su, lơi kéo lipase khỏi lớp bọc nhựa cao su, giải phóng phần từ phần rắn ngồi dung dịch lỏng Do khảo sát hoạt lực phần lỏng có xuất hoạt lực lipase Hoạt độ tổng phần lỏng tăng lên nhiều so với trước hịa tan Vì phần enzyme lipase giải phóng khỏi màng cao su tự nhiên, giúp tăng diện tích tiếp xúc lipase với chất nhiều từ làm tăng hoạt độ lipase Từ đây, mở đường cho việc nghiên cứu lipase từ mủ đu đủ 3.6.2 Điểm đẳng điện Việc xác định điểm đẳng điện giúp cho việc lựa chọn pH loại cột phù hợp dùng sắc ký trao đổi ion để tinh enzyme Kết đo quang 620 nm dung dich enzyme thu bảng bảng 3.4 ❖ Nhận xét giải thích kết thí nghiệm: Khi pH= 3÷5,5 ta gần chưa quan sát độ đục dung dịch, có ống nghiệm chứa pH= 6,5 ta thấy dung dịch có đục, tăng pH dung dịch đệm lên độ đục giảm dần khó quan sát Khi đo quang ta nhận thấy ống chứa pH= 3,5; 4; 4,5; có kết gần tương đương Từ pH = 3÷6 độ đục tăng dần Từ pH = 7÷10 độ đục giảm dần Ống nghiệm chứa pH=6,5 đo quang OD lớn quan sát Bảng 3.5 Kết đo độ đục dung dịch enzyme lipase bước sóng 620 nm SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 pH OD 0,02700 3,5 0,0280 0,0290 4,5 0,0280 0,0280 5,5 0,0330 0,0642 6,5 0,1102 0,0360 7,5 0,0348 0,0331 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 34 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase 8,5 0,0330 0,0321 9,5 0,0311 10 0,0310 Từ bảng kết thu nhận thấy ống nghiệm chứa mơi trường có pH=6,5 dung dịch enzyme có độ đục cao nhất, điều chứng tỏ điểm đẳng điện lipase gần 6,5 Điều giải thích pH = 6,5 gần với pI protein nên có nhiều tủa nhất, pH lại xa dần pI nên lượng kết tủa giảm dần 3.6.3 Kết tủa muối Amoni sunfat Kết xác định khối lượng lipase qua nồng độ muối AS có nồng độ bão hịa từ 10÷90 hoạt lực lipase enzyme sau tủa muối bảng 3.6 Bảng 3.6 Nồng độ muối cần dùng hàm lượng lipase thu Nồng độ muối Hàm lượng lipase thu sau Hoạt lực lipase (%) tủa li tâm (g) 10 - 20 - 30 - 40 - 50 0,050 - 60 0,320 + 70 0,102 + 80 0,030 + 90 - ❖ Nhận xét: Vì chưa xác định giá trị muối AS bão hịa tủa protein nên chúng tơi tiến hành q trình tủa protein nồng độ từ 10÷90% Ở nồng độ muối AS bão hịa từ 10÷40% chúng tơi khơng thu protein, tăng lên 50% protein bắt đầu xuất SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 35 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase Ở nồng độ muối AS 50-70% ta thu lượng protein lớn nhất, sau lượng muối tăng lên lượng protein bị giảm dần Tới 90% lượng protein thu gần ❖ Giải thích kết thí nghiệm: Ở nồng độ muối bão hịa 10÷40% khơng xuất tủa protein Ở nồng độ muối 50% thu tủa, phần nhỏ protein kết tủa nhờ muối amoni sunfat, nhiên hàm lượng nhỏ nên không đo hoạt lực lipase Ở nồng độ muối 50-70% thu lượng protein lớn tác dụng kết tủa ion muối tỷ lệ thuận với lực ion protein (enzyme) xác định thấy có hoạt lực lipase chứng tỏ lực ion lipase tăng ta tăng hàm lượng muối lên giúp liên kết nhiều tạo phân tử lớn ( tạo tủa) Ở nồng độ muối từ 80-90% lượng tủa thu giảm phần protein lấy từ trước nên khối lượng lại dung dịch không nhiều dẫn đến kết tủa giai đoạn muối 80-90% không cao 3.6.4 Nghiên cứu tinh phân đoạn sắc ký ion ❖ Kết quả: Kết chạy trao đổi sắc ký ion ta thu peak hình 3.6 hoạt lực lipase cho bảng 3.7 SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 36 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase Hình 3.6 Hình ảnh thu dung dich lipase sau sắc ký trao đổi ion Bảng 3.7 Kết hoạt lực lipase đo phương pháp đo quang sau chạy sắc ký nồng độ muối NaCl 0M, pH= Phân đoạn thu theo Peak tổng Phân đoạn thu theo Peak Phân đoạn thu theo Peak OD UI/ml 0,249 171,8c 0,347 236,37b 0,374 254,15a * Ghi chú: Trong cột, giá trị đánh dấu chữ giống khác khơng có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05) ❖ Nhận xét giải thích kết thí nghiệm: Từ hình 3.6 cho thấy, dung dịch sau chạy sắc ký ion thu peak, peak thứ từ phút thứ đến phút thứ 7, peak thứ từ phút thứ tới phút thứ 12 đo hoạt lực phương pháp đo quang mẫu thu theo phân đoạn peak chứa hoạt lực lipase Chứng tỏ có enzyme lipase dung dịch tinh Điều cho thấy lipase sau sắc ký trao đổi ion làm phần 3.6.5 Kiểm tra lại lipase phương pháp điện di ❖ Nhận xét giải thích kết thí nghiệm: Sau nhận định có protein dung dịch enzyme giai đoạn chạy sắc ký Quá trình chạy điện di khẳng định điều thu mẫu chứa hai băng protein hình 3.7 Theo hình ảnh thu nhận thấy mẫu điều có băng protein enzyme, kích thước nằm khoảng 35-45 kDa Kết gần tương tự với công bố nghiên cứu R Dhouib, cộng sự, với kích thước enzyme thu 45kDa [27] SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 37 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase kDa 45 35 10 M Hình 3.7 Kết chạy điện di SDS-PAGE Trong ký hiệu hình 3.7 là: + M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, BioBase) + 1,4 5: Mẫu enzyme tinh chạy điện di song song SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 38 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình tiến hành nghiên cứu, thu số kết sau: ✓ Đã xác định hoạt độ lipase từ mủ đu đủ phương pháp chuẩn độ chất cá basa ✓ Lipase từ mủ đu đủ enzyme chịu kiềm, chịu nhiệt tốt Hoạt động tối ưu dầu cá ba sa nhiệt độ 400C pH= ✓ Đã tìm nồng độ hịa tan enzyme thơ so với dung dịch gồm Tris-HCl pH=8, muối natri lauroyl sacrcosine 0,5% với tỉ lệ 0,01 (w/v) ✓ Đã xác định điểm đẳng điện lipase 6,5 ✓ Đã tìm nồng độ muối (NH4)2SO4 cho tủa protein (enzyme lipase) nhiều từ 60-70% ✓ Đã tinh thành cơng enzyme lipase có mủ đu đủ phương pháp sắc ký trao đổi ion điện di nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa từ 50-70% với kích thước phân tử kích thước nằm khoảng 35-45 kDa 4.2 Kiến nghị Qúa trình nghiên cứu cho phép em đề xuất số ý kiến việc nghiên cứu tiếp tục sau: ✓ Nghiên cứu ứng dụng lipase tinh chất khác để xem xét khả thủy phân lipase ✓ Xác định đặc tính lipase tinh sạch, xác định Km Vmax lipase tinh ✓ Đưa trình tự acid amin phân tử lipase tinh SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 39 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo nước [1] Nguyễn Minh Chơn (2015), Giáo trình thực tập sinh hóa, Đại học Cần Thơ [2] Thái Hà- Đặng Mai ( 2008), Kỹ thuật trồng chăm sóc đu đủ, nhà xuất Hồng Đức [3] Ngô Tiến Hiển (2004), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme chế biến số nông sản thực phẩm, Bộ Khoa học Công nghệ viện Cơng nghệ thực phẩm Việt Nam [4] Trần Bích Lam, Lưu Duẩn (2013), “Tính chất động học đặc điểm thủy phân lipase tinh từ gan tụy cá tra (PANGASIUS)”, Tạp chí phát triển KHKT&CN, số 16 [5] Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh [6] Nguyễn Ngọc Sương Mai (2014), Thu nhận khảo sát đặc tính số enzyme hydrolase ứng dụng dược phẩm, Luận văn thạc sỹ khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh [7] Đặng Minh Nhật, Phan Thị Việt Hà, Trần Thị Bích Hà (2016), Nghiên cứu chiết tách khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ, Báo cáo nghiên cứu khoa học Khoa hóa Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng năm 2015 – 2016 [8] Bùi Hồng Quân, Nguyễn Đức Lượng (2009), “Tối ưu hóa sinh tổng hợp lipase từ Pichia Anomala Vtcc Y0787 sử dụng ma trận plackett-burman phương pháp đáp ứng bề mặt - phương án cấu trúc có tâm”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, số [9] Quyền Đình Thi (2009), Phân lập số vi khuẩn nấm Việt Nam có khả sinh tổng hợp lipase mới, nghiên cứu tái tổ hợp ứng dụng chúng công nghệ sinh học, Viện khoa học công nghệ Việt Nam – Viện công nghệ sinh học, Hà Nội [10] Đặng Thị Thu (2004), Nghiên cứu công nghệ sản xuất số loại dầu béo lipase, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật, Bộ Khoa học Công nghệ Viện Công nghệ thực phẩm Hà Nội SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 40 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase [11] Trần Thế Tục, Đồn Thế Lư, Cây đu đủ kỹ thuật trồng, Nhà xuất lao động xã hội Tài liệu tham khảo nước [12] Annamalai N., Elayaraja S., Vijayalakshmi S and Balasubramanian T (2011), Thermostable alkaline tolerant lipase from Bacillus licheniformis using peanut oil cake as a substrate, African Journal of Biochemistry Research [13] Carla Tecelao, Ivanna Rivera, Georgina Sandoval and Suzana Ferreira-Dias (2012), Carica papaya latex: A low-cost biocatalyst for human milk fat substitutes production, J Lipid Sci Technol, Page 114-116 [14] Christoph Brunschwiler (2013), Direct measurement of rice bran lipase activity for inactivation kinetics and storage stability prediction, Journal of Cereal Science, Page 272-277 [15] Curso de Postgrado (2002), Enzymeic Enhancement of ω3 Polyunsaturated Fatty Acids Content in Brazilian Sardine Oil, Acta Farm Bonaerense, Page 85-87 [16] Christoph Brunschwiler, Daniel Heine, Stefan Kappeler, Beatice Conde-Petit, Laura Nystrom (2009), Direct measurement of rice bran lipase activity for inactivation kinectics and storage stability prediction, Corporate Technology, Switzerland, Page 34-36 [17] Fernanda Wiermann Paques (2008), Characterization of the lipase from Carica papaya residues, Braz J Food Technol, Page 20-27 [18] Georgina Sandoval (2012), Lipases and Phospholipases, Industrial Biotechnology Unit Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diso del Estado de Jalisco A.C (CIATEJ) Guadalajara, Jalisco, Mexico, Page 4-8 [19] José Murillo P Barbosa, Ranyere L Souza (2011), Biochemical characterisation of lipase from a new strain of Bacillus, Instituto de Tecnologia e Pesquisa, Av Murilo Dantas, 300, 49032-490 Aracaju - SE, Brasil, Page 7-10 [20] Laemmli, U K (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227(5259), Page 680-685 SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 41 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase [21] Muhannad I Massadeh* and Fatima M Sabra (2011), Production and characterization of lipase from Bacillus stearothermophilus, African Journal of Biotechnology Vol 10, Page 139-146 [22] Nathalie Barouth, Slim Abdelkafi (2010), Neutral lipid characterization of Non – water – soluble fractions of Carica papaya latex, J Am Oil Chem Soc, Page 87-88 [23] Poonsuk Prasertsan (2008), Comparison and Selection of protease and lipase sources from visceral organs of three tuna species, Songklanakarin J.Sci Technol, Page 73 – 76 [24] Pablo Domínguez de María, José V Sinisterra, Shau-Wei Tsai, Andrés R Alcántara (2006), Carica papaya lipase (CPL): An emerging and versatile biocatalyst, Biotechnology Advances, Page 493–499 [25] Rivera I, Mateos-Diaz JC, Sandoval G (2012), Plant lipases: partial purification of Carica papaya lipase, Methods Mol Bio [26] Rubens Monti et al (2000), Purification of papain from fresh latex of Carica papaya, Brazilian archieves of biology and technology, Page 43-46 [27] Richard R Burgess ( 2009), Protein Precipitation Techniques, University of Wisconsin–Madison, Madison, Wisconsin, USA, Page 330-340 [28] R Dhouib1, J Laroche-Traineau2, R Shaha1, D Lapaillerie3, E Solier3 (2010), Identification of a putative triacylglycerol lipase from papaya latex by functional proteomics, [29] Slim Abdelkafi, Nathalie Barouth (2011), Carica papaya lipase: A naturally immobilized enzyme with interesting biochemical properties, Plant foods hum nutri Vol 66, Page 67-70 [30] Sonali Seth, Debamitra Chakravorty, Vikash Kumar Dubey, Sanjukta Patra (2013), An insight into plant lipase research – challenges encountered, Protein expression and purification Vol 95, page 2-3 [31] Teixeira da Silva (2007), Papaya (Carica papaya L.) Biology and Biotechnology, Tree and Forestry Science and Biotechnology, Global Science Books SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 42 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase Web [32] https://www.foodnk.com/tim-hieu-nhanh-ve-he-enzyme-trong-nguyen-lieu-thuysan.html ( 27/5/2017) SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2 GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 43 ... chọn đề tài ? ?Nghiên cứu tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình tinh enzyme lipase đơn giản - Xác định cấu trúc lipase từ mủ đu đủ - Khảo... tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu nhận mủ đu đủ từ trái đu đủ xanh Mủ đu đủ thu nhận từ sáng sớm, khoảng thời gian từ. .. 20 Đề tài: Nghiên cứu tinh enzym lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính lipase 2.2.2.2 Phương pháp chiết tách tinh enzyme lipase khỏi cấu trúc nhựa đu đủ ➢ Tiến hành: Cân 1g enzyme hòa vào dung dịch