Lipase thu nhận từ thực vật có rất nhiều tính năng nổi bật và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Trong đó chúng được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu xúc tác cho các phản ứng thủy phân và tổng hợp chất béo Trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme lipase từ mủ đu đủ Kết quả cho thấy phương trình hồi quy thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất thủy phân như sau Y 252 913 180 516X1 7 115X3 – 42 110X12 – 0 077X32 trong đó Y là hiệu suất quá trình thủy phân X1 là nồng độ enzyme X2 là tỉ lệ dung môi cơ chất w w X3 là nhiệt độ thủy phân oC Khoảng tỉ lê dung môi cơ chất khảo sát nằm trong vùng tối ưu nên thay đổi X2 trong 0 5 ÷ 1 5 không ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất thủy phân cực đại Các điều kiện tối ưu cho hiệu suất thủy phân cao nhất là nồng độ enzyme 1 68 tỉ lệ dung môi cơ chất 0 97 w w và nhiệt độ 36 6oC Với điều kiện tối ưu hiệu suất thu được khi thủy phân 1 giờ là 35 7 Thời gian thủy phân đạt hiệu suất thủy phân cao đồng thời đạt hiệu quả về kinh tế là trong vòng 48 giờ Nghiên cứu này cũng xác định các thông số động học của phản ứng thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme lipase từ mủ đu đủ Vmax và KM tìm được lần lượt là 266 4 µmol FFAs giờ ml và 293 3 µmol FAs ml năng lượng hoạt hóa E 43 6 KJ mol Nghiên cứu này sẽ là tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng lipase từ mủ đu đủ để làm giàu DHA EPA trong dầu cá hồi phục vụ cho ngành sản xuất thực phẩm chức năng
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HĨA Q TRÌNH THỦY PHÂN DẦU CÁ HỒI BẰNG ENZYME LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ HỒNG PHÚC Số thẻ sinh viên: 107150107 Lớp: 15H2A Đà Nẵng – Năm 2019 TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định động học trình Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Phúc Số thẻ sinh viên: 107150107 Lớp: 15H2A Lipase thu nhận từ thực vật có nhiều tính bật ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Trong đó, chúng ứng dụng nhiều nghiên cứu xúc tác cho phản ứng thủy phân tổng hợp chất béo Trong nghiên cứu tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ Kết cho thấy phương trình hồi quy thể ảnh hưởng yếu tố đến hiệu suất thủy phân sau Y = -252,913 + 180,516X1 + 7,115X3 – 42,110X12 – 0,077X32 Y hiệu suất q trình thủy phân, X1 nồng độ enzyme (%), X2 tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w), X3 nhiệt độ thủy phân ( oC) Khoảng tỉ lê dung môi/cơ chất khảo sát nằm vùng tối ưu nên thay đổi X2 [0,5 ÷ 1,5] khơng ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất thủy phân cực đại Các điều kiện tối ưu cho hiệu suất thủy phân cao nồng độ enzyme: 1,68%, tỉ lệ dung môi/ chất: 0,97 (w/w) nhiệt độ: 36,6 oC Với điều kiện tối ưu, hiệu suất thu thủy phân 35,7% Thời gian thủy phân đạt hiệu suất thủy phân cao đồng thời đạt hiệu kinh tế vòng 48 Nghiên cứu xác định thông số động học phản ứng thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ, Vmax KM tìm 266,4 (µmol FFAs/giờ.ml) 293,3 (µmol FAs/ml), lượng hoạt hóa E = 43,6 KJ/mol Nghiên cứu tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng trình thủy phân dầu cá hồi lipase từ mủ đu đủ để làm giàu DHA, EPA dầu cá hồi phục vụ cho ngành sản xuất thực phẩm chức ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: LÊ THỊ HỒNG PHÚC Lớp: 15H2A Số thẻ sinh viên: 107150107 Khoa: Hóa Ngành: Công nghệ thực phẩm Tên đề tài đồ án: “Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định động học trình” Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Các số liệu liệu ban đầu: Nội dung phần thuyết minh tính tốn: - Mở đầu - Chương 1: Tổng quan - Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận - Kết luận - Tài liệu tham khảo - Phụ lục Các vẽ: Không Họ tên người hướng dẫn: PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà Ngày giao nhiệm vụ Ngày hoàn thành nhiệm vụ : 18/08/2019 : 16/12/2019 Thông qua môn Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019 Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019 TRƯỞNG BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN (Ký, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) PGS.TS Đặng Minh Nhật PGS.TS Đặng Minh Nhật LỜI NÓI ĐẦU Sau gần tháng nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định động học trình”, hướng dẫn tận tình thầy Đặng Minh Nhật, với giúp đỡ cô Phan Thị Việt Hà, thầy cô môn bạn sinh viên phịng thí nghiệm, em hồn thành đồ án tốt nghiệp Trước hết cho phép em bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến thầy Đặng Minh Nhật, thầy giúp đỡ em từ việc chọn đề tài hoàn thành đồ án tốt nghiệp Trong suốt thời gian em thực đồ án, thầy ln định hướng, góp ý sửa chữa chỗ sai, để từ giúp em nắm bắt kĩ lưỡng, chi tiết nội dung, vấn đề liên quan đến đồ án, hoàn thành đồ án cách tốt Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến cô Phan Thị Việt Hà, cô hướng dẫn, hỗ trợ động viên em, tạo điều kiện tốt để em hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Nhờ cô mà em tiếp xúc với môi trường thực hành trang thiết bị đại trường Đại học Duy Tân Cô nhắc nhở góp ý lúc giúp em tích lũy thêm nhiều kinh nghiệm cho thân Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn Công nghệ thực phẩm, thầy cô phịng thí nghiệm tất bạn bè, người thân giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi, khích lệ động viên em suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Cuối cho em xin cảm ơn thầy cô Hội đồng bảo vệ tốt nghiệp dành thời gian quý báu để đọc nhận xét cho đồ án em i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp thành từ nghiên cứu hoàn toàn thực tế sở số liệu thực tế thực theo hướng dẫn giáo viên hướng dẫn Đồ án thực hoàn toàn thành riêng tôi, không chép theo đồ án tương tự Mọi tham khảo sử dụng đồ án trích dẫn nguồn tài liệu báo cáo danh mục tài liệu tham khảo Mọi chép không hợp lệ, vi phạm quy chế nhà trường, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Sinh viên thực ii MỤC LỤC TÓM TẮT NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI NÓI ĐẦU i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ .v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 1.1 Tổng quan đu đủ 1.1.1 Nguồn gốc phân bố 1.1.2 Hình thái sinh lý đu đủ 1.1.3 Giá trị dinh dưỡng, ý nghĩa kinh tế đặc tính dược lý đu đủ 1.1.4 Mủ đu đủ 1.2 Tổng quan enzyme lipase 1.2.1 Định nghĩa .6 1.2.2 Nguồn gốc 1.2.3 Cấu tạo lipase 1.2.4 Cơ chế động học xúc tác lipase 1.2.5 Một số phản ứng đặc trưng 1.3 Tổng quan cá hồi 11 1.3.1 Phân bố đặc điểm 11 1.3.2 Thành phần dinh dưỡng cá hồi 13 1.3.3 Tình hình khai thác, chế biến xuất cá hồi giới 13 1.4 Tổng quan dung môi iso-octan 14 1.4.1 Tính chất vật lý 15 1.4.2 Tính chất hóa học 15 1.4.3 Ứng dụng 16 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng, hóa chất thiết bị nghiên cứu 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị sử dụng 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 iii 2.2.1 Phương pháp đánh giá chất lượng dầu cá hồi 22 2.2.2 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác enzyme lipase từ mủ đu đủ 22 2.2.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ 22 2.2.4 Nghiên cứu tối ưu hóa trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ 24 2.2.5 Xác định động học trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ 26 2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân 30 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 30 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Xác định số dầu ban đầu 31 3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ 31 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân 31 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân 32 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 34 3.3 Tối ưu hóa nồng độ enzyme, tỉ lệ dung mơi/cơ chất, nhiệt độ q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ 35 3.4 Xác định động học trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ 40 3.4.1 Xác định thông số động học KM Vmax 41 3.4.2 Xác định lượng hoạt hóa E 43 3.5 Kết ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân 44 KẾT LUẬN 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ Danh sách bảng Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng có 100g đu đủ .5 Bảng 1.2 Đặc điểm loại cá hồi 11 Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng cá hồi 100g 13 Bảng 2.1 Khoảng biến thiên yếu tố thực nghiệm 25 Bảng 2.2 Ma trận quy hoạch thực nghiệm 26 Bảng 3.1 Hiệu suất thủy phân nống độ enzyme khác 31 Bảng 3.2 Hiệu suất thủy phân tỉ lệ dung môi/cơ chất khác 33 Bảng 3.3 Hiệu suất thủy phân mức nhiệt độ khác 34 Bảng 3.4 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm 35 Bảng 3.5 Giá trị hệ số b phương trình hồi quy, kiểm định T xác suất p tương ứng 36 Bảng 3.6 Vận tốc phản ứng ban đầu thu nồng độ chất khác thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase thô từ mủ đu đủ thời gian 42 Bảng 3.7 Kết thu sau nghiên cứu động học cho trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase thô từ mủ đu đủ tho mơ hình động học Michaelis-Menten 42 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến số tốc độ (k) 43 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân 44 Danh sách hình vẽ Hình 1.1 Cây đu đủ Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian lipase từ Candida rugosa .8 Hình 1.3 Mơ hình chế xúc tác lipase bề mặt tiếp xúc hai pha dầu – nước Hình 1.4 Sự hoạt hóa enzyme Hình 1.5 Hình thành phức hợp enzyme - chất .9 Hình 1.6 Phản ứng thủy phân 10 Hình 1.7 Phản ứng este hóa 10 Hình 1.8 Phản ứng trao đổi este 10 Hình 1.9 Phản ứng chuyển este 10 Hình 1.10 Cá hồi Đại Tây Dương 11 Hình 1.11 Sản lượng cá hồi Đại Tây Dương năm 2005 – 2020 14 Hình 1.12 Cấu tạo iso-octan 15 v Hình 2.1 Vườn thu nhận mủ đu đủ .17 Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase thô 18 Hình 2.3 Enzyme lipase thơ từ mủ đu đủ sau sấy thăng hoa 19 Hình 2.4 Lườn cá hồi thu mua Cơng ty TNHH chế biến thực phẩm D&N 20 Hình 2.5 Sơ đồ thu nhận dầu cá hồi 20 Hình 2.6 Dầu cá hồi thu 21 Hình 2.7 Máy ly tâm 21 Hình 2.8 Máy sấy thăng hoa 22 Hình 2.9 Máy khuấy từ 22 Hình 2.10 Sơ đồ khảo sát trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ 23 Hình 2.11 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất 28 Hình 2.12 Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ c chất theo Lineweaver-Burk 28 Hình 3.1 Sản phẩm thu sau thủy phân mẫu 31 Hình 3.2 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hiệu suất phản ứng thủy phân 32 Hình 3.3 Biểu đồ thể ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất phản ứng thủy phân 33 Hình 3.4 Biểu đồ thể ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng thủy phân 34 Hình 3.5 Biểu đồ đường mức (contour plot) biểu thị ảnh hưởng nồng độ enzyme nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 37 Hình 3.6 Biểu đồ bề mặt (surface plot) biểu thị ảnh hưởng nồng độ enzyme nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 37 Hình 3.7 Biểu đồ đường mức (contour plot) biểu thị ảnh hưởng nồng độ enzyme tỉ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân 38 Hình 3.8 Biểu đồ bề mặt (surface plot) biểu thị ảnh hưởng nồng độ enzyme tỉ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân 38 Hình 3.9 Biểu đồ đường mức (contour plot) biểu thị ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/cơ chất nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 39 Hình 3.10 Biểu đồ bề mặt (surface plot) biểu thị ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/cơ chất nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 39 Hình 3.11 Điểm tối ưu phản ứng 40 Hình 3.12 Biểu đồ thể thay đổi tốc độ phản ứng theo thời gian thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ 41 vi Hình 3.13 Biểu đồ Lineweaver-Burk thủy phân dầu cá enzyme lipase từ mủ đu đủ 42 Hình 3.14 Đồ thị Arrhenius thủy phân dầu cá enzyme lipase từ mủ đu đủ 44 Hình 3.15 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân 45 vii Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ xác định động học trình FFAs/giờ.ml) KM = 25,0 (µmol FAs/ml) thấy Vmax phản ứng thủy phân enzyme lipase từ mủ đu đủ nhỏ enzyme thô từ thực vật kết tốt KM phản ứng thủy phân enzyme lipase từ mủ đu đủ cao nhiều nên lực enzyme với chất dầu cá hồi nhỏ nhiều so với CAL-B enzyme CAL-B enzyme từ vi sinh vật tinh chế nên có hoạt lực cao [26] 3.4.2 Xác định lượng hoạt hóa E Năng lượng hoạt hóa (E) cho phản ứng thủy phân dầu cá hồi với enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định đồ thị Arrhenius mơ tả phần 2.2.5.2 với phương trình (2.16) Ảnh hưởng thay đổi nhiệt độ trình thủy phân dầu cá hồi với enzyme lipase nghiên cứu ba nhiệt độ khác 25ºC, 30ºC 35ºC thể Bảng 3.8 Đồ thị Arrhenius (Hình 3.14) vẽ sử dụng giá trị tìm Bảng 3.5 để tính lượng hoạt hóa Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến số tốc độ (k) Nhiệt độ T Hằng số vận tốc k 1/T ln k (ºK) (µmol FFAs/ml) (ºK-1) 298 0,178 0,00336 -1,73 303 0,232 0,00330 -1,46 308 0,317 0,00325 -1,15 Phương trình (2.16) ln k = ln A0 + − E tương ứng với y = -5247,3x + 15,887 RT Từ ta tính lượng hoạt hóa E = 43,6 KJ/mol So sánh với kết Aditi Sharma [26] thủy phân dầu cá hồi chế phẩm enzyme Lipase B Candida antarctica (CAL-B) từ vi sinh vật E = 16,1 KJ/mol thấy lượng hoạt hóa phản ứng thủy phân xúc tác enzyme lipase từ mủ đu đủ lớn nhiều cho thấy trình thủy phân dầu cá hồi enzyme bất lợi so với CAL-B cần nhiều lượng để phá vỡ liên kết dầu cá hồi Nguyên nhân là enzyme cố định (lipase liên kết chặt với vật chất khơ có mủ đu đủ) enzyme cố định nên lipase mủ đu đủ có ưu điểm tái sử dụng mà không làm giảm đáng kể khả xúc tác Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Phúc Hướng dẫn: PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 43 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ xác định động học trình -0.8 0.0032 0.00325 0.0033 0.00335 0.0034 -1 lnk -1.2 -1.4 -1.6 y = -5247.3x + 15.887 R² = 0.9915 -1.8 -2 1/T (oK-1) Hình 3.14 Đồ thị Arrhenius thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ 3.5 Kết ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân Q trình khảo sát tối ưu hóa mục 3.3 thực cố định thời gian thủy phân Để xác định hiệu suất thủy phân tối đa đạt kéo dài thời gian thủy phân với điều kiện tối ưu tìm nồng độ enzyme: 1,68% tương ứng với 0,084g enzyme cho 1g dầu cá hồi, tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w): 0,97 nhiệt độ: 36,6 oC Hiệu suất thu kéo dài thời gian thể Bảng 3.9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân Thời gian Hiệu suất thủy phân (giờ) (%) 0,0 a 24 57,0 b 48 63,9 c 72 64,0 c 96 63,9 c Ghi chú: Các giá trị đánh dấu chữ giống khác khơng có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05) Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân thể biểu đồ Hình 3.15 Biểu đồ cho thấy hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác enzyme lipase từ mủ đu đủ thay đổi theo giai đoạn Hiệu suất tăng nhanh 48 đầu đạt hiệu suất lên đến 63,9% Sau thời gian hiệu suất khơng đổi phản ứng xúc tác enzyme đạt trạng thái cân Do đó, trình thủy phân đạt hiệu Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Phúc Hướng dẫn: PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 44 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ xác định động học trình cao 48 ứng với hiệu suất 63,9% việc kéo dài thời gian dài 48 khơng có ý nghĩa mặt kinh tế Kết cao nhiều so với kết nghiên cứu trước sinh viên Bùi Thị Sương [37] thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ với điều kiện tối ưu, không sử dụng dung môi iso-octan sử dụng máy lắc thay máy khuấy từ với hiệu suất cực đại 48 49,84% Điều cho thấy việc sử dụng dung môi iso-octan máy khuấy từ đem lại hiệu tích cực 80 Hiệu suất (%) 70 63.9a 64,0a 63,9a 48 72 96 57,0b 60 50 40 30 20 10 0c 0 24 Thời gian (giờ) Hình 3.15 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Phúc Hướng dẫn: PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 45 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ xác định động học trình KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu, chúng tơi thu số kết sau: ➢ Đã khảo sát đơn biến yếu tố nồng độ enzyme, tỉ lệ enzyme/cơ chất, nhiệt độ xác định được: • Nồng độ enzyme cho hiệu suất thủy cao 1,6% • Tỉ lệ dung mơi/cơ chất cho hiệu suất thủy phân cao (w/w) • Nhiệt độ cho hiệu suất thủy phân cao 35 oC ➢ Xác định nồng độ enzyme tối ưu 1,68%, tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) tối ưu 0,97 nhiệt độ tối ưu cho trình thủy phân dầu cá hồi lipase từ mủ đu đủ 36,6 o C Với điều kiện tối ưu, hiệu suất thu thủy phân 35,7% ➢ Xác định thời gian thủy phân cho hiệu suất thủy phân cao đồng thời hiệu kinh tế 48 với hiệu suất thủy phân đạt 63,9% ứng với điều kiện thủy phân tối ưu Nghiên cứu cho hiệu suất cao nghiên cứu sinh viên năm trước cho thấy việc sử dụng dung môi iso-octan máy khuấy từ tối ưu thủy phân với nước máy lắc ➢ Xác định thông số động học phản ứng thủy phân dầu cá hồi lipase từ mủ đu đủ như: • Vận tốc cực đại phản ứng 266,4 µmol FFAs/giờ.ml Điều có ý nghĩa quan trọng trình thủy phân Khi ta tăng nồng độ chất đến nồng độ mà vận tốc đạt 266,4 µmol FFAs/giờ.ml việc tiếp tục tăng nồng độ chất khơng có ý nghĩa mặt kinh tế • Hằng số Michaelis-Menten phản ứng 293,3 µmol FFAs/ml cao nên cho thấy lực enzyme lipase từ mủ đu đủ với chất dầu cá hồi không cao enzyme liên kết chặt với chất khô mủ đu đủ • Năng lượng hoạt hóa E = 43,6 KJ/mol cao cho thấy khả xúc tác enzyme thấp vận tốc phản ứng cịn nhỏ Đây có lẽ nhược điểm enzyme từ thực vật Qua trình nghiên cứu cho phép đề xuất số ý kiến việc nghiên cứu tiếp tục sau: • Xây dựng quy trình làm giàu DHA EPA dầu cá hồi phương pháp thủy phân xúc tác enzyme lipase từ mủ đu đủ Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Phúc Hướng dẫn: PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 46 Nghiên cứu tối ưu hóa trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ xác định động học q trình • So sánh hiệu suất làm giàu phương pháp thủy phân dầu cá hồi xúc tác enzyme lipase từ mủ đu đủ chất xúc tác khác Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Phúc Hướng dẫn: PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 47 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ xác định động học trình TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Danielle Swanson, Robert Block, “Omega-3 fatty acids EPA and DHA: Health benefits throughout life,” Adv Nutr., 2012 [2] “https://www.tomvang.com/tin-tuc/tan-dung-phu-pham-tu-che-bien-thuy-san/.” - truy cập ngày 06/12/2019 [3] Nguyễn Đình Hải Nam, “Nghiên cứu số đặc tính enzym lipase từ mủ đu đủ ứng dụng vào trình làm giàu DHA, EPA dầu cá hồi,” Luận văn thạc sĩ Đại học Bách Khoa Đà Nẵng, 2019 [4] Dhuique-Mayer, Y Caro, M Pina, J Dornier, “Biocatalytic properties of lipase [5] in crude latex from babaco fruit (Carica prntagona),” Biotechnol Lett 23, 2011 Slim Abdelkafi, “Carica papaya lipase: A naturally immobilized enzyme with interesting biochemical properties,” Plant foods hum Nutr., vol 66, 2011 [6] De La Cruz Medina, “PAPAYA Post-harvest Operations,” Inst Tecnológico Veracruz [7] Trần Thế Tục, Cây đu đủ kỹ thuật trồng Nhà xuất Lao động - Xã hội, 2004 [8] Nguyễn Hoàng Anh, Cây ăn đặc sản – Kỹ thuật trồng chăm sóc Nhà xuất Hà Nội, 2009 [9] Cohen, Lavi, Papaya pollen viability and storage Sci, Hort, 1989 [10] “https://vi.wikipedia.org/wiki/Đu_đủ.” - truy cập ngày 04/10/2019 [11] Teixeira da Silva, “Papaya (Carica papaya L.) Biology and Biotechnology, Tree and Forestry Science and Biotechnology,” 2007 [12] Hồ Đình Hải, Cây đu đủ, Rau Cây thân gỗ lớn, Rau Rừng Việt Nam [13] Tanmoy Ghosh and Indranil Bhattacharjee, “Nutritional, medicinal and pharmacological properties of papaya (Carica papaya Linn.): A review.” [14] Vijay Yogiraj, Pradeep Kumar Goyal, Chetan Singh Chauhan and B V Goyal, “Carica papaya Linn: An Overview,” Int J Herb Med., 2014 [15] Thái Hà, Kỹ thuật trồng chăm sóc đu đủ Nhà xuất Hồng Đức, 2008 [16] Foglia and P Villeneuve, “Carica papaya Latex-Catalyzed Synthesis of Structured Triacylglycerols,” JAOCS, vol 74, no 11, 1997 [17] Jeana S Macalood*, Helen J Vicente, Renato D Boniao, Jessie G Gorospe, “Chemical Analysis of Carica papaya L Crude Latex,” Am J Plant Sci., 2013 [18] Maria Antonia Pedrine Colabone Celligoi, F Thiago Andrade Marques Marcelo Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Phúc Hướng dẫn: PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 48 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ xác định động học trình Rodrigues de Melo, and G M G and M de Barros, Microbial Enzyme Technology in Food Applications CRC press, 2016 [19] Đặng Thị Thu, “Đề tài nhánh cấp nhà nước: Nghiên cứu công nghệ sản xuất số loại dầu béo lipase,” Báo cáo tổng kết Khoa học Kỹ thuật Bộ Khoa học công nghệ Viện Công nghệ thực phẩm, Hà Nội, vol KC 04 – 07, 2004 [20] Quyền Đình Thi, “Phân lập số vi khuẩn nấm Việt Nam có khả sinh tổng hợp lipase mới, nghiên cứu tái tổ hợp ứng dụng chúng công nghệ sinh học,” Viện khoa học công nghệ Việt Nam – Viện công nghệ sinh học, Hà Nội, 2009 [21] Ngô Tiến Hiển, “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym chế biến số nông sản thực phẩm,” Bộ Khoa Học Và Công nghệ Viện Công Nghệ Thực Phẩm, vol KC 04 – 07, 2004 [22] “https://vi.wikipedia.org/wiki/Cá_hồi.” - truy cập ngày 06/10/2019 [23] “https://tepbac.com/species/full/176/ca-hoi.htm.” - truy cập ngày 06/10/2019 [24] “https://vi.wikipedia.org/wiki/Thịt_cá_hồi.” - truy cập ngày 06/10/2019 [25] “http://vietnamtradeoffice.net/tinh-hinh-thuong-mai-thuy-san-the-gioi/.” - truy cập ngày 06/10/2019 [26] Aditi Sharma, Lipase Catalyzed Synthesis of DHA Rich Triglycerides from Fish Oils by Selective Hydrolysis and Esterification 2013 [27] “https://en.wikipedia.org/wiki/2,2,4-Trimethylpentane.” - truy cập ngày 06/10/2019 [28] “Thermo Fisher Scientific - Isooctane,” Fish Sientific, 2009 [29] “http://www.hiephoixangdau.org/nd/kien-thuc/tim-hieu-ve-tri-so-octan.html.” truy cập ngày 10/10/2019 [30] “https://en.wikipedia.org/wiki/2,2,4-Trimethylpentane#See_also - truy cập ngày 11/10/2019.” - truy cập ngày 10/10/2019 [31] Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 6127 : 1996; ISO 660 :1983), “Dầu mỡ Động Vật Thực Vật – Xác định số acid độ acid,” NXB Hà Nội, 1996 [32] Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN 6126 : 2007; ISO 3657 : 2002), “Dầu mỡ Động Vật Thực Vật – Xác định số xà phòng,” NXB Hà Nội Hà Nội, 2007 [33] Patrícia de O Carvalho, Paula R B Campos, Maximiliano D’Addio Noffs, “Enzymatic Hydrolysis of Salmon Oil by Native Lipases: Optimization of Process Parameters,” J Braz Chem Soc., vol 20, no 1, 2009 [34] Đỗ Quý Hai, Giáo trình enzyme 2006 [35] “https://en.wikipedia.org/wiki/Michaelis–Menten_kinetics.” - truy cập ngày 28/11/2019 Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Phúc Hướng dẫn: PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 49 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ xác định động học trình [36] Lê Ngọc Tú, Hóa sinh cơng nghiệp NXB Khoa Học Kỹ Thuật, 2002 [37] Bùi Thị Sương, “Nghiên cứu thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ứng dụng để làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi,” Đồ án tốt nghiệp trường Đại học Bách Khoa - Đại học Đà Nẵng, 2019 Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Phúc Hướng dẫn: PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Phan Thị Việt Hà 50 PHỤ LỤC Xác định số acid 1.1 Định nghĩa Chỉ số acid lipid số mg KOH cần để trung hòa acid béo tự 1g chất béo 1.2 Nguyên tắc Hòa tan phần mẫu thử dung môi hỗn hợp dietyl ete/ etanol 96% (v/v) (1÷1), sau chuẩn độ acid béo tự với dung dịch kali hydroxit etanol điểm kết thúc biết chất thị (màu hồng phenolphtalein giữ vững 10 giây) Phản ứng xảy sau: RCOOH + KOH → RCOOK + H O Dựa vào lượng KOH dùng để trung hòa acid béo để tính số acid Cơng thức xác định số acid (AV): AV = 56.V.c m Trong : - V thể tích dung dịch chuẩn KOH sử dụng, (ml) - c nồng độ xác dung dịch chuẩn KOH sử dụng, (mol/l) - m khối lượng mẫu thử, (g) Xác định số xà phòng 2.1 Định nghĩa Chỉ số xà phịng hóa lượng mg KOH cần để trung hịa acid béo tự liên kết có 1g chất béo 2.2 Nguyên tắc Đun sôi mẫu thử với dung dịch KOH etanol, cho hoàn lưu phận sinh hàn, lượng xác định chất béo phản ứng với lượng dư dung dịch KOH thời gian để xà phịng hóa hồn tồn chất béo, sau chuẩn độ KOH dư dung dịch chuẩn HCl 0,5N với thị phenolphtalein Điểm tương đương nhận dung dịch chuyển từ màu hồng sang không màu Phản ứng xảy sau: CH2 – O – COR1 CH – O – COR2 CH2 – O – COR3 RCOOH + KOH → RCOOK + H O CH – OH + 3KOH → CH – OH CH2 – OH R1 COOK + R2 COOK R3 COOK KOHdư + HCl → KCl + H O Lượng kiềm dư xác định HCl Dựa vào lượng kiềm phản ứng, tính số xà phịng hóa Cơng thức xác định số xà phòng (SV): Phụ lục SV = (V0 -V1 ).c.56,1 m Trong đó: - Vo thể tích dung dịch HCl 0,5N sử dụng cho phép thử trắng, (ml) - V1 thể tích dung dịch HCl 0,5N sử dụng cho phép xác định, (ml) - c nồng độ xác dung dịch HCl, (mol/lít) - m khối lượng phần mẫu thử, (g) Xác định số este 3.1 Định nghĩa Chỉ số este số mg KOH cần để xà phịng hóa glycerol có 1g chất béo 3.2 Nguyên tắc Chỉ số este = Chỉ số xà phòng – Chỉ số acid Các kết tính 4.1 Xác định số dầu Xác định nồng độ KOH Thể tích dung dịch KOH (ml) Mẫu lặp 11,65 chuẩn độ với 10ml dung dịch Mẫu lặp 11,70 acid oxalic 0,1N Trung bình 11,68 Nồng độ dung dịch KOH (N) Thể tích dung dịch KOH (ml) chuẩn 0,086 Xác định số acid Mẫu lặp 2,40 Mẫu lặp 2,45 Trung bình 2,43 11,65 Chỉ số acid tính Xác định số xà phịng hóa Mẫu Thể tích dung dịch HCl 0,5N chuẩn Mẫu trắng Mẫu dầu Mẫu lặp 17,40 9,90 Mẫu lặp 17,50 10,00 Trung bình 17,45 9,95 Chỉ số xà phịng hóa tính Phụ lục 210,4 4.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ Xác định nồng độ KOH Thể tích KOH (ml) để chuẩn dung Lần 11,20 dịch acid oxalic 0,1 N Lần 11,15 Khảo sát ảnh hưởng lượng enzym sử dụng đến hiệu suất thủy phân Lượng enzym sử dụng (w/w) Thể tích KOH (ml) sử dụng 1,2 % 1,4% 1,6% 1,8% Lần 12,60 13,90 17,00 16,20 Lần 12,70 14,10 16,90 16,10 Lần 12,55 14,00 17,00 16,10 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân Tỉ lệ dung mơi/cơ chất (w/w) Thể tích KOH (ml) sử dụng 0,5 1,5 Lần 13,20 16,80 16,20 15,20 Lần 13,05 16,75 16,35 15,40 Lần 13,15 16,90 16,30 15,25 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân Nhiệt độ (℃) Thể tích KOH (ml) sử dụng 30 35 40 45 Lần 12,70 16,80 15,65 15,40 Lần 12,80 16,90 15,80 15,25 Lần 12,85 17,00 15,70 15,30 4.3 Tối ưu hóa q trình thủy phân Xác định nồng độ KOH Thể tích dung dịch KOH (ml) Mẫu lặp 10,30 chuẩn độ với 10ml dung dịch acid oxalic 0,1N Mẫu lặp 10,35 Trung bình 10,33 Nồng độ dung dịch KOH (N) Thể tích KOH chuẩn độ ứng với mẫu lặp (ml) Thể tích KOH Mẫu lặp Mẫu lặp Mẫu lặp trung bình (ml) 13,45 13,20 13,55 13,40 13,80 13,90 14,30 14,00 12,20 11,40 12,10 11,50 12,30 11,90 12,20 11,60 Thí nghiệm Phụ lục 0,097 13,80 13,70 13,30 13,60 13,95 14,05 13,65 14,45 13,80 14,55 13,80 14,35 11,75 11,80 11,85 11,80 10 13,65 12,00 13,80 12,20 13,95 11,95 13,80 12,05 11 12 13,75 14,20 13,95 14,40 13,85 14,15 13,85 14,25 13 14,50 14,70 14,45 14,55 14 13,15 13,35 13,25 13,25 T1 14,90 14,80 15,15 14,95 T2 14,95 15,25 15,15 15,12 Nồng độ enzyme Ti lệ dung môi/cơ (%) chất (w/w) 1,8 Thí Thể tích Chỉ số acid Hiệu suất thủy phân Nhiệt độ KOH (o C) trung bình (ml) 1,5 30 13,40 72,81 30,8 1,6 1,4 1,84 1,5 35 30 14,00 12,20 76,07 66,29 32,4 27,5 1,6 1,4 1,5 26,6 40 11,60 13,60 63,03 73,89 25,9 31,3 1,94 35 13,80 74,98 31,9 1,8 1,4 0,5 0,5 40 30 14,35 11,80 77,97 64,11 33,4 26,4 1,4 0,5 40 13,80 74,98 31,9 10 1,26 35 12,05 65,47 27,1 11 1,6 43,4 13,85 75,25 32,0 12 1,8 1,5 40 14,25 77,43 33,1 13 1,8 0,5 30 14,55 79,06 33,9 14 1,6 0,16 35 13,25 71,99 30,4 T1 1,6 35 14,95 81,23 35,0 T2 1,6 35 15,12 82,15 35,5 nghiệm (%) ❖ Kiểm chứng điều kiện tối ưu thực nghiệm Xác định nồng độ KOH Mẫu lặp Mẫu lặp Phụ lục 10,30 10,30 Thể tích dung dịch KOH (ml) chuẩn độ với 10ml dung dịch acid oxalic 0,1N Trung bình 10,30 Nồng độ dung dịch KOH (N) Thể tích KOH 0,097 Thể tích KOH trung chuẩn độ ứng với mẫu lặp (ml) Chỉ số acid bình (ml) Hiệu suất thủy phân (%) 15,05 15,10 15,30 15,15 82,52 35,7 4.4 Xác định KM Vmax Xác định nồng độ KOH Thể tích dung dịch KOH (ml) Mẫu lặp 11,05 chuẩn độ với 10ml dung dịch acid oxalic 0,1N Mẫu lặp Trung bình 11,00 11,03 Nồng độ dung dịch KOH (N) Nồng độ chất [S] (µmol FFAs/ml) 31,6 53,9 70,6 83,6 Phụ lục Thời gian (phút) 0,091 Thể tích KOH chuẩn độ ứng với mẫu lặp (ml) Thể tích KOH trung bình (ml) Mẫu lặp Mẫu lặp Mẫu lặp 15 7,05 7,15 7,10 7,10 30 9,15 9,15 9,20 9,17 45 11,85 11,95 11,90 11,90 60 15,40 15,45 15,50 15,45 15 30 9,95 13,40 9,80 13,50 10,10 13,60 9,95 13,50 45 17,55 17,45 17,35 17,45 60 22,20 22,00 21,95 22,05 15 12,15 12,30 12,05 12,17 30 17,25 17,20 17,40 17,28 45 20,85 21,00 21,00 20,95 60 28,20 28,50 28,35 28,35 15 15,15 15,40 15,20 15,25 30 22,05 22,40 22,45 22,30 45 26,10 25,90 26,05 26,02 60 34,45 34,70 34,50 34,55 Nồng độ chất [S] (µmol FFAs/ml) Thể tích KOH Nồng độ FFAs tạo Vận tốc phản ứng (phút) trung bình (ml) thành (µmol FFAs) đầu r (µmol FFAs/phút.ml) 0 15 7,10 66,4 30 9,17 95,0 45 11,90 132,7 60 15,45 181,7 15 9,95 63,3 30 45 13,50 17,45 105,2 151,6 60 22,05 205,8 0 15 12,17 54,5 30 17,28 107,2 45 20,95 144,8 60 28,35 220,9 0 15 15,25 55,6 30 22,30 119,9 45 26,02 153,9 60 34,55 231,7 Thời gian 31,6 53,9 70,6 83,6 1/[S] 1/r 3,03 0,0316 0,330 3,43 0,0186 0,292 3,68 0,0142 0,272 3,86 0,0120 0,259 4.5 Xác định lượng hoạt hóa E Xác định nồng độ KOH Thể tích dung dịch KOH (ml) Mẫu lặp 11,45 chuẩn độ với 10ml dung dịch acid oxalic 0,1N Mẫu lặp 11,55 Trung bình 11,50 Nồng độ dung dịch KOH (N) Thể tích Nhiệt độ (K) Phụ lục KOH lần lặp (ml) Thể tích KOH trung bình (ml) 0,087 Nồng độ FFAs Vận tốc phản ứng tạo thành đầu đầu (µmol FFAs) (µmol FFAs/phút.ml) 10,70 298 10,60 10,65 10,65 109,4 1,82 13,12 142,0 2,37 17,00 193,6 3,23 13,05 303 13,15 13,15 17,00 17,10 308 16,90 4.6 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân Xác định nồng độ KOH cho mẫu 24 Thể tích dung dịch KOH (ml) chuẩn độ với 10ml dung dịch Mẫu lặp Mẫu lặp 11,65 11,70 acid oxalic 0,1N Trung bình 11,68 Nồng độ dung dịch KOH (N) 0,086 Xác định nồng độ KOH cho mẫu 48 Thể tích dung dịch KOH (ml) chuẩn độ với 10ml dung dịch Mẫu lặp 11,00 Mẫu lặp 11,05 Trung bình Nồng độ dung dịch KOH (N) 11,03 0,091 acid oxalic 0,1N Xác định nồng độ KOH cho mẫu 72 96 Thể tích dung dịch KOH (ml) Mẫu lặp 11,45 chuẩn độ với 10ml dung dịch Mẫu lặp 11,55 acid oxalic 0,1N Trung bình 11,50 Nồng độ dung dịch KOH (N) Thời gian (giờ) Thể tích KOH chuẩn độ ứng với mẫu lặp (ml) 0,087 Thể tích KOH trung Chỉ số acid Hiệu suất thủy phân Mẫu lặp Mẫu lặp Mẫu lặp bình (ml) 24 48 26,20 27,25 26,00 27,45 25,80 27,05 26,00 27,25 124,93 138,66 57,0 63,9 72 28,50 28,45 28,40 28,45 138,79 64,0 96 28,40 28,50 28,40 28,43 138,71 63,9 Phụ lục (%) ... trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase mủ đu đủ 22 2.2.4 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ 24 2.2.5 Xác định động học trình. .. Hà 30 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định động học trình Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định số dầu ban đầu Dầu cá hồi thu... 22 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định động học q trình enzyme (%), tỉ lệ dung mơi/cơ chất (w/w), nhiệt độ thủy phân (oC) Quá trình thủy phân dầu