Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ

Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học, hơn 1000 hệ enzyme đã được tìm thấy và thu hồi từ những cơ thể sinh vật để phục vụ cho các lĩnh vực công nghiệp, nghiên cứu khoa học, y học, thực phẩm… trong đó enzyme protease đã được chú trọng và phát triển từ rất sớm nhờ những ứng dụng quan trọng và phổ biến của nó trong đời sống. Protease được sử dụng để làm mềm thịt, làm trong nước quả, chống lại hiện tượng kết tủa của bia khi làm lạnh, điều chế dược phẩm giúp tiêu hóa tốt hơn... trong đó hơn 70% lượng enzyme protease được sử dụng trong chất tẩy rửa công nghiệp. Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme protease là động vật, thực vật và vi sinh vật. Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu chính để thu nhận một lượng lớn chế phẩm enzyme protease phục vụ cho mục đích công nghiệp và thương mại. Tuy nhiên, so với các protease có nguồn gốc vi sinh vật thì protease thực vật có nhiều ưu điểm như không hoặc ít chứa độc tố, khả năng chịu nhiệt của enzyme protease từ thực vật kém hơn và có thể dễ dàng loại bỏ chúng khi cần thiết. Vì thế, những năm gần đây việc nghiên cứu các loại protease từ thực vật đang được quan tâm và chiếm một tỷ lệ đáng kể trong công nghiệp sản xuất enzyme. Một số enzyme thực vật như bromelain, papain, ficin, urease đã được tinh chế và sử dụng nhiều. Mầm giá đỗ được xem là loại thực phẩm “thế hệ mới”, ngoài giá trị dinh dưỡng cao như chứa nhiều vitamin, khoáng chất, trong giá đỗ còn chứa một lượng lớn các enzyme như αamylase, invertase. Đặc biệt là hệ enzyme cysteine protease có tác dụng thủy phân protein dự trữ có trong hạt giúp cho quá trình nảy mầm, sinh trưởng và phát triển của hạt. Việc nghiên cứu enzyme protease làm tăng giá trị kinh tế của đậu xanh và góp phần giải quyết nhu cầu enzyme của Việt Nam. Vì vậy, tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ” là đề tài tốt nghiệp.

Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Bùi Viết Cường ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Cộng hoà xã hội chủ nghĩa Việt Nam TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc Khoa Hóa Bộ môn Công nghệ thực phẩm NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên : NGUYỄN THỊ THANH TÂM Lớp : 09H2A Khóa : 2009 - 2014 Ngành : Công nghệ thực phẩm 1. Tên đề tài Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. 2. Nội dung các phần của đề tài - MỞ ĐẦU - Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU - Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - TÀI LIỆU THAM KHẢO - PHỤ LỤC 4. Cán bộ hướng dẫn Họ và tên cán bộ :KS. BÙI VIẾT CƯỜNG Phần : Toàn bộ 5. Ngày giao nhiệm vụ : 16 – 02 – 2014 6. Ngày hoàn thành nhiệm vụ : 30 – 05 – 2014 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Bùi Viết Cường Thông qua bộ môn Đà Nẵng, ngày........tháng........năm 2014 TỔ TRƯỞNG BỘ MÔN Đà Nẵng, ngày........tháng........năm 2014 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ký, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) PGS.TS. Đặng Minh Nhật KS. Bùi Viết Cường Kết quả điểm đánh giá:........ Sinh viên đã hoàn thành và nộp toàn bộ bản báo cáo cho bộ môn Đà Nẵng, ngày........tháng........năm 2014 Đà Nẵng, ngày........tháng........năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Sinh viên thực hiện (Ký, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Nguyễn Thị Thanh Tâm Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Bùi Viết Cường LỜI CẢM ƠN  Sau hơn 3 tháng nghiên cứu, được sự hướng dẫn tận tình của Thầy Bùi Viết Cường, cùng với sự giúp đỡ của các thầy cô và các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm, em đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình. Trước hết cho phép em bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc nhất đến Thầy Bùi Viết Cường đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em từ việc chọn đề tài cho đến khi hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình. Trong suốt thời gian em thực hiện đồ án, mặc dù rất bận rộn trong công việc nhưng Thầy vẫn dành nhiều thời gian và tâm huyết trong việc hướng dẫn em. Thầy đã cung cấp cho em rất nhiều kiến thức bổ ích, luôn định hướng, góp ý và sửa chữa những chỗ sai, để từ đó giúp em nắm bắt kĩ lưỡng, chi tiết hơn về nội dung, cũng như các vấn đề liên quan đến đồ án, và hoàn thành đồ án một cách tốt nhất. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm – Sinh học – Hóa dầu, các thầy cô ở phòng thí nghiệm và tất cả bạn bè đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi, khích lệ và động viên em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp của mình. Cuối cùng cho em được cảm ơn các thầy cô trong hội đồng bảo vệ tốt nghiệp đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và nhận xét cho đồ án của em. Đà Nẵng, ngày 30 tháng 05 năm 2014 Sinh viên thực hiện NGUYỄN THỊ THANH TÂM MỤC LỤC Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Bùi Viết Cường Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -5- GVHD: KS. Bùi Viết Cường MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học, hơn 1000 hệ enzyme đã được tìm thấy và thu hồi từ những cơ thể sinh vật để phục vụ cho các lĩnh vực công nghiệp, nghiên cứu khoa học, y học, thực phẩm… trong đó enzyme protease đã được chú trọng và phát triển từ rất sớm nhờ những ứng dụng quan trọng và phổ biến của nó trong đời sống. Protease được sử dụng để làm mềm thịt, làm trong nước quả, chống lại hiện tượng kết tủa của bia khi làm lạnh, điều chế dược phẩm giúp tiêu hóa tốt hơn... trong đó hơn 70% lượng enzyme protease được sử dụng trong chất tẩy rửa công nghiệp. Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme protease là động vật, thực vật và vi sinh vật. Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu chính để thu nhận một lượng lớn chế phẩm enzyme protease phục vụ cho mục đích công nghiệp và thương mại. Tuy nhiên, so với các protease có nguồn gốc vi sinh vật thì protease thực vật có nhiều ưu điểm như không hoặc ít chứa độc tố, khả năng chịu nhiệt của enzyme protease từ thực vật kém hơn và có thể dễ dàng loại bỏ chúng khi cần thiết. Vì thế, những năm gần đây việc nghiên cứu các loại protease từ thực vật đang được quan tâm và chiếm một tỷ lệ đáng kể trong công nghiệp sản xuất enzyme. Một số enzyme thực vật như bromelain, papain, ficin, urease đã được tinh chế và sử dụng nhiều. Mầm giá đỗ được xem là loại thực phẩm “thế hệ mới”, ngoài giá trị dinh dưỡng cao như chứa nhiều vitamin, khoáng chất, trong giá đỗ còn chứa một lượng lớn các enzyme như α-amylase, invertase. Đặc biệt là hệ enzyme cysteine protease có tác dụng thủy phân protein dự trữ có trong hạt giúp cho quá trình nảy mầm, sinh trưởng và phát triển của hạt. Việc nghiên cứu enzyme protease làm tăng giá trị kinh tế của đậu xanh và góp phần giải quyết nhu cầu enzyme của Việt Nam. Vì vậy, tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ” là đề tài tốt nghiệp. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -6- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Đề tài nghiên cứu của tôi được tiến hành theo hướng sau: 1. Xác định số lần lạnh đông, tan giá tối ưu để thu được enzyme protease có hoạt lực cao nhất. 2. Xác định được lượng SiO2 cần thiết sử dụng trong quá trình phá vỡ tế bào mầm giá đỗ để thu được enzyme proteaze có hoạt lực cao nhất. 3. Tối ưu hóa quá trình phá vỡ tế bào mầm giá đỗ với 2 biến: lạnh đông, tan giá và lượng bột SiO2 để thu được enzyme protease có hoạt lực cao nhất. 4. Xác định nhiệt độ tối ưu trồng giá đỗ để thu được enzyme protease có hoạt lực cao nhất. 5. Xác định thời gian trồng giá đỗ để thu được enzyme protease có hoạt lực cao nhất. 6. Tối ưu hóa điều kiện trồng giá đỗ (nhiệt độ, thời gian) để đạt hiệu suất thu hồi enzyme protease có hoạt lực cao nhất. Do thời gian làm đề tài có hạn, những hiểu biết về enzyme nói chung và proteaza nói riêng còn hạn chế cho nên đồ án không thể tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong được sự góp ý nhiệt tình của các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn chỉnh hơn. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -7- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 Enzyme 1.1.1. Định nghĩa enzyme Enzyme là những chất xúc tác sinh học được hình thành trong tế bào và có bản chất là protein. Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác tổng hợp. Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng có trật tự theo những chiều hướng xác định với tốc độ cực nhanh. Bản chất của enzyme là những chất hữu cơ có phân tử lượng lớn hơn 20.000 đến 1.000.000 dalton. Enzyme hòa tan được trong nước hoặc trong dung dịch muối loãng, do kích thước phân tử lớn nên chúng không qua được màng bán thấm. Enzyme cũng bị biến tính và mất tác dụng xúc tác bởi các tác nhân hóa lý như axit, kiềm đặc, muối kim loại nặng, trong các dung môi hữu cơ như rượu, aceton, các chất gây kết tủa thuận nghịch đối với các chế phẩm enzyme như muối ammonium sulfat, natri clorua và các dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp. Ở nhiệt độ cao enzyme bị biến tính và mất khả năng xúc tác. Enzyme cũng có tính lưỡng tính, nghĩa là trong điều kiện pH của môi trường nó có thể tồn tại ở dạng anion, cation hoặc dạng trung hòa điện. Vì vậy có thể dùng kỹ thuật điện di để phân tích các loại enzyme và dạng phân tử của enzyme. Enzyme có nhiều tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học như: enzyme có cường lực xúc tác rất lớn, có tính đặc hiệu cao. Mỗi enzyme chỉ xúc tác làm chuyển hóa được một hoặc một số cơ chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Enzyme tác dụng trong điều kiện êm dịu, thường tác dụng thích hợp ở áp suất thường, nhiệt độ 30÷50oC, pH trung tính, không cần nồng độ axit hay nồng độ kiềm mạnh, áp suất cao, do đó không đòi hỏi các thiết bị chịu axit, kiềm và chịu áp suất cao đắt tiền. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -8- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Enzyme có thể được phân tách từ nhiều nguồn như động vật, thực vật và vi sinh vật. Mỗi nguồn enzyme có một số tính chất đặc trưng, cung cấp những enzyme đặc hiệu cho quá trình chế biến. Do đó mặc dù vi sinh vật đóng vai trò là nguồn cung cấp enzyme chính cho thị trường enzyme, bởi giá thành rẻ và đa dạng về chủng loại enzyme nhưng các enzyme động vật và thực vật cũng góp phần làm cho nguồn enzyme trở nên đa dạng. Khi sử dụng enzyme có nguồn gốc vi sinh vật cho ngành y dược và thực phẩm phải đảm bảo trong chế phẩm không có độc tố, không gây bệnh. Hiện nay nhiều nghiên cứu đã thu nhận được nhiều loại enzyme từ thực vật như bromelain, papain và ficin. Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (carica papaya) còn bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (pineapple plant), ficin thu được từ nhựa cây cọ (ficus carica), enzyme protease còn được tìm thấy trong các hạt thóc, hạt đỗ khô, hạt đỗ nảy mầm, khoai tây... tuy enzyme trong thực vật chiếm một phần nhỏ trong nền công nghiệp sản xuất enzyme, nhưng với những đặc tính ưu việt của chúng như không hoặc chứa ít độc tố, nguồn nguyên liệu tự nhiên… đây sẽ là nguồn cung cấp enzyme lớn và hiệu quả, tạo ra những nguồn enzyme tinh khiết ứng dụng cao cho khoa học. 1.1.2. Các đơn vị hoạt độ của enzyme Đơn vị hoạt độ của một enzyme được coi là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được một lượng cơ chất nhất định trong một đơn vị thời gian nhất định ở điều kiện tiêu chuẩn. + Đơn vị UI (đơn vị quốc tế) Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được một micromole cơ chất sau thời gian một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 UI = 1 µM cơ chất (10-6 M/phút) + Đơn vị katal (kat) Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa một mol cơ chất sau thời gian một giây ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 kat =1 Mol cơ chất /giây Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -9- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 1 UI = 1/60 x 10-6 kat = 16,67 nkat Hoạt lực enzyme hoặc hoạt lực xúc tác được biểu diễn bằng một số đơn vị hoạt độ enzyme. + Hoạt độ riêng Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt độ enzyme trên đơn vị khối lượng protein. UI hoặc Kat /1 mg (ml) protein + Hoạt độ phân tử (hoặc hoạt độ riêng phân tử) Được biểu diễn bằng số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme sau một đơn vị thời gian (thường là phút). + Hoạt độ tâm xúc tác Là số phân tử cơ chất bị chuyển hóa bởi một trung tâm hoạt động sau một phút. 1.1.3. Cơ chế tác dụng và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme 1.1.3.1. Cơ chế tác dụng Theo Michaleis –Menten muốn cho phản ứng enzyme xảy ra thì cơ chất phải được gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme tạo thành phức hợp enzyme cơ chất (ES). Quá trình tạo thành phức enzyme - cơ chất (ES) và sự biến đổi cơ chất thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua 3 giai đoạn: E+S ES P+E Giai đoạn thứ nhất enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp. Giai đoạn thứ hai xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng. Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do [4 tr 23]. 1.1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme a. Nồng độ enzyme Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -10- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. v = k [E] v: vận tốc phản ứng [E]: Nồng độ enzyme Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme tăng vận tốc không thay đổi. b. Nồng độ cơ chất Trong tất cả các phản ứng enzyme, khi các điều kiện khác được giữ cố định, thì vận tốc phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Theo Michaelis - Menten khi nồng độ cơ chất thấp vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Ở những nồng độ cơ chất cao thì vận tốc phản ứng tiến gần đến vận tốc cực đại. Nhưng nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng không thể tăng được nữa. c. Chất kiềm hãm Các chất kiềm hãm hoặc chất ức chế có thể làm giảm hoạt độ của enzyme. Các chất ức chế tham gia trong điều hòa, kiểm tra các quá trình trao đổi chất trong hệ thống sống. Các chất này có thể là những ion, các phần tử vô cơ, hữu cơ kể cả các protein, cho phản ứng kiềm hãm thuận nghịch và không thuận nghịch. Các chất gây biến tính protein là những chất kìm hãm không đặc hiệu của enzyme. Nhiều chất khác không làm biến tính protein enzyme nhưng vẫn làm giảm hoạt độ xúc tác của nó theo cơ chất. d. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa Chất hoạt hóa như ion kim loại ( Mn 2+, Zn2+…) có tác dụng hoạt hóa đối với enzyme. Tuy nhiên tác dụng hoạt hóa chỉ giới hạn ở những nồng độ xác định, vượt qua giới hạn này có thể làm giảm hoạt tính của enzyme. Một số chất khác có thể tác dụng theo cách gián tiếp như loại trừ các yếu tố kìm hãm khỏi môi trường phản ứng. e. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -11- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Theo qui luật của các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứng enzyme càng tăng khi tăng nhiệt độ, nhưng vì enzyme có bản chất là protein do đó khi tăng nhiệt độ đến một giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ bị giảm do sự biến tính của enzyme. Đại lượng đặc trưng cho ảnh hưởng nhiệt độ đến vận tốc phản ứng hóa học cũng như phản ứng enzyme là hệ số nhiệt Q10. Mỗi enzyme đều có một nhiệt độ thích hợp nhất cho sự hoạt động xúc tác gọi là nhiệt độ tối thích. Nhiệt độ tối thích của một enzyme phụ thuộc vào cơ chất, pH môi trường, thời gian tác dụng, tại nhiệt độ enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn, tại đây enzyme ít có khả năng phục hồi lại hoạt độ. f. Ảnh hưởng của pH môi trường pH môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và độ bền của enzyme. Đa số enzyme bền trong giới hạn pH giữa 5 và 9, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có mặt của cơ chất, ion Ca 2+…, pH tối thích có thể thay đổi tùy theo tính chất, nồng độ của cơ chất, nhiệt độ của phản ứng và bản chất của loại dung dịch đệm. Ngoài các yếu tố chính đã nêu trên, hoạt độ của enzyme còn phụ thuộc vào yếu tố khác như: ánh sáng, sóng siêu âm, tia bức xạ… trong hệ thống sống, enzyme còn phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng phát triển của nguồn sinh enzyme [9 tr 15]. 1.2. Enzyme protease thực vật Enzyme protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin [5 tr 58]. So với các protease từ động vật thì các protease từ thực vật được phát hiện muộn hơn. Các enzyme phân giải protein từ nguồn thực vật đã nhận được sự chú ý đặc biệt vì những ưu điểm của chúng như có khoảng pH, nhiệt độ hoạt động rộng và hoạt động tốt khi có mặt của các hợp chất hữu cơ, không hoặc có ít độc tố. Do đó, việc tìm kiếm và tinh chế các protease từ thực vật với những đặc tính riêng biệt luôn là một thách thức cho ngành nghiên cứu hiện nay. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -12- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Protease có nhiều trong hệ thực vật, các protease này liên quan đến việc điều hòa hoạt động cấp tế bào ở tất cả các loài. Trong thực vật, các protease có vai trò phân giải protein dự trữ trong suốt quá trình nảy mầm của hạt, tái tạo các protein thực vật bị hư hỏng, điều chỉnh quá trình già hoá ở các loại thực vật, sửa đổi các protein để thực hiện chức năng cụ thể ở các tế bào thực vật. Các protease ở thực vật ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát triển và chống chịu sâu bệnh ở thực vật. Vì thế, trong hệ thực vật chứa rất nhiều enzyme protease và hoạt tính của chúng cũng rất mạnh. Các loại protease chính ở thực vật bao gồm: serin, cystein, aspartic và các metallaprotease. Trong đó serine và cysteine là các loại protease chiếm phần nhiều nhất. Cystein có vai trò điều khiển quá trình nảy mầm của hạt và sự già hoá của tế bào. Còn serine có vai trò điều chỉnh trong việc thu nhận protein [14 tr 97]. Theo một số tài liệu, trong giá đỗ chứa rất nhiều enzyme protease thuộc họ cystein [14]. Cystein protease (EC.3.4.22) là nhóm protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 33÷39 kDa [14 tr 427], các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết: peptide, amide, ester thiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm – SH trong tâm hoạt động. Nhóm sulfuahydryl -SH trong phân tử của enzyme đóng vài trò rất quan trọng trong các phản ứng của enzyme, là thành phần trực tiếp tham gia các phản ứng xúc tác. Chúng có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme-cơ chất. Khoảng pH hoạt động của enzyme cystein khá rộng (3,5÷8,0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của enzyme trong vùng pH từ 5,7÷7,0 và nhiệt độ thích hợp là 50÷57oC, điểm đẳng điện của enzyme pI = 6,1. Hiện nay đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficin) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. Việc sử dụng thực vật làm nguồn nguyên liệu cho protease còn nhiều hạn chế, do chịu sự tác động của nhiều nhân tố như đất đai, điều kiện khí hậu phù hợp cho sự tăng trưởng. Tuy việc sản xuất protease từ nguồn thực vật là quá trình mất Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -13- GVHD: KS. Bùi Viết Cường nhiều thời gian nhưng so với các protease có nguồn gốc vi sinh vật thì enzyme protease có nguồn gốc thực vật đang được ưa chuộng hiện nay. Papain và bromelain đại diện cho các protease có nguồn nguyên liệu từ thực vật và đã được biết đến từ rất lâu. Papain là cysteine protease được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ. Bromelain được phân lập từ chồi, ngọn, vỏ dứa. a) b) Hình 1.1.Cấu trúc không gian của enzyme protease a) Enzyme cystein protease b) Enzyme vicilin peptidohydrolase Theo nhiều nghiên cứu thì trong họ đỗ có chứa rất nhiều enzyme cysteine protease như đậu tương, đậu xanh… ngoài ra nó còn chứa nhiều trong các hạt lương thực như ngũ cốc, gạo, khoai tây [16]. Năm 1874 Group-Besanez công bố đã nhận được protease từ hạt một loại đỗ. Trong suốt quá trình nảy mầm, các chất dự trữ có trong hạt sẽ được hệ enzyme phân giải tinh bột, protein và lipid tạo ra các sản phẩm để vận chuyển đi nuôi cây trồng. Tuy nhiên vẫn còn một lượng nhỏ các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất trong suốt quá trình phát triển và nảy mầm của hạt, hoạt tính enzyme sẽ tăng lên trong những ngày đầu nảy mầm. Gần đây có nhiều nghiên cứu đã tìm thấy trong mầm giá đỗ của đỗ xanh có chứa enzyme protease có tên là vicilin peptidohydrolase (EC 3.4.22.34) [31] được tinh chế từ phương pháp điện gel polyacrylamine và điểm đẳng điện từ dung dịch giá đỗ. Vicilin là enzyme thuộc họ endopeptidases cysteine thủy phân liên kết peptid của protein, giúp cho quá trình tiêu hóa protein được dễ dàng [16]. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -14- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 1.3. Công nghệ enzyme Hiện nay việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên quy mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế ở các mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Công nghệ sản xuất enzyme được xem như một kỹ thuật quan trọng của công nghệ sinh học do có các chức năng sau: + Enzyme là chất xúc tác cho mọi biến đổi vật chất trong công nghệ sinh học. + Enzyme và nhiều hoạt chất sinh học khác là sản phẩm của công nghệ sinh học. Chúng có thể dùng làm công cụ mới của công nghệ sinh học, hay sử dụng trong các lĩnh vực khác. + Enzyme được xem là thuốc thử có tính chuyên hóa cao mà không có enzyme thì các quá trình công nghệ sinh học không thể tối ưu hóa được. Có thể thu nhận enzyme từ động vật như trypsin, chymotrypsin, từ thực vật như papain của đu đủ, amylase của đại mạch hoặc enzyme từ vi sinh vật, nhưng dù là nguồn enzyme nào thì cũng phải dựa vào đặc trưng sinh học của đối tượng. Đối với vi sinh vật cần chú ý đến khâu chọn giống, vấn đề di truyền giống, đặc tính sinh lý, hóa sinh của giống. Đối với enzyme từ động vật và thực vật thì cần chú ý tới loại, giống vật nuôi, cây trồng có chứa loại enzyme đó, thời điểm nuôi trồng… 1.4. Đỗ xanh và mầm giá đỗ 1.4.1. Đỗ xanh Hình 1.2. Hạt đỗ xanh Hình 1.3. Cấu tạo bên trong của hạt đỗ xanh.[24] Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -15- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Cây đỗ xanh có tên khoa học Vigna radiata (L) là cây đậu đỗ quan trọng đứng hàng thứ ba sau đậu nành và đậu phụng (2 loại cây công nghiệp ngắn ngày), có khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể thích nghi với các vùng có điều kiện khắc nghiệt. Hạt đỗ xanh (mung bean, green gram) là hạt của cây đỗ xanh, được trồng chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, là cây trồng khá quen thuộc ở Châu Á và rất phổ biến ở Việt Nam. Hạt đỗ xanh có hình trụ, thuôn, tròn đều, có màu xanh bóng, xanh xám, vàng, mốc hoặc đen xám… nằm ngăn cách nhau trong vách xốp của quả [8 tr 15]. 1.4.2. Mầm giá đỗ Mầm giá đỗ là hạt đỗ nảy mầm, dài chừng 3÷7 cm. Đây là một loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giá đỗ thường được ủ cho nảy mầm từ hạt đỗ như đỗ xanh, đỗ đỏ, đỗ tương, đỗ đen… giá của loại đỗ nào sẽ mang phần bản chất, thành phần giá trị dinh dưỡng của loại đỗ sinh ra nó. Nói chung giá đỗ tốt hơn hạt đỗ về cả chất và lượng và nó được xem là “thực phẩm của thế hệ mới” [22]. Hình 1.4. Mầm giá đỗ Giá đỗ xanh được sử dụng phổ biến vì hương vị nhẹ, vị ngọt, màu sắc đẹp và độ giòn của nó. Giá đỗ xanh được sản xuất và sử dụng trong nhiều thế kỷ, được phát triển thành một loại rau hữu ích. Nó là loại thực phẩm chứa nhiều giá trị dinh dưỡng, rất dễ trồng, đơn giản và đảm bảo vệ sinh. 1.4.2.1. Thành phần dinh dưỡng có trong giá đỗ xanh Giá đỗ giàu vitamin đặc biệt là vitamin C, khoáng chất, amino axit, protein và chất có nguồn gốc thực vật (phytochemicals), những chất cần để mầm cây phát triển, cũng là các chất bổ dưỡng cho người. Ăn giá cũng là một cách để tăng giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ dinh dưỡng của các loại đậu và ngũ cốc khác. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -16- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng có trong 104g giá đỗ [25] Thành phần dinh dưỡng Năng lượng Năng lượng của chất béo Protein Nước Threonine Isoleucine Leucine Lysine Glutamic axit Hàm lượng 31,2 g 2g 3,2g 94 g 81,1 mg 137 mg 182 mg 173 mg 167 mg Thành phần dinh dưỡng Methionine Cystine Phenylalanine Tyrosine Valine Arginine Alanine Aspartic axit Glycine Hàm lượng 35,4 mg 17,7 mg 122 mg 54,1 mg 135 mg 205 mg 103 mg 498 mg 65,5 mg Trong giá có hàm lượng chất xơ rất cao và đặc biệt là giàu hệ enzyme protease. Enzyme protease có trong mầm giá đỗ là một loại protein đặc biệt giúp tiêu hóa các chất dinh dưỡng trong thực phẩm và giúp tăng cường hoạt động của các enzyme trong cơ thể. Trong hạt đỗ khô cũng chứa enzyme protease, nhưng chỉ khi nảy mầm enzyme mới được kích thích và hoạt động mạnh mẽ. Ngoài ra trong giá đỗ còn chứa một lượng lớn enzyme như amylase, investaza. 1.4.2.2. Các điều kiện cho đỗ nảy mầm Theo các nghiên cứu đã chứng minh, hạt đỗ sau khi ngâm cho lên mầm thành giá thì giá trị dinh dưỡng có trong hạt đỗ tăng lên rất nhiều lần như vitamin B2 tăng thêm 2÷4 lần, vitamin E gấp 12 lần, vitamin B11 cũng tăng gấp 9 lần [30]. Vì vậy để cho giá nảy mầm tốt cần phải đảm bảo một số công đoạn và các điều kiện như: − Chuẩn bị nguyên liệu Trong sản xuất giá đỗ thường chọn đỗ xanh để làm giá. Tuy nhiên để có được một mẻ giá thành công trước khi ngâm ủ hạt giống cần chọn những loại hạt đạt những tiêu chuẩn sau: hạt nhỏ, đều, chắc, mẩy, loại bỏ những hạt lép, lửng, tạp chất, sâu mọt. Nên dùng loại đậu mới thu hoạch để làm giá, như vậy tỷ lệ nảy mầm của hạt sẽ cao (xấp xỉ 100%). − Rửa và ngâm hạt Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -17- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Cho hạt vào nước để loại bỏ hạt lép, lửng. Làm ướt hạt rồi xát hạt như vo gạo trong khoảng 15÷30 phút cho hạt mỏng vỏ, sau đó rửa lại bằng nước sạch, tạo điều kiện nảy mầm. Việc rửa hạt để loại bỏ hạt lép, hạt bị sâu mọt rất quan trọng, đảm bảo độ đồng đều trong khối hạt, tránh hiện tượng bốc nóng khối hạt, làm úng mầm. Khối hạt được ngâm trong nước ấm ở nhiệt độ 35÷380C trong thời gian 8÷12 giờ sau đó đem ủ. − Ủ đỗ Giá đỗ được trồng theo hai phương pháp, trồng trên cát hoặc ngâm trong nước. Theo kinh nghiệm dân gian thì đỗ được ủ và tưới nước hằng ngày mà không cần sử dụng đất giống những loại thực vật khác. − Chăm sóc đỗ sau khi ủ Trong quá trình ủ đỗ, chú ý tưới nước nhiều lần trong ngày, những ngày đầu tiên tưới nhiều lần, khoảng 5 giờ tưới một lần để mầm giá phát triển, những ngày tiếp theo tưới nước vào các buổi sáng, trưa, tối. − Kỹ thuật ra giá Sau khoảng 4÷5 ngày ủ tuỳ thời tiết, có thể ra giá. Giá được coi là tốt khi màu sắc thân giá trắng đều, mầm đỗ vàng sáng, rễ màu nâu nhạt, lá màu vàng hay xanh nhạt, chiều dài thân giá 3÷5cm, đường kính thân giá 2,5÷3mm, rễ không quá 1 cm, lá không quá 3 mm... là đạt tiêu chuẩn. [33] 1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trồng giá đỗ − Ánh sáng Giá đỗ có thể lớn lên trong điều kiện có hoặc không có ánh sáng. Trồng trong bóng tối giá có màu trắng còn nếu trồng giá có cho ánh sáng đi qua, không che chắn thì giá có màu xanh do cây quang hợp. − Độ ẩm Việc ngâm hạt trước khi nảy mầm có ảnh hưởng rất lớn, vì khi ngâm thể tích của hạt tăng lên đáng kể, quá trình nảy mầm khi lượng nước đạt 25÷30%. Các enzyme ở trạng thái “nghỉ” được “đánh thức” trở lại trạng thái hoạt động, enzyme được giải phóng tự do. Tại nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, nó hoạt động mạnh nhất phân giải các chất hữu cơ có trong hạt. Đồng thời các quá trình hóa lý, sinh hóa, lý Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -18- GVHD: KS. Bùi Viết Cường học xảy ra liên tiếp, nên lượng enzyme tăng lên đáng kể. Vì vậy, cần giữ độ ẩm vừa phải và liên tục, tránh lúc quá khô hoặc quá nhớt để đảm bảo hạt nảy mầm tốt. − Nhiệt độ Nhiệt độ đóng vai trò đặc biệt quan trọng, nó ảnh hưởng đến chuyển hóa tế bào và tốc độ tăng trưởng mầm của giá đỗ. Khi nảy mầm nhiệt độ tăng lên do sự thải nhiệt của quá trình hô hấp. Trong thời gian nảy mầm cần phải tưới nước để tránh bốc nóng khối hạt. − Không khí Oxi rất cần thiết cho sự nảy mầm vì làm tăng các quá trình oxy hóa trong hô hấp. Tuy nhiên mức cần thiết cũng rất khác nhau ở các loại cây. Đối với giá đỗ thì không cần lượng oxy quá lớn, cần tránh tạo nhiều CO 2 vì nó ức chế nảy mầm. Do đó khi ngâm ủ phải đảo khối cát, cung cấp oxy và thải bớt CO 2 tránh gây hô hấp yếm khí làm hạt thối hỏng, có mùi ê. − Thời gian trồng Thời gian trồng để đỗ dài và mập phải tối thiểu 4 ngày đêm, dụng cụ sử dụng: phải sạch sẽ và làm vệ sinh cuối mẻ trồng, tuyệt đối không bị nhiễm nấm, khuẩn, vi sinh vật. − pH môi trường pH trung tính là môi trường tốt nhất cho sự nảy mầm và phát triển của đỗ xanh. Môi trường pH có tính axit có thể làm chậm hoặc thậm chí ngăn chặn sự nảy mầm và phát triển của đỗ xanh.[21] 1.5. Phương pháp phá vỡ tế bào thực vật Việc nghiên cứu các phương pháp phá vỡ cấu trúc thực vật với mục đích xác định phương pháp tốt nhất để thu hồi enzyme protease có hoạt tính cao, ít bị biến tính, nhằm rút ngắn thời gian thu nhận, giảm chi phí thực hiện và đạt hiệu suất thu hồi cao nhất. Có rất nhiều phương pháp để phá vỡ tế bào thực vật, giải phóng enzyme như nghiền giã, xay bằng máy xay sinh tố, sóng siêu âm, lạnh đông, sử dụng dung môi hữu cơ… vì thế, việc lựa chọn phương pháp phá vỡ tế bào thích hợp có vai trò rất Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -19- GVHD: KS. Bùi Viết Cường quan trọng ảnh hưởng đến chế phẩm enzyme cần thu nhận. Trong quá trình phá vỡ tế bào, cần chú ý đến các yếu tố như nhiệt độ khi nghiền, pH của môi trường, lực cắt, thời gian thực hiện quá trình… vì chúng có ảnh hưởng đến hàm lượng protein và hoạt tính của enzyme giải phóng ra. Trong đó nhiệt độ và lực phá vỡ các liên kết, cấu trúc tế bào thực vật giải phóng enzyme là hai yếu tố quan trọng nhất. 1.5.1. Phương pháp sử dụng sóng siêu âm Sóng siêu âm có bản chất là sóng cơ học, hình thành do sự lan truyền dao động của các phần tử trong không gian, có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người. Khi tần số âm thanh đủ lớn, hiện tượng sủi bọt khí sẽ xảy ra, tạo nên vô số các vi bọt trong pha lỏng. Các bọt sẽ lớn lên trong pha dãn của sóng âm thanh và bị xẹp đi trong pha nén, bọt xẹp đi do các sóng gây sốc mạnh xuyên qua chất lỏng. Việc xẹp các bóng bọt sẽ chuyển năng lượng âm thanh thành năng lượng cơ học ở dạng các sóng gây sốc tương ứng với áp suất hàng ngàn atmosphere (300 MPa). Năng lượng này sẽ truyền chuyển động tới các bộ phận của tế bào, các tế bào sẽ bị phá vỡ khi động năng của các bộ phận này trong tế bào lớn vượt quá độ vững chắc của vách tế bào. Tuy phương pháp sử dụng sóng siêu âm là một phương pháp sử dụng phổ biến, hữu ích, dùng nhiều trong quy mô công nghiệp nhưng phương pháp này thường chỉ áp dụng cho vi sinh vật, còn đối vơi nguồn thu nhận là động vật hoặc thực vật thì ít sử dụng phương pháp này. 1.5.2. Lạnh đông, tan giá lặp đi lặp lại Khi lạnh đông chậm, trong dịch bào xuất hiện các tinh thể đá có kích thước lớn làm phá vỡ hệ thống keo do mất nước, phá hủy cấu trúc mô tế bào. Vì thế khi tan giá các chất dinh dưỡng, protein và enzyme dễ dàng thoát ra ngoài theo dịch bào, làm cho quá trình phá vỡ tế bào tốt hơn, cho hoạt tính enzyme protease cao hơn. 1.5.3. Nghiền với bột SiO2 Khi tế bào thực vật được nghiền với hạt thủy tinh thì cấu trúc tế bào thực vật Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -20- GVHD: KS. Bùi Viết Cường sẽ bị phá vỡ nhờ lực nghiền cắt giữa cối, chày va chạm với các hạt thủy tinh. Bột thủy tinh là chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và làm tăng khả năng ma sát với vật liệu. Tỷ lệ và hiệu suất giải phóng enzyme có thể thay đổi do thay đổi thời gian nghiền, tốc độ nghiền, lực nghiền và kích cỡ các hạt. 1.5.4. Dùng áp suất cao Phá vỡ tế bào bằng cách dùng áp suất cao để đẩy nguyên liệu (dịch huyền phù tế bào dưới dạng bột nhão được làm đông ở -20 0C) qua các lỗ hẹp của máy nén thì tế bào sẽ bị phá vỡ do sự thay đổi pha và thay đổi thể tích cũng như do lực cắt của các tinh thể đá. Phương pháp này có thể sử dụng để phá vỡ các tế bào nuôi cấy ở quy mô lớn. 1.5.5. Tự phân Là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng phân giải một số thành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những enzyme có trong tế bào và là của tế bào đó. Bình thường các enzyme này không hoạt động mạnh, nhưng nếu điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tế bào mà trùng với mức hoạt động tối ưu của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào, làm chết tế bào. Phương pháp này có nhược điểm vì trong quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không chỉ thủy phân các chất ở thành tế bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí các enzyme cũng bị phá hủy. Phương pháp này hiện nay không được sử dụng nhiều. 1.6. Quy hoạch thực nghiệm Bất kỳ một cuộc thí nghiệm nào cũng gồm nhiều thí nghiệm, mỗi thí nghiệm lặp nhiều lần với nhiều phép đo khác nhau. Tương ứng với sự phân chia đó có sai số của cuộc thí nghiệm, sai số của mỗi điểm thí nghiệm và sai số của phép đo. Nhiệm vụ của phép đo không chỉ để xác định giá trị của đại lượng cần đo. Mà còn ước lượng sai số khi đo. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm là vấn đề cần thiết để hiểu biết sai số của thực nghiệm, độ chính xác và độ tin cậy của phép đo. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -21- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Phân tích này gồm các bước sau : − Kiểm tra giá trị của tất cả các hệ số hồi qui bằng cách so sánh với sai số lặp lại (S bj). − Sự phù hợp giữa mô tả toán học với kết quả thực nghiệm. Trong nghiên cứu này áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo phương án trực giao cấp 2 cấu trúc có tâm. Ưu điểm của quy hoạch thực nghiệm cấp II là cung cấp thông tin tối đa để người nghiên cứu đạt được kết quả tốt nhất, nhanh nhất và rẻ nhất. Khi sử dụng phương án trực giao thì khối lượng tính toán ít, mọi hệ số trong phương trình hồi quy được xác định độc lập nhau. 1.7. Ứng dụng của enzyme protease 1.7.1. Trong công nghệ thực phẩm 1.7.1.1. Công nghiệp chế biến sữa Enzyme protease được thêm vào sữa trong suốt quá trình sản xuất phomat để làm đông tụ sữa. Dưới tác dụng của renin thu từ ngăn thứ tư dạ dày bê, casein của sữa sẽ đông tụ thành khối đặc hòa tan tạo thành khối phomat. Ngoài ra có thể sử dụng protease để thu casein kỹ thuật (từ sữa) để sản xuất vectri, chất màu, keo dán, hương liệu. 1.7.1.2. Công nghiệp chế biến thịt Để làm mềm thịt có thể sử dụng papain, bromelin, ficin, hoặc dùng protease từ hạt đậu tương nảy mầm. Tuy nhiên các enzyme này chỉ phân giải được các liên kết peptit ở vùng không xoắn của collagen. 1.7.1.3. Trong sản xuất bia Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Hệ enzyme protease được cho vào sau khi cho malt vào để thực hiện quá trình đạm hóa phân giải protein trong nguyên liệu thành các polypeptide và axit amin có giá trị trong bia. Enzyme protease còn làm trong bia và ổn định chất lượng sản phẩm, nhiều nghiên cứu cho thấy pepsin, ficin, chế phẩm enzyme protease nấm sợi và papain đều có tác dụng tốt trong quá trình ổn định chất lượng bia, trong đó papain được sử dụng nhiều hơn cả. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -22- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 1.7.1.4. Trong chế biến thủy sản Nước mắm là một thực phẩm, gia vị truyền thống giàu dinh dưỡng chứa nhiều loại axit amin đặc biệt là các axit amin không thay thế. Nhờ hệ enzyme có sẵn do hệ vi sinh vật sống trong ruột cá, các protid của cá được thủy phân thành các axit amin, peptid. Hiện nay có thể bổ sung enzyme protease bên ngoài vào để rút ngắn thời gian chế biến. Trong chế biến đồ hộp cá rán, phương pháp ướp cá với enzyme sau đó mới rán, sẽ làm cho thịt cá thơm ngon hơn, màu sắc hấp dẫn và chất lượng đồ hộp cao hơn.  Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi để: - Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. - Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bánh kẹo nhằm tăng mùi và vị của bánh, làm thức ăn chăn nuôi gia súc. 1.7.2. Trong công nghiệp da Trong công nghiệp da, enzyme protease được dùng để làm mềm da giúp rút ngắn thời gian xử lý, tránh ô nhiễm môi trường. Việc xử lý da đã được tiến hành bằng cách ngâm da trong dung dịch enzyme, hay phết dịch enzyme lên bề mặt da. Enzyme sẽ tách các chất nhờn và làm đứt một số liên kết trong phân tử collagen làm cho da mềm hơn. Hiện nay, ngoài sử dụng enzyme thu từ vi sinh vật như protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus), còn sử dụng nguồn enzyme từ thực vật như papain từ đu đủ, bromelain từ quả thơm đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng. 1.7.3. Trong công nghiệp dệt Protease được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên làm giảm độ đàn hồi, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -23- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 1.7.4. Trong công nghiệp chất tẩy rửa Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại chất tẩy rửa. Việc ứng dụng enzyme vào các chất tẩy rửa nhiều nhất là trong bột giặt chiếm khoảng 25% tổng lượng enzyme bán trên thế giới. 1.7.5. Trong y học Enzyme protease được ứng dụng rộng rãi trong y học, nó được điều chế thành dược phẩm giúp hỗ trợ tiêu hóa, chữa bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương… Enzyme protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc. Ngoài ra, còn dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh. 1.8. Tình hình nghiên cứu enzyme protease từ thực vật 1.8.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Trong những năm gần đây, nhiều tác giả trong nước đã nghiên cứu thu nhận được một số protease thực vật ở những mức độ tinh khiết khác nhau tùy theo mục đích sử dụng. Một số công trình như: − Dương Thị Hương Giang và Lê Thanh Hùng (2002), “nghiên cứu các điều kiện nhằm ổn định phương pháp tinh sạch bromelain từ nước khóm thô”. − Võ Sỹ Hùng (1995), “nghiên cứu khai thác nguồn protease từ quả bí đao, nghiên cứu tính chất và ứng dụng của chúng, từ đó tiếp tục tinh sạch protease tách từ ruột quả bí đao Việt Nam”. − Chiêm Lâm Phúc Diễn (2009), “nghiên cứu thu nhận enzyme papain để ứng dụng vào phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng”. − Ngô Kim Chi và các công sự (2010), “nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain từ phế thải chồi dứa và ứng dụng thủy phân chitosan thu oligochitosan”. − Trần Cảnh Đình, Vũ Xuân Sơn và Nguyễn Thị Hường Viện nghiên cứu hải sản (2010), “nghiên cứu chế độ thủy phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme papain và bromelain”. Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu nào nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận enzyme protease từ nguồn nguyên liệu giá đỗ tại Việt Nam. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -24- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 1.8.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Trên thế giới cũng có rất nhiều công trình nghiên cứu về enzyme protease thực vật nói chung như papain, bromelain, ficin. Đặc biệt là những công trình nghiên cứu trên nguồn nguyên liệu giá đỗ đã được nghiên cứu và phát triển từ lâu. − Năm 2001 CHEN Zhong, YANG Xiao – Quan, “nghiên cứu ảnh hưởng của enzyme protease từ mầm giá đỗ mà làm bất hoạt chất ức chế trypsin đậu nành” [24]. − Năm 2007, Mahbubar Rahman, Bangladesh, “nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính của enzyme trong suốt thời gian nảy mầm ở những giống đỗ xanh khác nhau” [13]. − Năm 2009, Rajeswari Jinka, Vadde Ramakrishna, Sridhar K Rao, “thu nhận và tinh chế enzyme cystein protease từ hai lá mầm của giống đỗ Horse Gram ở Ấn Độ” [33]. − Năm 2010 Seenvivasan, Roopa, Geetha, “nghiên cứu thu nhận và tinh chế đặc tính kháng khuẩn của enzyme papain từ đủ đu” [32]. − Năm 2011, Syed Adil Ahah và các cộng sự, “nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nảy mầm đến giá trị dinh dưỡng của giống đỗ xanh” [19]. Vì vậy, nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ nguồn nguyên liệu giá đỗ có một vai trò rất lớn nhằm tạo ra chế phẩm enzyme có hoạt tính tốt và giá thành rẻ đáp ứng cho các yêu cầu khác nhau. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Hạt đỗ xanh ủ theo các điều kiện nhiệt độ và thời gian được khảo sát. 2.1.2. Các loại hóa chất sử dụng − Tyrosine, thuốc thử Folin Ciocanto của hãng Merck, độ tinh khiết 100%. − Casein từ sữa của Nhật, độ tinh khiết ≥ 98% − Tricloacetat, Na2CO3, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4 độ tinh khiết ≥ 99% của Trung Quốc. − Bột nghiền thủy tinh SiO2 của Trung Quốc. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -25- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 2.1.3. Các máy móc thiết bị phân tích Cân kỹ thuật điện tử, máy đo pH OaKaton (Châu Âu), máy ly tâm EBA 20 Hettich (Đức), máy đo quang phổ UV-VIS Agilent technologies Cary 60 (Singapore). Và một số dụng cụ, máy móc thiết bị thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm như ống nghiệm, bình tam giác, đũa khuấy, phễu lọc, pipet, cốc, giấy lọc, giá đựng ống nghiệm. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vật lý Tiến hành thu nhận dịch chứa enzyme bằng các phương pháp vật lý sau: 2.2.1.1. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp lạnh đông, tan giá nhiều lần rồi nghiền với lượng bột SiO2 không đổi. Giá ủ sau 4 ngày được lạnh đông bằng tủ đá ở nhiệt độ < 0 oC, rồi rã đông lặp đi lặp lại với số lần lần lượt từ 1÷8 lần, đem nghiền với khối lượng bột SiO 2 không đổi, bằng khối lượng mẫu giá ủ. Mỗi mẫu được nghiền trong thời gian 15 phút, giữ ổn định nhiệt độ trong quá trình nghiền mẫu bằng cách để cối trong thau nhựa chứa đá lạnh khi nghiền mẫu. Thêm vào đó đệm phosphat pH = 7 để ổn định enzyme (1 : 3 w/v). Lọc để tách căn bằng vải lọc thô, sau đó đem ly tâm ở 5500 vòng/phút trong 20 phút. Đem xác định hoạt tính của enzyme protease. 2.2.1.2. Phá vỡ tế bào bằng cách lạnh đông, tan giá số lần nhất định rồi nghiền với lượng bột SiO2 thay đổi Giá ủ sau 4 ngày đem lạnh đông, tan giá số lần nhất định rồi nghiền với lượng bột SiO2 thay đổi từ 40%; 60%; 80%; 100%; 120%; 140%; 160%; 180% so với khối lượng mẫu giá ủ. Mỗi mẫu được nghiền trong thời gian 15 phút, giữ ổn định nhiệt độ trong quá trình nghiền mẫu bằng cách đặt cối trong thau nhựa chứa đá lạnh khi nghiền mẫu. Thêm vào đó đệm phosphat pH = 7 để ổn định enzyme (1 : 3 w/v). Lọc để tách cặn bằng vải lọc thô, sau đó đem ly tâm ở 5500 vòng/phút trong 20 phút. Đem xác định hoạt tính của enzyme protease. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -26- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 2.2.2. Phương pháp hóa lý Đo định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Amamo 2.2.2.1. Nguyên tắc Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme. Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino axit tương đương với 100µg tyrosine trong 1µl dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. 2.2.2.2. Cách tiến hành Pha dung dịch tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100µg tyrosin/ml HCl 0,1M. Thêm 5ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào 1ml dung dịch tyrosin (các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm 1ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37 (± 0,5) oC trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660nm. Ghi nhận kết quả As10; As20; As30;…As100. 2.2.2.3. Xây dựng đường chuẩn tyrosine: Dùng 1ml axit HCl 0,1M thay cho tyrosin, đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660nm (ghi nhận kết quả này làm đối chứng As 0). Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ được giá trị ABS 1 đến ABS10. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của ABS theo nồng độ protein. Đồ thị này gọi là đường chuẩn tyrosine. Ống nghiệm Đối chứn g 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nồng độ (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -27- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Dung dịch tyrosine chuẩn (µl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung dịch HCl (µl) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 900 Dung dịch Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử Folin (ml ) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Xác định hoạt tính enzyme protease Cho 1ml dung dịch cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 37 0C trong 10÷15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme vào và lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở nhiệt độ 37 0C trong 60 phút. Cho vào hỗn hợp này ml dung dịch axit trichloracetic 0,4M (TCA), để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Cho 5ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào 1ml dịch lọc, thêm 1ml thuốc thử folin vào dung dịch hỗn hợp này, trộn đều để yên ở 37 0C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660nm. Mẫu đối chứng: lấy 1ml dung dịch đệm pH = 7 thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự như ở mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ hấp thụ ở bước sóng 660nm (A0). Tính toán Hàm lượng tyrosin được giải phóng do enzyme protease thủy phân được tính bằng cách lấy (Am – A0) rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt độ protease theo công thức sau: Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am- A0).F.n 100 (2.1) (Am – A0).F.n.V Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế M.100 SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -28- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Hoạt tính enzyme protease ( ĐVHT/g) = (2.2) Trong đó: F là lượng tyrosine có trong đường chuẩn (µg) Am Độ hấp thụ của mẫu A0 Độ hấp thụ của mẫu đối chứng n hệ số pha loãng của enzyme 1/100 hệ số chuyển đổi M Khối lượng chế phẩm enzyme thô. 2.2.3. Xây dựng mô hình thống kê thực nghiệm 2.2.3.1. Dạng phương trình hồi quy Mô hình toán của quá trình chọn là : x12 - x 22 Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 + b11 + b22 (2.3) Trong đó: x1, x2 là 2 yếu tố ảnh hưởng. b0 là hệ số tự do. b1, b2 là các hệ số tuyến tính. b12 là hệ số tương tác cặp. b11, b22 là hệ số tương tác bậc hai. Các hệ số đặc trưng cho ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình. Sau khi đổi biến mới phương trình hồi quy có dạng y%= b '0 + b1x1 + b 2 x 2 + b12 x1x 2 + b1' x1' + b '2 x '2 (2.4) 2.2.3.2. Công thức tính hệ số b trong phương trình 2.4 N 1 N b'0 = ∑ y u x 0u N u =1 bj = ; N ∑ yu x ju u =1 N ∑x u =1 bij = 2 ju ; N ∑ yu x iu x ju u =1 N ∑ (x u =1 ju b 'j = x iu ) 2 ; ∑y x ' ju ∑ (x ) u =1 N u =1 u ' 2 ju ; (2.5) Trong đó : i # j = 1,2; u= 1,2,3…9. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -29- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 2.2.3.3. Công thức tính phương sai của các hệ số bj trong phương trình 2.4 Sbo = ' Sth N ∑x u =1 Sb = ' j Sb = 0u j ; Sth 2 + 2α k Sb = 2 ij ; Sth 2k ; Sth 2k (1 − x 2j ) 2 + 2(α 2 − x 2j ) + (2k − 2 + n 0 )(x 2j ) 2 (2.6) 2.2.4. Kiểm định thống kê 2.2.4.1. Kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy Biết được phương sai tái hiện ta kiểm tra tính có nghĩa của hệ số b trong phương trình 2.4 theo chuẩn Student. t tn = bj Sb j (2.7) − Tra bảng để tìm chuẩn tb = t(p,f). (P là mức ý nghĩa thường lấy p = 0.05; f = m-1 là bậc tự do tương ứng phương sai tái hiện.) − So sánh ttn và tb để tìm ra các hệ số b có nghĩa. − Viết phương trình hồi quy với các hệ số b có nghĩa. x 'ju = x 2ju − x 2ju − Đổi biến trở lại bằng cách thay vào phương trình (2.4) để phương trình hồi quy trở lại (2.3). 2.2.4.2. Kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm − Viết phương trình hồi quy với các hệ số có nghĩa. S2 Ftn = 2tt Sth − Tính Ftn theo công thức : (2.8) Trong đó : S2tt : là phương sai tương thích, được tính theo công thức Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -30- N S2tt = S2th ∑ (y u =1 u GVHD: KS. Bùi Viết Cường − y%u ) 2 N−L (2.9) : là phương sai tái hiện, được tính theo công thức S2th = 1 m (yi − yi ) 2 ∑ m − 1 i=1 (2.10) − Fb tra bảng Fb(P,f1,f2) tức là ứng với mức ý nghĩa P đã chọn và bậc tự do f1, f2. − Tiêu chuẩn kiểm định ( so sánh Ftn và Fb) Nếu Ftn < Fb thì phương trình hồi quy vừa lập phù hợp với thực nghiệm tức là phương trình mô tả đúng quá trình thực nghiệm và phương trình hồi quy vừa lập có thể sử dụng để tìm kiếm tối ưu. Ngược lại, nếu Ftn > Fb thì phương trình hồi quy vừa lập không phù hợp với thực nghiệm. 2.2.4.3. Tìm nghiệm tối ưu Chuyển phương trình hồi quy vừa lập phù hợp với thực nghiệm về biến thực, áp dụng công thức: xj = Z j − Z0j λj Mô hình tương thích được sử dụng phần mềm Excel – Solver để tìm kiếm tối ưu. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -31- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định số lần lạnh đông, tan giá tối ưu để thu được enzyme protease có hoạt lực cao nhất 3.1.1. Tiến hành Cân 80g giá ủ, chia đều mẫu vào 8 cốc rồi tiến hành đem lạnh đông, tan giá các mẫu lặp đi lặp lại với số lần lần lượt từ 1÷8 lần, sau đó đem nghiền với khối lượng bột SiO2 bằng khối lượng mẫu giá ủ trong mỗi cốc. Thời gian nghiền mỗi mẫu là 15 phút, trong quá trình nghiền có làm lạnh để ổn định nhiệt độ bằng cách để cối trong thau nhựa chứa đá lạnh khi nghiền mẫu. Thêm vào đó đệm phosphate pH=7 để ổn định enzyme (1:3w/v). Lọc để tách cặn bằng vải lọc thô, sau đó đem ly tâm ở 5500 vòng/phút trong 20 phút, rồi đem xác định hoạt tính. 3.1.2. Kết quả thí nghiệm Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hoạt tính enzyme protease theo số lần lạnh đông, tan giá. 3.1.3. Nhận xét đồ thị Qua đồ thị hình 3.1, nhìn chung với số lần lạnh đông, tan giá tăng dần từ 1÷8 lần thì hoạt độ của enzyme protease giảm. Từ lần lạnh đông, tan giá 1 đến lần 2 hoạt tính enzyme tăng đều từ 4,12÷6,30 (UI/ml). Từ lần lạnh đông, tan giá 2 trở đi hoạt tính enzyme giảm, cụ thể giảm từ 6,30÷1,05 (UI/ml) ứng với lần lạnh đông, tan giá thứ 8. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở lần lạnh đông, tan giá thứ 2 (6,3 UI/ml), cao gấp 6 lần so với giá trị thấp nhất ở lần số 8 (1,05 UI/ml). 3.1.4. Giải thích kết quả thí nghiệm Trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân, Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -32- GVHD: KS. Bùi Viết Cường microsome, ty thể, lysosome…) của tế bào. Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng. Các phân tử enzyme có kích thước lớn, không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử tế bào. Do đó để có thể thu nhận các enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào. Từ lần lạnh đông, tan giá thứ 1 đến lần thứ 2, khi lạnh đông chậm, trong dịch bào xuất hiện các tinh thể đá có kích thước lớn làm phá vỡ hệ thống keo do mất nước, phá vỡ cấu trúc thành tế bào. Vì thế khi tan giá các chất dinh dưỡng, protein và enzyme dễ dàng thoát ra ngoài theo dịch bào, làm cho quá trình phá vỡ tế bào tốt hơn, cho hoạt tính enzyme protease cao hơn. Từ lần lạnh đông tan giá thứ 2 trở đi hoạt tính enzyme bắt đầu giảm là do khi lạnh đông, tan giá nhiều lần gây ra hiện tượng tái lập tinh thể, nên các tinh thể băng tập trung ở gian bào với kích thước ngày càng lớn, gây tác động cơ học giữa các tinh thể băng trong và ngoài tế bào làm phá vỡ cấu trúc enzyme, làm biến tính protein ở mức độ lớn. Sự biến tính thường đi kèm với việc mất đi hoạt tính sinh học của enzyme nên hoạt tính enzyme giảm dần. [12] 3.2. Xác định khối lượng bột nghiền SiO2 cần thiết sử dụng trong quá trình phá vỡ mầm giá đỗ để thu được enzyme protease có hoạt lực cao nhất 3.2.1. Tiến hành Cân 80g giá ủ, chia đều mẫu vào 8 cốc tiến hành đem lạnh đông, tan giá 2 lần, rồi nghiền với bột SiO2 có khối lượng thay đổi từ 40%; 60%; 80%; 100%; 120%; 140%; 160%; 180% so với khối lượng mẫu giá ủ. Thời gian nghiền mỗi mẫu là 15 phút, trong quá trình nghiền có làm lạnh để ổn định nhiệt độ bằng cách để cối trong thau nhựa chứa đá lạnh khi nghiền mẫu. Thêm vào đó đệm phosphate pH=7 để ổn định enzyme (1:3w/v). Lọc để tách cặn bằng vải lọc thô, sau đó đem ly tâm ở 5500 vòng/phút trong 20 phút, đem mẫu đi xác định hoạt tính. 3.2.2. Kết quả thí nghiệm Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hoạt tính enzyme theo khối lượng bột Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -33- GVHD: KS. Bùi Viết Cường SiO2 sử dụng để nghiền. 3.2.3. Nhận xét đồ thị Qua đồ thị hình 3.2, nhìn chung khi nghiền với lượng bột SiO 2 tăng dần từ 40÷180% so với khối lượng của mẫu giá thì hoạt độ enzyme protease tăng. Hoạt tính của enzyme protease tăng chậm từ 40% đến 100%, cụ thể tăng từ 5,65÷6,21 (UI/ml); tăng đều từ 100÷140%, cụ thể tăng từ 6,21÷8,57 (UI/ml). Từ 140% trở lên hoạt tính enzyme bắt đầu giảm, trong đó từ 140÷160% giảm chậm từ 8,57÷8,42 (UI/ml), từ 160 đến 180% giảm nhanh từ 8,42÷5,71 (UI/ml). Hoạt tính enzyme đạt cực đại khi nghiền với lượng bột SiO 2 bằng 140% so với khối lượng mẫu giá ủ (8.57 UI/ml), cao gấp 1,5 lần so với cực tiểu khi nghiền với lượng bột SiO 2 bằng 180% so với khối lượng mẫu giá ủ (5,71 UI/ml). 3.2.4. Giải thích kết quả thí nghiệm Khi tế bào thực vật được nghiền với hạt thủy tinh thì cấu trúc tế bào thực vật sẽ bị phá vỡ nhờ lực cắt do va chạm của cối, chày với các hạt thủy tinh. Bột thủy tinh là chất vô cơ, không tham gia vào phản ứng. Tỷ lệ và hiệu suất giải phóng enzyme có thể thay đổi khi thay đổi thời gian nghiền, tốc độ nghiền, lực nghiền, kích thước hạt và số lượng các hạt thủy tinh sử dụng. Từ 40÷140% hoạt lực enzyme thu nhận được tăng là do khi nghiền, lực ma sát sinh ra bởi sự va chạm giữa cối, chày và các hạt thủy tinh với tế bào làm cho cấu trúc màng tế bào bị phá vỡ, giải phóng lượng lớn enzyme protease ra bên ngoài. Từ 140÷180% hoạt lực enzyme giảm là do khi khối lượng bột thủy tinh quá lớn, lực ma sát tăng lên mạnh thì ngoài cấu trúc tế bào bị phá vỡ thì cấu trúc enzyme cũng bị phá hủy và biến tính. 3.3. Tối ưu hóa quá trình phá vỡ tế bào mầm giá đỗ với 2 biến: lạnh đông, tan giá và lượng bột SiO2 3.3.1. Đặt vấn đề công nghệ và lập phương án thực nghiệm Để xây dựng mô tả toán học cho quá trình phá vỡ cấu trúc và tế bào thực vật thu nhận được enzyme có hoạt độ cao nhất, ở đây chọn qui hoạch thực nghiệm trực giao cấp II, với 2 yếu tố ảnh hưởng (k = 2). Sau khi làm thí nghiệm thăm dò tôi đã Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -34- GVHD: KS. Bùi Viết Cường chọn điều kiện thí nghiệm, mức các yếu tố (mức trên, mức dưới, mức cơ sở, mức *). Bảng 3.1. Mức, khoảng biến thiên của các yếu tố Các mức Yếu tố Z1, số lần Z2, g Mức * +α 3 16 Mức trên (+1) 3 16 Khoảng biến thiên Mức cơ sở (0) 2 14 Mức dưới (-1) 1 12 Mức * -α 1 12 1 2 Từ phương án đã chọn và điều kiện thí nghiệm ở bảng 3.1 ta xây dựng được ma trận thực nghiệm cấp II, cấu trúc có tâm, k = 2 (bảng 3.2). Trong đó : 2k = 4: số thí nghiệm tại nhân phương án. 2*k = 4: số thí nghiệm điểm sao. n0 = 1: số thí nghiệm tại tâm. x1,x2 : biến mã hóa tại các mức cao, thấp, tâm và các điểm sao. Y là hàm mục tiêu. α cánh tay đòn “sao”. Số thí nghiệm cần thực hiện: N = 2k + 2*k + n0 = 9. - Bảng 3.2. Ma trận thực nghiệm cấp II cấu trúc có tâm (k = 2) Phương án 2k 2*k n0 STN x1 x2 x1x2 x12 x22 Y 1 2 3 4 5 6 7 8 9 + + +α -α 0 0 0 + + 0 0 +α -α 0 + + 0 0 0 0 0 + + + + α2 α2 0 0 0 + + + + 0 0 α2 α2 0 y1 y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 3.3.2. Tổ chức thí nghiệm theo phương án qui hoạch trực giao cấp II Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần lạnh đông, tan giá và khối lượng bột nghiền SiO2 đến hoạt độ của enzyme ta tiến hành 9 thí nghiệm. Hai thông số cần khảo sát là số lần lạnh đông, tan giá từ 1÷3 và khối lượng SiO2 từ 12÷16g. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -35- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Với k = 2 ta có α2 = 1, vậy α = ±1. Để phương án trực giao, cần phải tiến hành đổi biến cột x1' và x2' x12 x22 , ở bảng 2 thành theo công thức: 2 3   2 ' 2 x2 = x2 − 3  x1' = x12 − Từ cách chọn phương án và điều kiện thí nghiệm, ta lập ma trận trực giao cấp II và làm thí nghiệm theo ma trận kết quả biểu diễn ở bảng 3.3. Trong đó: - x1 : là biến mã của số lần lạnh đông, tan giá. x2 : là biến mã của khối lượng SiO2. y1: là hoạt độ của enzyme, UI. Thí nghiệm 9,10,11 là 3 thí nghiệm ở tâm phương án. Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm theo ma trận trực giao cấp II (k = 2) STT x0 x1 x2 x1x2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 + + + + + + + + + + + + + +α -α 0 0 0 0 0 + + 0 0 +α -α 0 0 0 + + 0 0 0 0 0 0 0 x1' x '2 y1 7,024 7,900 8,616 7,224 8,071 8,547 8,141 7,603 7,910 7,824 7,904 Từ kết quả ở bảng 3.3 ta nhận thấy, mỗi một tổ hợp thí nghiệm đều có ảnh hưởng đến quá trình phá vỡ tế bào mầm giá đỗ thu nhận enzyme protease. Sự biến thiên về số lần lạnh đông, tan giá và khối lượng SiO 2 sẽ dẫn đến những thay đổi về Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -36- GVHD: KS. Bùi Viết Cường % y hoạt độ của enzyme. Từ kết quả đó ta xây dựng hàm mục tiêu . 3.3.3. Xây dựng mô tả toán học cho hàm mục tiêu hoạt độ enzyme y. 3.3.3.1. Chọn mô tả toán học % b11x12 +b 22 x 22 y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 + (3.5) Phương trình hồi quy đổi biến có dạng: % y b '0 b1' x1' +b'2 x '2 = + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 + (3.6) Xác định hệ số b trong phương trình (3.6) Hệ số b trong PTHQ (3.6) xác định theo công thức (2.5) và có giá trị như 1. sau: b '0 b12 = -0,567 = 7,893 b1' b1 = -0,165 b '2 b2 = 0,242 = 0,012 = -0,425 2. Kiểm tra ý nghĩa của các hệ số b − Để kiểm tra mức ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy, sử dụng chuẩn Student. Hệ số có nghĩa nếu: bj Sbj − tj= ≥ t ( p,f) tj : chuẩn Student tính toán tương ứng với hệ số thứ j. bj : là hệ số trong phương trình hồi quy (3.6). So sánh tj với t (p,f). + t(p,f) là chuẩn Student tra bảng ứng với p = 0,05 và bậc tự do f = n0 – 1. + Sbj là độ lệch chuẩn số số bj, Sbj được xác định theo công thức (2.6). + Xác định phương sai tái hiện ta sử dụng kết quả của 3 thí nghiệm tại tâm (9,10,11) trong bảng 3.3 : y10 = 7,910; y20 = 7,824; y30 = 7,904. + Hoạt độ enzyme trung bình ở tâm là: Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -37- 3 y ∑y 0 0 i i =1 = + GVHD: KS. Bùi Viết Cường = 7,879. Phương sai tái hiện S2th là : 3 ∑(y i =1 0 i − y 0 )2 f th 2 Sth = = 0,002305 fth: bậc tự do tương ứng với phương sai tái hiện, f = 3-1=2 + Áp dụng công thức (2.6) ta xác định được độ lệch tiêu chuẩn của chuẩn số bj là: Sb ' 0 = 0,0160 Sbij = 0,0240 Sb jj ' Sbj = 0,0196 + = 0,0339 Chuẩn Student ( ttn) tương ứng với mỗi hệ số được tính theo công thức (2.7), có giá trị như sau: t0 = 493,163 t12 = -23,618 t1' t1 = -8,435 t '2 t2 = 12,363 + = 0,363 = -12,508 Tra bảng phụ lục [13] ; t(p,f) = t (0,05;2) = 4,3. So sánh ttn và tb ta có t1' < tb nên hệ số b1' bị loại khỏi phương trình hồi quy. + Vậy phương trình hồi quy có dạng: ' y% = 7,893 – 0,165x1 + 0,242x2 – 0,567x1x2 – 0,425 + x '2 (3.7) Để đổi biến trở lại ta thay vào phương trình (3.7): x2' = x22 − 2 3 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -38- GVHD: KS. Bùi Viết Cường y% Được : = 8,173 – 0,165x1 +0,242x2 – 0,567x1x2 – 0,425 x 22 (3.8) 3. Kiểm định sự phù hợp của phương trình (3.8) với thực nghiệm − Sự tương thích của phương trình với thực nghiệm được kiểm định theo tiêu chuẩn Fisher (F). Stt2 Sth2 Ftn = Trong đó: Stt2 : là phương sai dư, được tính theo công thức (2.9), và số liệu bảng 3.4 N Stt2 = yu y% u f du ∑( y u u =1 2 − y% ui ) f du : giá trị thực nghiệm tại thí nghiệm thứ u được ghi ở bảng 3.3 : giá trị tính theo phương trình hồi quy ứng với giá trị thứ u. : bậc tự do để tính phương sai dư : f du =N–L=9–5=4 N : số thí nghiệm trong mỗi phương án, N = 9 L : số hệ số có nghĩa trong phương trình, L = 5. Bảng 3.4. Giá trị để tính S2tt N yu y%u y u − y%u 1 2 3 4 5 6 7,024 7,900 8,616 7,224 8,071 8,547 7,104 7,908 8,722 7,258 8,008 8,338 0,080 0,008 0,106 0,034 0,063 0,209 ( yi − y%u )2 0,0064 0,000064 0,011 0,001 0,004 0,044 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp 7 8 9 -39- 8,141 7,603 7,910 GVHD: KS. Bùi Viết Cường 7,990 7,506 8,173 0,151 0,097 0,263 0,023 0,009 0,069 Thay các giá trị vào ta tính được kết quả: S2tt = 0,042. Ftn = + S2tt S2th = 18,206. F(P;f1;f2) : giá trị tra bảng của chuẩn số Fisher ứng với độ tin cậy p = 0,05. f1 = 4 (bậc tự do để tính phương sai dư). f2 = 2 (bậc tự do để tính phương sai tái hiện). Tra bảng ta được F(0,05;4;2) = 19,3. + So sánh Ftn và Fb Vậy phương trình (3.8) đã chọn phù hợp với mô hình thực nghiệm. 3.3.4. Tìm nghiệm tối ưu − Chuyển PTHQ (3.8) về biến thực, áp dụng công thức : Z j − Z0j xj = λj Ta được : y = -21,919 + 3,811  Z1 + 3,657 Z2 – 0,284 Z1Z2 - 0,106 Z22 Sử dụng Excel - solver tìm được Ymax = 8,724 khi Z1 = 1 và Z2 =16 g. Tức là khi lạnh đông, tan giá 1 lần và sử dụng khối lượng bột SiO 2 bằng 160% khối lượng mẫu giá đỗ thì sẽ phá vỡ cấu trúc thực vật và tế bào cho enzyme thu nhận được có hoạt lực cao nhất, đạt 8,721UI/ml. Theo bảng kết quả thực nghiệm 3.3 thì hoạt độ enzyme protease cũng đạt giá trị cực đại tại lần lạnh đông, tan giá thứ 1và sử dụng khối lượng bột SiO 2 bằng 160% khối lượng mẫu giá đỗ, đạt 8,616 UI/ml. Có sự chênh lệch 1,592 UI/ml giữa 2 kết quả, nguyên nhân có thể do mức độ tinh sạch của hóa chất và thao tác của người nghiên cứu trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -40- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 3.4. Xác định thời gian tối ưu trồng giá đỗ để thu được enzyme protease có hoạt lực cao nhất 3.4.1. Tiến hành Tiến hành ngâm hạt đỗ xanh trong 10h, rồi ủ đỗ xanh trong 6 ngày ở nhiệt độ 350C, độ ẩm không khí 85%. Cứ sau mỗi khoảng thời gian cách nhau 12h ta sẽ thu nhận 1 mẫu mầm giá. Lần lượt thực hiện phá vỡ tế bào bằng phương pháp lạnh đông, tan giá 1 lần rồi nghiền với khối lượng bột SiO2 bằng 160% so với khối lượng mẫu mầm giá. Thời gian nghiền mỗi mẫu là 15 phút, trong quá trình nghiền có làm lạnh để ổn định nhiệt độ quá trình nghiền bằng cách để cối trong thau nhựa chứa đá lạnh đông khi nghiền mẫu. Thêm vào đó đệm phosphate pH=7 để ổn định enzyme (1:3w/v). Lọc để tách cặn bằng vải lọc thô, sau đó đem ly tâm ở 5500 vòng/phút trong 20 phút, đem xác định hoạt tính. Hình 3.3. Hình thái của mầm giá đỗ theo thời gian nảy mầm. 3.4.2. Kết quả thí nghiệm Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -41- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hoạt tính enzyme theo thời gian trồng. 3.4.3. Nhận xét đồ thị Qua đồ thị hình 3.4, nhìn chung sau 144h trồng giá đổ thì hoạt tính enzyme giảm, cụ thể từ 5,4÷2,29 (UI/ml). Hoạt tính enzyme tăng mạnh từ 24h đến 48h, cụ thể tăng từ 5,4÷ 11,37 (UI/ml). Từ sau 48h hoạt tính enzyme giảm đều đến 84h, cụ thể từ 11,37÷6,54 (UI/ml). Sau 84h hoạt tính enzyme giảm nhẹ, cụ thể từ 6,54÷2,29 (UI/ml). Tại thời gian ủ sau 48h cho hoạt tính enzyme protese cao nhất (11,37 UI/ml), cao gấp 5 lần so với tại thời điểm ủ ở 144h (2,29 UI/ml). 3.4.4. Giải thích kết quả thí nghiệm − Từ 24÷48h hoạt tính enzyme protease tăng mạnh vì sau khi hạt đỗ được ủ trương nước, lúc này hệ enzyme trong hạt được kích hoạt chuyển từ “trạng thái ngủ” sang trạng thái hoạt động, hàm lượng tăng lên đáng kể để phân giải các hợp chất dự trữ trong hạt như tinh bột, protein tạo ra các chất trung gian sinh tổng hợp và năng lượng cung cấp cho sự phát triển của phôi, sự lớn lên của mầm cây. − Sau 48h hoạt tính enzyme giảm vì khi đó các hợp chất dự trữ hầu như đã được phân giải và cạn kiệt, cây đã bắt đầu xuất hiện rễ, 2 lá mầm và xảy ra những quá trình như quang hợp để tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển của cây. − Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Mahbubar [13] và Ghavidel [22], hoạt tính của enzyme tăng mạnh sau ủ đỗ từ ngày 1 đến ngày 2 và giảm ở các ngày tiếp theo. 3.5. Xác định nhiệt độ tối ưu trồng giá đỗ để thu được enzyme protese có hoạt lực cao nhất. 3.5.1. Tiến hành Tiến hành ngâm hạt đỗ xanh trong nước sạch 10 giờ, rồi ủ đỗ xanh ở nhiệt độ từ 20÷440C, độ ẩm không khí 85%. Ủ mỗi mẫu đỗ cách đều nhau một khoảng liên tục là 40C, sau 2 ngày ta sẽ thu nhận 1 mẫu mầm giá. Lần lượt thực hiện phá vỡ tế bào bằng phương pháp lạnh đông, tan giá 1 lần rồi nghiền với khối lượng bột SiO 2 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -42- GVHD: KS. Bùi Viết Cường bằng 160% so với khối lượng mẫu mầm giá. Thời gian nghiền mỗi mẫu là 15 phút, trong quá trình nghiền có làm lạnh để ổn định nhiệt độ quá trình nghiền bằng cách để cối trong thau nhựa chứa đá lạnh khi nghiền mẫu. Thêm vào đó đệm phosphate pH=7 để ổn định enzyme (1:3w/v). Lọc để tách cặn bằng vải lọc thô, sau đó đem ly tâm ở 5500 vòng/phút trong 20 phút, rồi đem xác định hoạt tính. Hình 3.5. Hình thái của mầm giá đỗ theo nhiệt độ nảy mầm. 3.5.2. Kết quả thí nghiệm Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hoạt tính enzyme theo nhiệt độ trồng. 3.5.3. Nhận xét đồ thị Qua đồ thị hình 3.6, nhìn chung khi nhiệt độ trồng tăng dần từ 20÷440C thì hoạt tính enzyme protease tăng, cụ thể từ 3,59÷7,23 (UI/ml). Từ 20÷240C hoạt tính enzyme protease tăng nhanh từ 3,59÷7,47 (UI/ml); hoạt tính enzyme protese tăng đều từ 24÷320C từ 7,47÷11,39 (UI/ml); hoạt tính enzyme tăng chậm từ 32÷360C từ Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -43- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 11,39÷11,48 (UI/ml). Sau 360C hoạt tính của enzyme giảm đều, cụ thể từ 11,48 (UI/ml) xuống còn 7,23 (UI/ml) tại 440C. Tại thời gian ủ ở 360C cho hoạt tính enzyme protese cao nhất (11.48 UI/ml), cao gấp 1,6 lần so với giá đỗ ủ sau 2 ngày ở 440C (7,23 UI/ml). 3.5.4. Giải thích kết quả thí nghiệm − Từ 20÷360C hoạt tính enzyme protease liên tục tăng do hạt đỗ xanh thích hợp cho sự nảy mầm ở các nhiệt độ không quá cao, khi mầm phát triển tốt và nằm trong khoảng nhiệt độ tối ưu cho cystein protease hoạt động nên tại điểm khảo sát 36 0C ta thu được enzyme có hoạt lực cao nhất. − Từ 36÷440C hoạt tính enzyme protease giảm do đây là nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển nhanh chóng của mầm và mầm đã phát triển thành lá mầm và rễ, các chất dự trữ protein gần như đã được phân hủy, hệ enzyme không còn hoạt động mạnh nữa. − Kết quả này được giải thích dựa trên cơ sở các nghiên cứu của Xiafei Zhang [21]; Amrita Srimany[23]. 3.6. Tối ưu hóa điều kiện trồng giá với 2 biến: thời gian và nhiệt độ. 3.6.1. Đặt vấn đề công nghệ và lập phương án thực nghiệm Để xây dựng mô tả toán học cho điều kiện trồng giá để thu nhận enzyme có hoạt độ cao nhất, ở đây ta chọn qui hoạch thực nghiệm trực giao cấp II, với 2 yếu tố ảnh hưởng (k = 2). Sau khi làm thí nghiệm thăm dò tôi đã chọn điều kiện thí nghiệm, mức các yếu tố (mức trên, mức dưới, mức cơ sở, mức *). Bảng 3.5. Mức, khoảng biến thiên của các yếu tố Các mức Yếu tố Z1, h Z2, 0C Mức * +α 60 40 Mức trên (+1) 60 40 Mức cơ sở (0) 48 36 Khoảng biến thiên Mức dưới (-1) 36 32 Mức * -α 36 32 12 4 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -44- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Từ phương án đã chọn và điều kiện thí nghiệm ở bảng 3.5 ta xây dựng được ma trận thực nghiệm cấp II, cấu trúc có tâm, k = 2 (bảng 3.6). Bảng 3.6. Ma trận thực nghiệm cấp II cấu trúc có tâm (k = 2) Phương án 2k 2*k n0 STN x1 x2 x1x2 x12 x22 Y 1 2 3 4 5 6 7 8 9 + + +α -α 0 0 0 + + 0 0 +α -α 0 + + 0 0 0 0 0 + + + + α2 α2 0 0 0 + + + + 0 0 α2 α2 0 y1 y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 Trong đó : - 2k = 4: số thí nghiệm tại nhân phương án. 2*k = 4: số thí nghiệm điểm sao. n0 = 1: số thí nghiệm tại tâm. x1, x2 : biến mã hóa tại các mức cao, thấp, tâm và các điểm sao. y là hàm mục tiêu. α cánh tay đòn “sao”. Số thí nghiệm cần thực hiện: N = 2k + 2*k + n0 = 9. 3.6.2. Tổ chức thí nghiệm theo phương án qui hoạch trực giao cấp II Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện trồng giá đến hoạt độ của enzyme ta tiến hành 9 thí nghiệm. Hai thông số cần khảo sát là thời gian trồng từ 36÷ 60 (h) và nhiệt độ trồng từ 32 ÷400C. Với k = 2 ta có α2 = 1, vậy α = ±1. Để phương án trực giao, cần phải tiến hành đổi biến cột x1' và x2' x12 x22 , ở bảng 2 thành theo công thức: Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -45- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 2 3   2 ' 2 x2 = x2 − 3  x1' = x12 − Từ cách chọn phương án và điều kiện thí nghiệm, ta lập ma trận trực giao cấp II và làm thí nghiệm theo ma trận kết quả biểu diễn ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Kết quả thí nghiệm theo ma trận trực giao cấp II (k = 2) STT x0 x1 x2 x1x2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 + + + + + + + + + + + + + +α -α 0 0 0 0 0 + + 0 0 +α -α 0 0 0 + + 0 0 0 0 0 0 0 x1' x '2 y2 11,22 10,94 12,10 11,50 10,8 11,24 12,33 11,61 11,52 11,45 11,51 Trong đó: - x1 : là biến mã của thời gian trồng giá. x2 : là biến mã của nhiệt độ trồng giá. y2: là hoạt độ của enzyme, UI. Thí nghiệm 9,10,11 là 3 thí nghiệm ở tâm phương án. 3.6.3. Xây dựng mô tả toán học cho hàm mục tiêu hoạt độ enzyme y. Chọn mô tả toán học % b11x12 +b 22 x 22 y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 + (3.9) Phương trình hồi quy đổi biến có dạng: % y 1. b '0 b1' x1' +b'2 x '2 = + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 + (3.10) Xác định hệ số b trong phương trình (3.6) Hệ số b trong phương trình hồi quy (3.10) xác định theo công thức (2.5) và có Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -46- GVHD: KS. Bùi Viết Cường giá trị như sau: b '0 b12 = -0,08 = 11,47 b1' b1 = -0,22 b '2 b2 = 0,36 = -0,52 = 0,43 2. Kiểm tra ý nghĩa của các hệ số b − Để kiểm tra mức ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy sử dụng chuẩn Student. Hệ số có nghĩa nếu: bj Sbj tj= ≥ t ( p,f) tj : chuẩn Student tính toán tương ứng với hệ số thứ j. bj : là hệ số trong phương trình hồi quy (3.10). − So sánh tj với t (p,f). + t(p,f) là chuẩn Student tra bảng ứng với p = 0,05 và bậc tự do f = n0 – 1. + Sbj là độ lệch chuẩn số số bj, Sbj được xác định theo công thức (2.6). + Xác định phương sai tái hiện ta sử dụng kết quả của 3 thí nghiệm tại tâm (9,10,11) trong bảng 3.11 : y10 = 11,52; y20 = 11,45; y30 = 11,51. + Hoạt độ enzyme trung bình ở tâm là: 3 y ∑y 0 = 0 i i =1 = 11,493 + Phương sai tái hiện S2th là : 3 ∑(y i =1 2 Sth = 0 i − y 0 )2 f th = 0,00143 fth: bậc tự do tương ứng với phương sai tái hiện, f = 3-1=2 + Áp dụng công thức (2.6) ta xác định được độ lệch tiêu chuẩn của chuẩn số bj là: Sbo = 0,0126; Sbij = 0,0189; Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -47- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Sb j ' Sbj = 0,0154; + = 0,0267; Chuẩn Student ( ttn) tương ứng với mỗi hệ số được tính theo công thức (2.7), có giá trị như sau: t0 = 909,15; t12 = -4,23; t1' t1 = -14,23; t '2 t2 = 23,29; = -19,42; = 16,06; + Tra bảng phụ lục 5; t(p,f) = t (0,05;2) = 4,3. b12 t12 So sánh ttn và tb ta có < tb nên hệ số bị loại khỏi phương trình hồi quy. + Vậy phương trình hồi quy có dạng: ' y% = 11,47 – 0,22x1 + 0,36x2 – 0,52 + x1' + 0,425 x '2 (3.11) Để đổi biến trở lại ta thay vào phương trình (3.11): 2 x1' = x12 −  3  2 ' 2 x2 = x2 − 3  y% Được : 3. = 11,53 – 0,22x1 +0,36x2 – 0,52 x12 + 0,43 x 22 (3.12) Kiểm định sự phù hợp của phương trình (3.12) với thực nghiệm − Sự tương thích của phương trình với thực nghiệm được kiểm định theo tiêu chuẩn Fisher (F). Ftn = Stt2 Sth2 Trong đó: Stt2 : là phương sai dư, được tính theo công thức (2.9), và số liệu bảng 3.8 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -48- GVHD: KS. Bùi Viết Cường N ∑( y Stt2 = yu y% u f du u =1 u 2 − y% ui ) f du : giá trị thực nghiệm tại thí nghiệm thứ u được ghi ở bảng 3.3 : giá trị tính theo phương trình hồi quy ứng với giá trị thứ u. : bậc tự do để tính phương sai dư : f du =N–L=9–5=4 N : số thí nghiệm trong mỗi phương án, N = 9 L : số hệ số có nghĩa trong phương trình, L = 5. Bảng 3.8. Giá trị để tính S2tt N yu y%u y u − y%u 1 2 3 4 5 6 7 8 9 7,024 7,900 8,616 7,224 8,071 8,547 8,141 7,603 7,910 11,303 10,863 12,023 11,583 10,793 11,233 12,323 11,603 11,533 0,083 0,077 0,077 0,083 0,007 0,007 0,007 0,007 0,013 ( yi − y%u )2 0,0069 0,0059 0,0059 0,0069 0,000049 0,000049 0,000049 0,000049 0,000169 Thay các giá trị vào ta tính được kết quả: S2tt = 0,0065. Ftn = S2tt S2th = 4,535. + F(P;f1;f2) : giá trị tra bảng của chuẩn số Fisher ứng với độ tin cậy p = 0,05. f1 = 4 (bậc tự do để tính phương sai dư). f2 = 2 (bậc tự do để tính phương sai tái hiện). Tra bảng ta được F(0,05;4;2) = 19,3. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -49- GVHD: KS. Bùi Viết Cường + So sánh Ftn và Fb Vậy phương trình (3.12) đã chọn phù hợp với mô hình thực nghiệm. 3.6.4. Tìm nghiệm tối ưu − Chuyển phương trình hồi quy (3.12) về biến thực, áp dụng công thức : Z j − Z0j xj = λj Z1  Z2 Z12 Z22 Ta được : y = -35,68+0,329 - 1,845 – 0,0036 + 0,027 Sử dụng Excel - solver tìm được Ymax = 11,69 khi Z1 = 48h và Z2 =320C. Tức là khi trồng giá ở nhiệt độ 32 0C và sau 48h trồng thì sẽ thu được mầm giá cho enzyme thu nhận được có hoạt lực cao nhất, đạt 11,69 UI/ml. Theo kết quả bảng thực nghiệm 3.7 thì hoạt lực enzyme protease cao nhất khi trồng giá ở 400C và sau 48h trồng, đạt 12,33 UI/ml. Kết quả này khác với giá trị tính toán, sai lệch này nguyên nhân do mức độ tinh sạch của hóa chất, thao tác của người nghiên cứu trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm. KẾT LUẬN Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận như sau: − Số lần lạnh đông, tan giá tối ưu để thu nhận enzyme protease có hoạt lực cao nhất: 2 lần. − Lượng SiO2 cần thiết sử dụng trong quá trình phá vỡ tế bào mầm giá đỗ để thu nhận enzyme protease có hoạt lực cao nhất: 140% so với khối lượng mầm giá đỗ. − Tối ưu hóa quá trình phá vỡ tế bào mầm giá đỗ với 2 biến lạnh đông, tan giá và lượng bột SiO2 tìm được phương trình hồi quy: Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme theo thời gian trồng Đồ án tốt nghiệp y = -21,919 + 3,811 -50- Z1 GVHD: KS. Bùi Viết Cường + 3,657 Z2 - 0,284 Z1Z2 - 0,106 Z22 . ymax = 8,724 UI/ml khi Z1 = 1 lần và Z2 = 16 gam. Tức là khi lạnh đông, tan giá 1 lần và sử dụng lượng bột SiO 2 160% so với khối lượng mầm giá đỗ cho hiệu suất thu hồi enzyme protease có hoạt lực cao nhất đạt 8,724 UI/ml. − Thời gian trồng giá đỗ để thu được enzyme protease có hoạt lực cao nhất: sau ủ 48h. − Nhiệt độ tối ưu trồng giá đỗ để thu được enzyme protease có hoạt lực cao nhất: 360C. − Tối ưu hóa điều kiện trồng giá đỗ với 2 biến thời gian và nhiệt độ ở độ ẩm không đổi trong quá trình trồng giá, tìm được phương trình hồi quy: y = -35,68 + 0,329 Z1 - 1,845 Z2 - 0,0036 Z12 + 0,027 Z22 . ymax = 11,69 UI/ml khi Z1 = 48h và Z2 = 320C. Tức là khi trồng đỗ ở nhiệt độ 320C sau 48h cho hiệu suất thu hồi enzyme protease có hoạt lực cao nhất đạt 11,69 UI/ml. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -51- GVHD: KS. Bùi Viết Cường KIẾN NGHỊ Qua quá trình nghiên cứu cho phép tôi đề xuất một số ý kiến về việc nghiên cứu tiếp tục như sau: − Nghiên cứu xác định giống đỗ cho hoạt tính enzyme cao nhất. − Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trồng giá đỗ để thu được enzyme có hoạt lực cao nhất: thời gian ngâm hạt; độ ẩm quá trình ủ. − Nghiên cứu quá trình nghiền giá đỗ với các yếu tố: kích thước hạt SiO 2, tốc độ nghiền, thời gian nghiền để thu nhận được enzyme có hoạt lực cao nhất. − Thực hiện lọc màng membrane để loại bỏ muối (NH4)2SO4 và sử dụng phương pháp sắc ký để tinh sạch và tinh chế enzyme protease thành chế phẩm tinh khiết. − Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của yếu tố pH, nhiệt độ, độ ẩm lên hoạt tính xúc tác của enzyme protease thu từ mầm giá đỗ. − Đề xuất xây dựng quy trình sản xuất enzyme protease từ mầm giá đỗ với hiệu suất cao nhất. − Nghiên cứu khả năng thủy phân của enzyme protease thu từ mầm giá đỗ đối với một sản phẩm, ví dụ thủy phân casein tạo sản phẩm fomat, hoặc sử dụng trong sản xuất nước mắm. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -52- GVHD: KS. Bùi Viết Cường TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Nguyễn trọng Cẩn (Chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến ( 1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản nông nghiệp thành phố HCM. [2] PGS.TS. Nguyễn Như Hiền (2006), Giáo trình sinh học tế bào, Nhà xuất bản giáo dục. [3] Võ Sỹ Hùng (1995), Nghiên cứu khai thác nguồn protease từ quả bí đao Việt Nam, Luận văn thạc sĩ khoa học Hóa học, Khoa hóa Đại học Khoa học tự nhiênĐại học quốc gia, Hà Nội. [4] Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006), “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá Basa”, tạp chí phát tiển KH&CN, tập 9(11), 59-67. [5] Th.S Trần Xuân Ngạch (2005), Giáo trình Công nghệ enzyme, Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng [6] Th.S Phan Thị Bích Ngọc (2007), Giáo trình Công nghệ Sinh học Thực Phẩm, Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng. [7] Hồ Thị Tuyết Mai (2003), Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm, Đại học Đà Nẵng. [8] Phạm Văn Thiều (1999), Cây đậu xanh – kỹ thuật trồng và chế biến sản phẩm, nhà xuất bản nông nghiệp. [9] Lê Ngọc Tú (2002), Hóa sinh công nghiệp, nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật [10] PGS.TS Đặng Thị Thu, PGS Lê Ngọc Tú, TS Tô Kim Anh, PGS.TS Phạm Thu Thủy, TS Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzyme, nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. [11] Thực hành hóa sinh, Trường Đại học kỹ thuật công nghệ TP HCM. [12] ThS Trần Thế Truyền (2007), Giáo trình kĩ thuật lạnh, Đại học Đà Nẵng. [13] ThS Nguyễn Thị Lan (2007), Giáo trình Quy hoạch thực nghiệm, Đại học Đà Nẵng. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -53- GVHD: KS. Bùi Viết Cường Tiếng Anh [14] M.Mahbubar, L.Arijumand Banu, M. Mashiar Rahman (2007), “Changes of the Enzymes Acitivity During Germination of Different Mungbean Varieties”, Bangladesh J. Sci. Ind. Res, 42(2), 213-216. [15] Joze Brinz, Marjetka Kidric (1995), “Proteinase and Their Inhibitors in Plants- Role in Normal Growth and in Response to Various Stress Condition” , Biotechnology and Genetic Engineering Reviews ,Vol.13. [16] Stoscheck, CM (1990), ”Quantitation of Protein”, Methods in Enzymology 182, 50÷69. [17] Byron L. Bertagnolli, Randolph T. Wedding (1977), “ Cystine content of Legume Seed Proteins: Estimation by Determination of Cysteine with 2Vinylquinoline, and Relation to Protein Content and Activity of Cysteine Synthase”, Departement of Biochemistry, University of California Riverside, California 92521. [18] Limin Li, Benguo Liu, Xueling Zheng (2011), “ Bioactive ingredients in Adzuki bean sprouts”, Journal of Medicinal Plants Research , Vol. 5(24), 5894 ÷5898. [19] Marion M. Bradford (1976), “A Rapid and Sensitive Method for the Quantritation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Pronciple of ProteinDye Binding”, Analytical Biochemistry 72, 248-254. [20] Syed Adil Shal, Aurang Zeb, Tariq Masood, Nadia Noreen, Sayed Jaffar Abbas, Muhammad Samiullah, Md. Abdul Alim, Asim Muhammad (2011), ” Effects of sprouting time on biochemical and nutritional qualities of Mung Bean varieties”, African Journal of Agricltural Research, Vol.6(22), 5091÷5098. [21] M.Akhtaruzzaman, N.H.M.Rubel Mozumder, Ripa Jamal, Atiker Rahman, Tanjina Rahman (2012), “Isolation and characterization protease enzyme from legumious seeds”, Agricultural Science Research Journals, Vol.2(8), trang 434÷440. [22] Xiafei Zhang, (2004), “The effects of temperature and pH on the germination Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -54- GVHD: KS. Bùi Viết Cường and early growly of Mung bean”, California state science fair 2004 project summary. [23] Reihaneh Ahmodzadeh Ghavidel, Mehdi Ghiafeh Davoodi, (2011), “Evaluation of changes in Phytase, α- Amylase and protease activities of some legume seed during germination”, Singapore. [24] Amrita Srimany, (2012), “ Effect of germination on Physico-Chemical properties of some agricutural commodities”, Kolkata-700032, May 2012. [25] CHEN Zhong, YANG Xiao-Quan, ZHAO Mou-Ming (2001), “A Proteinase from Mung Bean Sprouts That Inactivaties Soybean Trypsin Inhibitor”, Acta Botanica Sinica, 43(11), 1150÷1153. Website [26] http://www.ehow.com/about_5612849_role-protease-plants.html, ngày truy cập 20/3/2014. [27] http://yume.vn/llthanhtruc/article/gia-dau-va-loi-ich-cua-gia-gia- do.35D7664C.html, ngày truy cập 26/3/2014. [28] http://www.sprouthouse.com/Mung_Bean_p/mung.htm, ngày truy cập 26/3/2014. [29] http://vi.scribd.com/doc/6944626/3/APPLICATIONS-OF-PROTEASE, ngày truy cập 20/3/2014. [30] http://www.sprouthouse.com/Mung_Bean_p/mung.htm, ngày truy cập 25/3/ 2014. [31] http://www.amthuc365.vn/t13499c74/mon-an-suc-khoe/2012/05/gia-do-va- nhu.0ng-loi-ich-doi-voi-suc-khoe.html, ngày truy cập 26/3/2014. [32] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/359572, ngày truy cập 26/3/2014. [33] http://www.lhu.edu.vn/Data/News/54/files, ngày truy cập 21/4/2014. [34] http://www.ngheandost.gov.vn/news/ Ky_thuat_san_xuat_gia_do.aspx, ngày truy cập 21/4/2014. [35] http://luanvan.net.vn/luan-van/luan-van-nghien-cuu-qui-trinh-phan-tich- Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -55- GVHD: KS. Bùi Viết Cường 6benzylaminopurine-trong-gia-do-bang-hplc-dau-do-uv-20007/, ngày truy cập 30/4/2014. [36] http://www.vnulib.edu.vn:8000/dspace/bitstream/123456789, ngày truy cập 30/4/2014. [37] http://connection.ebscohost.com/c/articles/70782128/investigations- purification-characterization-antimicrobial-activity-enzyme-papain-from-caricapapaya-linn, ngày truy cập 20/5/2014. [38] http://www.biomedcentral.com/1471-2091/10/28, ngày truy cập 20/5/2014. [39] http://www.elixirpublishers.com/articles/7826.pdf, ngày truy cập 20/5/2014. [40] http://161.200.184.9/tjps/ContentVol34No2/V34-2Art3%20pp67-76.pdf, ngày truy cập 20/5/2014. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Bùi Viết Cường PHỤ LỤC Phụ lục 1 . Kết quả xây dựng đường chuẩn tyrosine theo phương pháp Amano Bảng 1. Số liệu kết quả xây dựng đường chuẩn tyrosine Nồng độ tyrosine (µ/ml) Độ hấp thụ ABS660 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0.05 0.16 0.22 0.33 0.4 0.47 0.56 0.61 0.71 0.84 Hình 1. Đồ thị đường chuẩn tyrosine với hệ số tương quan R2=0,9953 Phụ lục 2. Bảng 1. Bảng trị số mật độ quang, nồng độ dung dịch tyrosine, hoạt tính enzyme protease có trong mầm giá đỗ khi phá vỡ tế bào bằng phương pháp lạnh đông, tan giá lặp đi lặp lại. STT ABS F y 1 0,574 71,777 4,12 2 0,712 88,48315 6,3 3 0,688 85,61047 5,89 4 0,596 74,32886 4,43 5 0,529 66,35161 3,51 6 0,501 62,87425 3,15 7 0,333 42,34234 1,41 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp 8 GVHD: KS. Bùi Viết Cường 0,286 36,71329 1,05 Phụ lục 3. Bảng 1. Bảng trị số mật độ quang, nồng độ dung dịch tyrosine, hoạt tính enzyme protease có trong mầm giá đỗ khi xác định theo khối lượng bột SiO2 sử dụng để nghiền. STT ABS F y 1 0,674 83,82789 5,65 2 0,687 85,44396 5,87 3 0,694 86,31124 5,99 4 0,707 87,83593 6,21 5 0,797 98,87077 7,88 6 0,831 103,1288 8,57 7 0,824 102,1845 8,42 8 0,677 84,34269 5,71 Phụ lục 4. Bảng 1. Bảng trị số mật độ quang, nồng độ dung dịch tyrosine, hoạt tính enzyme protease có trong mầm giá đỗ khi tối ưu hóa quá trình phá vỡ tế bào mầm giá đỗ với 2 biến: lạnh đông, tan giá và lượng bột SiO2. STT ABS F y 1 0,752 93,40426 7,024 2 0,800 98,75000 7,900 3 0,834 103,3094 8,616 4 0,762 94,80315 7,224 5 0,807 100,0124 8,071 6 0,830 102,9759 8,547 7 0,810 100,5062 8,141 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Bùi Viết Cường 8 0,783 97,10089 7,603 9 0,798 99,12281 7,910 10 0,794 98,53904 7,824 11 0,798 99,04762 7,904 Phụ lục 5. Bảng 1. Bảng trị số mật độ quang, nồng độ dung dịch tyrosine, hoạt tính enzyme protease có trong mầm giá đỗ theo thời gian trồng. STT ABS F y 1 0,658 82,06687 5,4 2 0,813 100,861 8,2 3 0,959 118,561 11,37 4 0,903 111,9601 10,11 5 0,82 101,8293 8,35 6 0,725 90,2069 6,54 7 0,713 88,63955 6,32 8 0,667 83,05847 5,54 9 0,598 74,74916 4,47 10 0,516 64,72868 3,34 11 0,426 53,75587 2,29 Phụ lục 6. Bảng 1. Bảng trị số mật độ quang, nồng độ dung dịch tyrosine, hoạt tính enzyme protease có trong mầm giá đỗ theo nhiệt độ trồng. STT ABS F y 1 0,536 66,97761 3,59 2 0,776 96,26289 7,47 3 0,853 105,6272 9,01 4 0,959 118,7696 11,39 5 0,963 119,2108 11,48 6 0,924 114,2857 10,56 7 0,804 99,75124 8,02 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Bùi Viết Cường Phụ lục 7. Bảng 1. Bảng trị số mật độ quang, nồng độ dung dịch tyrosine, hoạt tính enzyme protease có trong mầm giá đỗ khi tối ưu hóa quá trình trồng giá đỗ với 2 biến: thời gian trồng và nhiệt độ trồng. STT ABS F y 1 0,952 117,8571 11,22 2 0,940 116,3830 10,94 3 0,989 122,3458 12,10 4 0,964 119,2946 11,50 5 0,934 115,6317 10,80 6 0,955 117,6963 11,24 7 0,998 123,5471 12,33 8 0,969 119,8142 11,61 9 0,965 119,3782 11,52 10 0,962 119,0229 11,45 11 0,964 119,3983 11,51 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Bùi Viết Cường Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ. Lớp : 09H2A [...]... thu oligochitosan” − Trần Cảnh Đình, Vũ Xuân Sơn và Nguyễn Thị Hường Viện nghiên cứu hải sản (2010), nghiên cứu chế độ thủy phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme papain và bromelain” Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu nào nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận enzyme protease từ nguồn nguyên liệu giá đỗ tại Việt Nam Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease. .. 8,141 7,603 7,910 7,824 7,904 Từ kết quả ở bảng 3.3 ta nhận thấy, mỗi một tổ hợp thí nghiệm đều có ảnh hưởng đến quá trình phá vỡ tế bào mầm giá đỗ thu nhận enzyme protease Sự biến thiên về số lần lạnh đông, tan giá và khối lượng SiO 2 sẽ dẫn đến những thay đổi về Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thu t từ mầm giá đỗ Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp... Excel – Solver để tìm kiếm tối ưu Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thu t từ mầm giá đỗ Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -31- GVHD: KS Bùi Viết Cường Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định số lần lạnh đông, tan giá tối ưu để thu được enzyme protease có hoạt lực cao nhất 3.1.1 Tiến hành Cân 80g giá ủ, chia đều mẫu vào 8 cốc rồi... hóa sinh của giống Đối với enzyme từ động vật và thực vật thì cần chú ý tới loại, giống vật nuôi, cây trồng có chứa loại enzyme đó, thời điểm nuôi trồng… 1.4 Đỗ xanh và mầm giá đỗ 1.4.1 Đỗ xanh Hình 1.2 Hạt đỗ xanh Hình 1.3 Cấu tạo bên trong của hạt đỗ xanh.[24] Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thu t từ mầm giá đỗ Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp... xuất protease từ nguồn thực vật là quá trình mất Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thu t từ mầm giá đỗ Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -13- GVHD: KS Bùi Viết Cường nhiều thời gian nhưng so với các protease có nguồn gốc vi sinh vật thì enzyme protease có nguồn gốc thực vật đang được ưa chuộng hiện nay Papain và bromelain đại diện cho các protease. .. phương án qui hoạch trực giao cấp II Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần lạnh đông, tan giá và khối lượng bột nghiền SiO2 đến hoạt độ của enzyme ta tiến hành 9 thí nghiệm Hai thông số cần khảo sát là số lần lạnh đông, tan giá từ 1÷3 và khối lượng SiO2 từ 12÷16g Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thu t từ mầm giá đỗ Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -35-... = 7 để ổn định enzyme (1 : 3 w/v) Lọc để tách cặn bằng vải lọc thô, sau đó đem ly tâm ở 5500 vòng/phút trong 20 phút Đem xác định hoạt tính của enzyme protease Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thu t từ mầm giá đỗ Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -26- GVHD: KS Bùi Viết Cường 2.2.2 Phương pháp hóa lý Đo định hoạt tính enzyme protease theo phương... thái hoạt động, enzyme được giải phóng tự do Tại nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, nó hoạt động mạnh nhất phân giải các chất hữu cơ có trong hạt Đồng thời các quá trình hóa lý, sinh hóa, lý Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thu t từ mầm giá đỗ Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -18- GVHD: KS Bùi Viết Cường học xảy ra liên tiếp, nên lượng enzyme tăng lên... giữa hoạt tính enzyme theo khối lượng bột Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thu t từ mầm giá đỗ Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp -33- GVHD: KS Bùi Viết Cường SiO2 sử dụng để nghiền 3.2.3 Nhận xét đồ thị Qua đồ thị hình 3.2, nhìn chung khi nghiền với lượng bột SiO 2 tăng dần từ 40÷180% so với khối lượng của mẫu giá thì hoạt độ enzyme protease tăng... thế khi tan giá các chất dinh dưỡng, protein và enzyme dễ dàng thoát ra ngoài theo dịch bào, làm cho quá trình phá vỡ tế bào tốt hơn, cho hoạt tính enzyme protease cao hơn 1.5.3 Nghiền với bột SiO2 Khi tế bào thực vật được nghiền với hạt thủy tinh thì cấu trúc tế bào thực vật Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thu t từ mầm giá đỗ Lớp : 09H2A ... nhu cầu enzyme Việt Nam Vì vậy, chọn đề tài Nghiên cứu tối ưu hóa trình thu nhận chế phẩm enzyme protease kĩ thu t từ mầm giá đỗ đề tài tốt nghiệp Nghiên cứu tối ưu hóa trình thu nhận chế SVTH... nghiên cứu nghiên cứu tối ưu hóa trình thu nhận enzyme protease từ nguồn nguyên liệu giá đỗ Việt Nam Nghiên cứu tối ưu hóa trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thu t... LỤC Nghiên cứu tối ưu hóa trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm phẩm enzyme protease kĩ thu t từ mầm giá đỗ Lớp : 09H2A Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS Bùi Viết Cường Nghiên cứu tối ưu hóa trình