ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.2.2.Phương pháp hóa lý
Đo định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Amamo
2.2.2.1. Nguyên tắc
Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme.
Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino axit tương đương với 100µg tyrosine trong 1µl dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm.
2.2.2.2. Cách tiến hành
Pha dung dịch tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100µg tyrosin/ml HCl 0,1M.
Thêm 5ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào 1ml dung dịch tyrosin (các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm 1ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37 (± 0,5)oC trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660nm. Ghi nhận kết quả As10; As20; As30;…As100.
2.2.2.3. Xây dựng đường chuẩn tyrosine:
Dùng 1ml axit HCl 0,1M thay cho tyrosin, đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660nm (ghi nhận kết quả này làm đối chứng As0). Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ được giá trị ABS1 đến ABS10. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của ABS theo nồng độ protein. Đồ thị này gọi là đường chuẩn tyrosine.
Ống nghiệm Đối chứn g 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nồng độ (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Dung dịch tyrosine chuẩn (µl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung dịch HCl (µl) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 900 Dung dịch Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử Folin (ml ) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Xác định hoạt tính enzyme protease
Cho 1ml dung dịch cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 370C trong 10÷15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme vào và lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở nhiệt độ 370C trong 60 phút. Cho vào hỗn hợp này ml dung dịch axit trichloracetic 0,4M (TCA), để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa.
Cho 5ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào 1ml dịch lọc, thêm 1ml thuốc thử folin vào dung dịch hỗn hợp này, trộn đều để yên ở 370C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660nm.
Mẫu đối chứng: lấy 1ml dung dịch đệm pH = 7 thay cho 1ml dung dịch
enzyme và tiến hành các bước tương tự như ở mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ hấp thụ ở bước sóng 660nm (A0).
Tính toán
Hàm lượng tyrosin được giải phóng do enzyme protease thủy phân được tính bằng cách lấy (Am – A0) rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt độ protease theo công thức sau:
Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am- A0).F.n (2.1) 100
Hoạt tính enzyme protease ( ĐVHT/g) = (2.2)
Trong đó:
F là lượng tyrosine có trong đường chuẩn (µg) Am Độ hấp thụ của mẫu
A0 Độ hấp thụ của mẫu đối chứng n hệ số pha loãng của enzyme 1/100 hệ số chuyển đổi
M Khối lượng chế phẩm enzyme thô.