Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình lên men dấm bằng phương pháp lên men chìm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 60420201 Đề tài: NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH LÊN MEN DẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM HỌC VIÊN THỰC HIỆN: CAO ANH TÀI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRƯƠNG HƯƠNG LAN Hà Nội, 12/2015 Lời cảm ơn Tôi xin phép bày tỏ lời biết ơn trân trọng tới: Tiến sĩ TRƯƠNG HƯƠNG LAN trưởng phòng môn Thực phẩm dinh dưỡng Viện công nghiệp thực phẩm - Hà Nội Phó giáo sư tiến sĩ NGUYỄN VĂN ĐẠO trưởng phòng đào tạo sau đại học Viện Đại Học Mở Hà Nội Tiến sĩ NGUYỄN QUANG THẢO người bạn lâu năm gia đình Cùng tất anh chị em môn Thực phẩm dinh dưỡng Viện công nghiệp thực phẩm Hà Nội, thầy cô phòng đào tạo sau đại học Viện Đại Học Mở Hà Nội Gửi tới gia đình tôi, đặc biệt bố mẹ chỗ dựa vững chắc, nguồn động viên Đã đóng góp ý kiến quý báu, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ trình học tập, làm việc hoàn thành đề tài DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT HPLC: higt-pressure liquid chromatography FAO: Food and agriculture organization FDA: Food and Drug Administration WHO: World health organization DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học dấm làm từ rượu vang Bảng 2.1 Các biến số cần tối ưu hàm mục tiêu cần đạt Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái, khả phân giải CaCO3 chủng vi khuẩn axít axetic Bảng 3.2 Các đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn axetic Bảng 3.3 Xác định mật độ quang hấp thụ tế bào sau ngày lên men chủng khảo sát Bảng 3.4 Khả bền vững với etanol chủng vi khuẩn axetic Bảng 3.5 Khả oxy hóa etanol thành axít axetic chủng vi khuẩn Bảng 3.6 Hàm lượng axít axetic tạo thành (g/L) sau lên men ngày chủng vi khuẩn điều kiện nhiệt độ khác Bảng 3.7 Ảnh hưởng hàm lượng etanol môi trường đến hàm lượng axít tạo thành hiệu suất chuyển hóa Bảng 3.8 Ảnh hưởng tốc độ sục khí tới hiệu lên men Bảng 3.9 Các biến số cần tối ưu hàm mục tiêu cần đạt Bảng 3.10 Ma trân thực nghiệm Doehlert kết thí nghiệm Bảng 3.11 Các giá trị thống kê hàm mục tiêu Bảng 3.12 Các hệ số mô hình Bảng 3.13 Các hệ số hồi quy hàm mục tiêu Y1 Y2 Bảng 3.14 Kết đợt lên men Bảng 3.15 chất lượng sản phẩm Dấm gạo DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 : phương trình chuyển hóa rượu etanol thành axít axetic Hình 3.1 Khả oxy hóa etanol thành axít axetic chủng khảo sát Hình 3.2 Vị trí phân loại chủng D4 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc A pasteurianus D4 (mọc môi trường GYP sau 72h 30oC) Hình 3.4 Hình thái tế bào vi khuẩn A pasteurianus D4(sau nhuộm gram) Hình 3.5 Sự phát triển vi khuẩn acetic (OD600nm) môi trường có nồng độ axít ban đầu khác Hình 3.6 Tốc độ tạo thành axít axetic vi khuẩn môi trường có nồng độ axít ban đầu khác Hình 3.7 Bề mặt đáp ứng hàm Y1 (Hàm lượng axit axetic tạo thành g/L) Hình 3.8 Bề mặt đáp ứng hàm Y2 (Tốc độ tạo axit axetic trung bình, g/L/ngày) Hình 3.9 Sự phát triển vi khuẩn, thay đổi a xít axetic etanol chu kỳ lên men thứ qui mô 2.000L MỤC LỤC Trang Lời cám ơn i Mục lục ii Danh mục chữ viết tắt iii Danh mục bảng iv Danh mục hình v MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 10 1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU 10 1.2 AXÍT AXETIC 13 1.2.1 Đặc tính hóa - lý 13 1.2.2 Vai trò quan trọng axít axetic 13 1.3 VI KHUẨN ACETOBACTER 14 1.3.1 Đặc điểm chung vi khuẩn Acetobacter 14 1.3.2 Một số loài vi khuẩn Acetobacter thường gặp 15 1.3.3 Các chủng vi khuẩn sản xuất dấm 16 1.4 CƠ CHẾ CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXETIC 17 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN DẤM 18 1.5.1 Nguyên liệu dùng để sản xuất dấm 18 1.5.2 Các phương pháp lên men dấm 18 1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men dấm theo phương pháp chìm 22 1.6 HƯƠNG CỦA DẤM ĂN 28 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, MÔI TRƯỜNG 30 2.1.1 Nguyên vật liệu 30 2.1.2 Chủng vi sinh vật 30 2.1.3 Hóa chất 30 2.1.4 Dụng cụ thiết bị 30 2.1.5 Các môi trường sử dụng 31 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.3.1 Phương pháp vi sinh vật 34 2.3.2 Phương pháp công nghệ 36 2.3.3 Phương pháp phân tích hóa lý 38 2.3.4 Phương pháp sinh học phân tử 38 2.3.5 Phương pháp toán học 39 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN AXETIC 40 3.1.1 Các đặc điểm hình thái sinh hóa chủng vi khuẩn sinh axít axetic 40 3.1.2 Nghiên cứu xác định khả tạo sinh khối chủng vi khuẩn trình lên men 44 3.1.3 Khả bền vững với etanol 44 3.1.4 Nghiên cứu xác định khả tạo axít axetic chủng vi khuẩn 46 3.1.5 Nghiên cứu xác định khả bền vững nhiệt độ cao chủng vi khuẩn axetic 47 3.1.6 Xác định tên chủng vi khuẩn axít axetic D4 48 3.2 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN DẤM 52 3.2.1 Xác định ảnh hưởng điều kiện lên men 52 3.2.2 Tối ưu hóa các yếu tố công nghệ cho trình ma trận thực nghiệm Doehlert 55 3.3 KẾT QUẢ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM QUY MÔ 2000 LÍT/MẺ 62 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Dấm ăn (thành phần chủ yếu axít axetic) ngày đóng vai trò quan trọng đời sống người Vai trò dấm ăn biết đến trước tiên loại gia vị, chất bảo quản thực phẩm sản xuất chế biến thực phẩm Ngoài dấm sử dụng nguồn nguyên liệu phục vụ cho trình sản xuất ngành công nghiệp : hóa mỹ phẩm, chế biến cao su, chế biến thực phẩm, dệt, thuộc da… Các nước công nghiệp phát triển như: Anh, Đức, Pháp, Nhật, Mỹ… có nhu cầu lớn nguồn dấm nguyên liệu phục vụ cho ngành công nghiệp nhẹ Chính vậy, phương pháp lên men trọng nghiên cứu phát triển nhằm đẩy nâng cao lực sản xuất Các nước phương Tây có bước tiến vượt bậc việc nghiên cứu, chế tạo thiết bị, sản xuất dấm Theo liệu AC Nielsen Vinegar Institute công bố năm 2005, sản lượng dấm đóng chai bán thông qua hệ thống siêu thị tăng 29% vòng chín năm từ năm 1993 năm 2003, đạt doanh số 220 triệu đô la Việt Nam quốc gia có nông nghiệp tương đối phát triển Lợi nguồn nguyên liệu đa dạng, phong phú, nước mở tiềm sản xuất dấm chất lượng cao lực sản xuất lớn Tuy nhiên, thực tế sản phẩm dấm ăn thị trường chủ yếu sản xuất phương pháp lên men truyền thống cho chất lượng trung bình, sản lượng thấp Ngoài ra, lượng lớn dấm ăn sản xuất từ axít công nghiệp gây ảnh hưởng không nhỏ tới sức khỏe người tiêu dùng Hiện nay, phương pháp sản xuất tiên tiến áp dụng cho trình sản xuất dấm quy mô công nghiệp phương pháp lên men chìm Phương pháp lên men sản xuất theo mẻ gián đoạn, bán liên tục hay liên tục thiết bị lên men tích lên tới 40 m3 thời gian ngắn từ 48 – 72h Dấm thành phẩm thu với chất lượng cao Tác nhân trực tiếp tham gia thực trình lên men chuyển hóa etanol thành axít axetic vi khuẩn acetic Tesfaye cộng (2000) rằng, trình lên men, để giữ cho quần thể vi sinh vật tồn phát triển chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố, cung cấp chất, cung cấp oxy nhiệt độ lên men yếu tố có ảnh hưởng quan trọng Các nhân tố liên quan tới trao đổi chất vi khuẩn acetic hoạt tính enzyme Các nhân tố dừng trình lên men thời gian ngắn ngoại trừ chúng kiểm soát thật nghiêm ngặt Các nhân tố phụ hàm lượng etanol ban đầu, tỷ lệ axít hóa yếu tố làm tăng lực vi khuẩn acetic Tuy nhiên, tất nhân tố phụ thuộc lẫn ảnh hưởng đến toàn trình axít hóa hiệu trình lên men [22],[38] Với số lượng ỏi nghiên cứu sản xuất dấm ăn nay, việc tiên phong áp dụng phương pháp lên men chìm sản xuất mở tiềm phát triển trình sản xuất dấm ăn quy mô công nghiệp Lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa trình lên men dấm phương pháp lên men chìm” để nâng cao lực sản xuất dấm ăn, rút ngắn khoảng cách nghiên cứu khoa học với thực tiễn sản xuất thực phẩm phục vụ nhu cầu người dân Mục đích nghiên cứu - Tuyển chọn chủng vi khuẩn acetic có lực tích tụ axít axetic, hiệu suất chuyển hóa cao, đặc tính di truyền ổn định Định danh chủng vi khuẩn phân loài - Xác định điều kiện tối ưu trình lên men dấm ăn theo phương pháp lên men chìm - Ứng dụng sản xuất dấm ăn quy mô thiết bị 2000L Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: chủng vi khuẩn acetic có nguồn gốc từ Nhật Bản, Hàn Quốc Việt Nam (do Công ty TNHH Thực phẩm Hồng Hà tự phân lập) - Phạm vi nghiên cứu: + Đề tài tập trung vào nghiên cứu phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn phục cho trình sản xuất dấm phương pháp lên men chìm Từ sử dụng mô hình toán học phần mềm tính toán để tối ưu trình lên men dấm + Về địa bàn nghiên cứu : Quá trình nghiên cứu thực hai sở Viện công nghiệp Thực phẩm Công ty TNHH Thực phẩm Hồng Hà (Hà Nội) + Thời gian nghiên cứu: tiến hành từ 12/5/2014 30/6/2015 Bảng 3.11 Các giá trị thống kê hàm mục tiêu Hàm mục tiêu Y1 (Hàm lượng axít axetic tạo thành, g/L) Y2 (Tốc độ tạo thành axít axetic trung bình, g/L /ngày) Trung bình 36,32 Độ lệch Lớn 6,92 Nhỏ 25,50 44,10 Trung tâm 34,80 3,25 1,44 0,91 4,86 2,88 Bảng 3.12 Các hệ số mô hình Hệ số mô hình Độ lệch chuẩn R2 Bậc tự Y1 (Hàm lượng axít axetic tạo thành, g/L) 0,058 0,997 Y2 (Tốc độ tạo thành axít axetic trung bình, g/L/ngày) 0,015 0,999 Y1 (Hàm lượng axít axetic tạo thành sau lên men, g/L) Theo bảng 3.11 hàm lượng axít axetic tạo thành sau trình lên men có giá trị trung bình 36,32 g/L, độ lệch chuẩn 6,92 g/L, giá trị cực tiểu 25,5 g/L, giá trị cực đại 44,1 g/L giá trị trung tâm 34,8 g/L Điều cho thấy ảnh hưởng rõ ràng biến khảo sát tới hàm mục tiêu cần đạt Bên cạnh đó, theo kết tính toán hệ số hồi quy phần mềm NEMRODW trình bày bảng 3.13 tất hệ số thích ứng mô hình f nằm khoảng từ - 1,11 Đối với ma trận thực nghiệm Doehlert hệ số f nhỏ 2,5 hoàn toàn thích ứng Ngoài ra, bảng 3.12 cho thấy hệ số R2 (độ lệch) hàm mục tiêu Y1 0,997, mà R2 < phương trình đáng tin cậy Điều thể mô hình phản ánh 99,7% thực tế Ngoài ra, bảng 3.10 cho thấy sai khác giá trị tính toán từ phương trình hồi quy giá trị thu thực tế biến đổi từ 98,4% đến 101,3%, qua khẳng định thêm tính xác phương trình hồi quy thu Điều phù hợp với giá trị độ lệch chuẩn R2 = 0,997 mô hình Y2 (Tốc độ tạo axít axetic trung bình, g/L/ngày) Bảng 3.11 cho thấy tốc độ tạo axít axetic trung bình trình lên men 3,25 g/L/ngày, độ lệch chuẩn 1,44 g/L/ngày, giá trị cực tiểu 0,91 g/L/ngày, giá trị cực đại 4,86 g/L/ngày giá trị trung tâm 2,88 g/L/ngày Điều cho 57 thấy ảnh hưởng rõ ràng biến khảo sát tới hàm mục tiêu cần đạt Bên cạnh đó, theo kết tính toán phần mềm NEMRODW trình bày bảng 3.13 tất hệ số thích ứng mô hình f nằm khoảng từ - 1,11 Qua khẳng định mô hình thực nghiệm sử dụng hoàn toàn thích ứng Ngoài ra, bảng 3.12 cho thấy hệ số R2 (độ lệch) hàm mục tiêu Y2 0,999, nghĩa mô hình phản ánh 99,9% thực tế Bảng 3.10 cho thấy sai khác giá trị tính toán từ phương trình hồi quy giá trị thu thực tế biến đổi từ 93,1% đến 103,1%, qua khẳng định thêm tính xác phương trình hồi quy thu Điều phù hợp với giá trị độ lệch R2 = 0,999 mô hình 3.2.2.1 Phân tích phương trình hồi quy hàm mục tiêu Các hệ số hồi quy hàm mục tiêu Y1 Y2 thu phần mềm NEMRODW trình bày bảng 3.13 Bảng 3.13 Các hệ số hồi quy hàm mục tiêu Y1 Y2 Hệ số hồi quy B0 B1 B2 B11 B22 B12 Giá trị (b) Y1 Y2 44,03 -2,75 -0,72 -16,18 -6,95 -5,95 4,85 -0,61 -0,13 -3,39 -1,42 -1,18 Hệ số thích ứng (f) Y1 Y2 1,00 1,00 1,04 1,04 1,00 1,00 1,00 1,04 1,04 1,00 Độ lệch chuẩn Y1 Y2 0,033 0,033 0,033 0,053 0,053 0,067 0,009 0,009 0,009 0,014 0,014 0,018 Mức ý nghĩa Y1 Y2 < 0,01*** < 0,0168*** < 0,130** < 0,01*** < 0,0108*** 0,0154*** < 0,01*** < 0,0205*** < 0,294** < 0,01*** < 0,0136*** 0,0212*** ***: Mức ý nghĩa 0,001; **: Mức ý nghĩa 0,01 Y1 (Hàm lượng axít axetic sau lên men, g/L) Từ bảng 3.13 có phương trình hồi quy hàm mục tiêu Y1 là: Y1 (g/L ) = 44,03 – 2,75X1 – 0,72X2 - 16,18X12 – 6,95X22 - 5,95X1X2 (8) Các hệ số hồi quy thu bảng 3.13 cho thấy yếu tố cần tối ưu có ảnh hưởng tới hàm mục tiêu mức ý nghĩa 0,001 Có thể nhận thấy yếu tố khảo sát có ảnh hưởng tỷ lệ nghịch hàm lượng axít axetic tạo thành dấm thu cuối trình lên men, có hệ số hồi quy b1 b2 có giá trị nhỏ Tuy nhiên, pH có ảnh hưởng nhỏ so với nhiệt độ, 58 có hệ số hồi quy b2 = - 0,72 nhỏ b1 = - 2,75, tương ứng Hơn nữa, yếu tố có giá trị thấp cao tương tác nội yếu tố có ảnh hưởng xấu tới hàm lượng axít axetic dấm sau lên men, có hệ số hồi quy b11 b22 nhỏ Đặc biệt tương tác nội yếu tố lên hàm mục tiêu Y1 lớn nhiều so với ảnh hưởng đơn lẻ yếu tố đó, tương tác yếu tố với nhau, tất hệ số b11 b22 có giá trị tuyệt đối lớn nhiều so với hệ số b1, b2 b12 tương ứng Trong đó, tương tác yếu tố khảo sát ảnh hưởng âm tính tới hàm lượng axít axetic dấm sau lên men, có hệ số hồi quy b12 nhỏ Tuy nhiên, ảnh hưởng tương tác yếu tố (b12 = -5,95) tới giá trị hàm mục tiêu Y1 lớn đáng kể ảnh đơn lẻ yếu tố lên giá trị hàm mục tiệu Y1 Chẳng hạn như, tương tác nhiệt độ lên men pH có ảnh hưởng tiêu cực tới hàm lượng axít axetic dấm sau lên men, có b12 = - 5,95, so với ảnh hưởng đơn lẻ nhiệt độ có b1 = - 2,75 Có nghĩa là, nhiệt độ lên men thấp cao làm tăng khả ức chế tạo thành axít axetic vi khuẩn pH môi trường có giá trị thấp cao Điều thể bảng 3.10 pH có giá trị trung bình = 5, nhiệt độ lên men cố định đầu mút khảo sát 26oC 38oC, thí hàm lượng axít axetic tạo thành có giá trị thấp nhất, 30,2 g/L 25,5 g/L Trong đó, pH có ảnh hưởng tích cực tới hàm lượng axít axetic dấm sau lên men, cố định nhiệt độ lên men 29oC, thay đổi pH môi trường đầu mút khảo sát 3,7 6,3 hàm lượng axít axetic tạo thành tương ứng 34,6 g/L 38,5 g/L, cao đáng kể so với cố định pH = thay đổi nhiệt độ lên men từ 26oC lên 38oC Qua phân tích hệ số hồi quy biến số cần tối ưu trên, nhận thấy rằng, yếu tố mức thấp cao làm giảm hàm lượng axít axetic tạo thành cuối trình lên men Trong đó, ba yếu tố mức trung bình (= 0) làm tăng hàm lượng axít axetic tạo thành sau trình lên men, đạt 44,03 g/L Y2 (Tốc độ tạo axít axetic trung bình, g/L/ngày) 59 Từ bảng 3.13 có phương trình hồi quy hàm mục tiêu Y2 là: Y2 (g/L /h) = 4,86 – 0,61X1 – 0,13X2 – 3,39X12 – 1,42X22 – 1,18X1X2 (9) Qua phương trình hồi qui thu trên, chiều hướng ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ lên men pH môi trường lên tốc độ tạo thành axít axetic trung bình trình lên men tương tự ảnh hưởng chúng lên hàm lượng axít axetic dấm sau lên men, phân tích Cũng nhận thấy rằng, yếu tố mức thấp cao làm giảm tốc độ tạo axít axetic trung bình trình lên men Trong đó, ba yếu tố mức trung bình (= 0) làm tăng tốc độ tạo axít axetic trung bình trình lên men, đạt 4,86 g/L/h 3.2.2.2 Phân tích bề mặt đáp ứng hàm mục Y1 : Hàm lượng axít axetic tạo thành g/L Bề mặt đáp ứng Hình 3.7 đồ thị hàm mục tiêu vẽ hệ tọa độ (XOY), giá trị trục tương đương với biến cần khảo sát Hình 3.7 Bề mặt đáp ứng hàm Y1 (Hàm lượng axit axetic tạo thành g/L) Kết từ bề mặt đáp ứng hình 3.7 cho thấy hàm lượng axít axetic dấm sau lên men đạt giá trị cực đại 44,03 g/L, nhiệt độ lên men X1 nằm 60 khoảng từ 31,1oC đến 31,9oC pH môi trường X2 phải nằm khoảng từ 4,8 đến 5,1 Y2 : Tốc độ tạo thành axít axetic trung bình g/L/ngày Kết từ bề mặt đáp ứng hình 3.8 cho thấy tốc độ tạo axít axetic trung bình trình lên men đạt giá trị cực đại 4,86 g/L/ngày, nhiệt độ lên men X1 nằm khoảng từ 31,1oC đến 31,9oC pH môi trường X2 phải nằm khoảng từ 4,8 đến 5,1 Hình 3.8 Bề mặt đáp ứng hàm Y2 (Tốc độ tạo axit axetic trung bình, g/L/ngày) Trong nghiên cứu này, xác định nhiệt độ lên men tối ưu khoảng từ 31,1 đến 31,9oC, lớn chút so với kết tối ưu mà De Ory cộng (2002) tìm thấy cho trình lên men dấm phương pháp chìm 30 – 31oC, điều kiện sục khí tương tự, liên tục 0,25 vvm, để hàm lượng oxy hòa tan dịch lên men đạt p.p.m Mới đây, Chen cộng (2011) tiến hành tối ưu hóa điều kiện lên men dấm nồng độ cao Kết cho thấy vi khuẩn axít axetic Acetobacter vi sinh vật phát triển tốt điều kiện có mặt axít axetic nhiệt độ lên men dấm 30oC pH môi trường lên men yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới phát triển tạo axít axetic vi khuẩn axít axetic pH tác nhân hạn chế 61 hiệu suất chuyển hóa etanol thành axít axetic trình lên men dấm Trong nghiên cứu tìm thấy pH môi trường lên men tối ưu khoảng 4,8 – 5,1 phù hợp với đặc tính chung chủng vi khuẩn Acetobacter sp [45] Các tác giả cho thấy chủng vi khuẩn axít axetic Acetobacter LTH 2455 phát triển lên men axít axetic tốt môi trường lên men có pH = 4, thiết bị acetator dạng Pilot Frings, Đức Chen cộng (2011), môi trường lên men có pH 3; 4; 5; 6; 8, sinh khối vi khuẩn axít axetic thu tăng từ 0,38 đến 0,95 g/L Điều pH môi trường nuôi cấy ảnh hưởng tới chức thành tế bào, cấu trúc tế bào, hấp thụ nhiều loại chất dinh dưỡng trình sinh tổng hợp chất trao đổi chất Đối với chủng Acetobacter CCTCCM209061, pH ban đầu = tốt sinh trưởng tế bào (0,95 g/L) Quá trình sinh trưởng tạo axít axetic vi khuẩn axít axetic bị ức chế pH > hoàn toàn không phát triển pH ≤ pH ≥ Từ kết phân tích bề mặt đáp ứng trên, điều kiện lên men dấm tối ưu xác định nhiệt độ nằm khoảng từ 31,1 đến 31,9oC pH môi trường từ 4,8 đến 5,1, sau trình lên men thu dấm có hàm lượng axít axetic lớn 44,03 g/L tốc độ tạo axít axetic trình lên men đạt giá trị cực đại 4,86 g/L/ngày 3.3 SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM QUY MÔ 2000 LÍT/MẺ Thiết bị: Thiết bị lên men hoạt động theo mô hình thiết bị Frings acetator (phụ lục) Môi trường điều kiện trình lên men: Tiến hành lên men dấm với môi trường điều kiện xác định mục 3.2 với qui mô 1.500L/mẻ thiết bị 2.000L Thực nghiệm sản xuất Diễn biến trình lên men dấm đợt lên men trình bày bảng 3.14 hình 3.9 62 Bảng 3.14 Kết đợt lên men Chu kỳ Hàm lượng axít (g/L) Ban đầu Kết thúc 20,6 64,6 19,6 65,3 19,4 67,8 20,4 68,0 Etanol (g/L) Ban đầu 42,5 42,3 42,0 41,8 Kết thúc 4,9 2,6 4,3 3,9 Tốc độ axít Hiệu hóa trung suất chuyển bình RA(g/L/h) hóa (%) 0,37 90,0 0,95 88,5 1,34 98,8 1,98 96,6 Thời gian (h) 120 48 36 24 Hình 3.9 Sự phát triển vi khuẩn, thay đổi a xít axetic etanol chu kỳ lên men thứ qui mô 2.000L Hình 3.9 cho thấy chu kỳ thứ đợt lên men, pha lag kéo dài đến 30h Sự thay đổi axít, cồn sinh khối tế bào không quan sát thấy giai đoạn Như vi khuẩn sử dụng lượng để tổng hợp enzym cần thiết cho trình phá hủy chất (Brock TD and Madigan MT, 1991) Sự lên men chuyển hóa etanol thành axít axetic chủ yếu thực từ sau 30h đến 115h trình lên men, mà vi khuẩn pha log chúng pha tĩnh Tuy nhiên, nồng độ etanol giảm xuống g/L trình lên 63 men dừng lại để tránh oxy hóa 1.000L dịch dấm rút bổ sung vào 1.000L rượu có nồng độ etanol 60 g/L Bảng 3.14 cho thấy, từ chu kỳ 3-4 chuyển hóa etanol thành axít axetic nhanh nhiều so với chu kỳ thứ nên thời gian lên men giảm đáng kể (còn 24h – 48h), đồng thời hiệu suất chuyển hóa từ etanol thành axít axetic cao (>90%) chứng tỏ đặc điểm tính di truyền chủng vi khuẩn D4 có tính ổn định cao Sử dụng giống từ mẻ lên men trước rút ngắn thời gian lên men Sản xuất thử nghiệm cho thấy so sánh với phương pháp lên men dấm truyền thống, hàm lượng axít axetic sản phẩm tạo cao nhiều (>60 g/L so với 30 – 40 g/L), thời gian lên men dấm giảm xuống đáng kể (chỉ – ngày so với 20 – 25 ngày) Đây ưu điểm rõ rệt công nghệ sản xuất dấm ăn theo phương pháp lên men chìm Kết dẫn đến làm tăng suất sản phẩm, giảm chi phí sản xuất, giảm giá thành sản phẩm, nâng cao sức cạnh tranh sản phẩm thị trường Bảng 3.15 chất lượng sản phẩm Dấm gạo TT Tên tiêu Thành phần chủ yếu Hàm lượng axít toàn phần Hàm lượng chất khô hòa tan Hàm lượng axít cố định pH Đặc điểm cảm quan Trạng thái Màu Mùi vị Đơn vị g/L g/L g/L Hàm lượng 40,4 1,56 0,82 2,9 Dạng lỏng Trắng đục Mùi thơm đặc trưng, vị chua dịu, mùi lạ Các yếu tố hàm lượng etanol, mức độ axít hóa, pH dịch ban đầu, nhiệt độ lên men, phương pháp sục khí có ảnh hưởng lớn đến trình lên men dấm theo phương pháp chìm Nghiên cứu xác định thông số công nghệ 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với kết đạt được, hoàn thành mục tiêu nội dung nghiên cứu: Tuyển chọn chủng vi khuẩn A pasteurianus D4 có nhiều ưu điểm như: lên men môi trường có nồng độ etanol cao (9%v/v), khả chuyển hóa etanol thành axít axetic đạt hiệu suất cao (> 90%), có khả lên men dải nhiệt độ cao từ 30 – 34oC, phù hợp với điều kiện sản xuất Xác định thông số công nghệ thích hợp cho trình lên men dấm chủng A pasteurianus D4 theo phương pháp chìm là: hàm lượng etanol hàm lượng axít axetic ban đầu tương ứng 40g/L 20 g/L, pH dịch lên men 5,0; nhiệt độ lên men 31,1 – 31,9oC, tốc độ sục khí 0,2 v.v.m Quá trình lên men có tốc độ tạo axít axetic đạt giá trị cực đại 4,86 g/L/ngày Sản xuất thử nghiệm thiết bị 2.000L thu sản phẩm dấm có hàm lượng axít đạt 60 g/L, thời gian lên men ngắn từ 24 – 48h (chu kỳ – 4) KIẾN NGHỊ Với kết nghiên cứu sản xuất thành công dấm ăn công nghệ lên men chìm với tiêu chí: chất lượng cao, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, giá thành hợp lý Chúng kiến nghị quan nhà nước có sách hỗ trợ để nhân rộng mô hình sản xuất, nghiên cứu quy mô lớn (10.000L/mẻ), sản phẩm dấm ăn tiêu thụ thuận lợi thị trường 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Dương Đức Tiến (1975), Vi sinh vật học, tập 1, Nhà xuất Đại Học THCN Hà Nội (trang 274 – 316) Nguyễn Văn Đạt, Ngô Văn Tám 1975 Phân tích Lương thực - Thực phẩm Bộ lương thực thực phẩm, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, trang 149 Vũ Thị Hồng (2000) Chọn khảo sát đặc điểm phân loại, ứng dụng vi khuẩn acetic, Luận văn thạc sĩ, Trường đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh 105 trang Lê Thanh Mai (2000) Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Lê Văn Nhương, Tô Kim Anh, Nguyễn Liêu Ba, Nguyễn Văn Cách, Nguyễn Văn Dũng, Nguyễn Viết Dũng, Trần Liên Hà, Nguyễn Thị Lam, Trịnh Thị Ngọt, Đinh Văn Sâm, Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Tụ, Trần Xoa, Nguyễn Thị Anh Nhân (1990) Nghiên cứu công nghệ sản xuất dấm axít axetic dấm suất cao, Báo cáo khoa học 1986 – 1990, chương trình 52D, Đề tài 52D-03-04 66 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Adams MR (1985), Vinegar in Microbiology of fermented foods, 1st ed, New York, Elsevier Applied Science Publishers.147 Allgeier RJ, Hildebrandt FM (1960), Newer developments in vinegar manufacture, Adv Appl Microbiol 11:163-181 AOAC.1995 Officia Methods of Analysis, 15th ed.; Association of Official Analytical Chemist: Washington, DC Beheshti Maal, K and R Shafiei (2012), Characterization of an Acetobacter strain isolate from Iranian peach that tolerates high temperatures and ethanol concentrations, Int J Biol Life Sci 4:239 – 243 Boonmee M and Intarapanich S (2006), Evaluation of Acetobacter spp for Acetic Acid Production Capabilities, In: The Proceedings of 18th Annual Meeting of the Thai Society for Biotechnology, 2–3 November 2006 The Montien Riverside Hotel, Bangkok, Thailand Brock TD, Madigan MT (1991), Biology of microorganisms, 6th ed., Englewood Cliffs, NJ: Pretice-Hall Czuba J, increase of Acetobacter biomass and acidification rate in submerged fermentation, Acta Aliment, Po 14 (1988), 183-192 Cruess WV, (1958), Commercial fruit and vegetable products: Chapter 21 – Vinegar manufacture 1sted, New York: McGraw-Hill Book Company, Inc p 681-707 De Ory I, Romero LE, Cantero D., (1998), Modelling the kinetics of growth of Acetobacter aceti in discontinuous culture: influence of temperature of operation, Appl Microbiol Biotechnol; 49:189–93 De Ory I, Romero LE, Cantero D., (1999), Maximum yield acetic acid fermenter Comparative fed-batch and continuous operation studies at pilot plant scale, Bioprocess Engineering, 52, 31-37 De Ory I, Romero LE, Cantero D., (2002), Optimum starting-up protocol of a pilot plant scale acetifier for vinegar production, J Food Eng; 52:31–7 Doehlert, D.H., (1970), Uniform shell designs Applied Statistics, 19, 231– 239 Entani E, Asai M, Tsujihata S, Tsukamoto Y, Ohta M, (1998), Antibacterial action of vinegar against food-borne pathogenic bacteria including Escherichia coli O157:H7, J Food Prot, 61:953–9 Fregapane G, Rubio-Fernandez H, Salvador MD., (1999), Wine vinegar production using a noncommercial 100-litre bubble column reactor equipped with a novel type of dynamic sparger Biotechnologic Bioengineering 63 :141-146 Fregapane G, Hipolito RF, Salvador MD., (2001) Influence of fermentation temperature on semi-continuous acetification for wine vinegar production, Eur Food Res Technol; 213:62–6 67 21 Fushimi T, Tayama K, Fukaya M, Kitakoshi K, Nakai N, Tsukamoto Y, Sato Y, (2001), Acetic acid feeding enhances glycogen repletion in liver and skeletal muscle of rats, J Nutr, 131:1973–7 22 Garrido-Vidal D, Pizarro C, González-Sáiz JM., (2003), Study of process variables in Industrial acetic fermentation by a continuous pilot fermenter and response surfaces, Biotechnol Prog, 19: 1468–79 23 Garrity, G.M., J Bell, and T.G Liburn (2004), Taxonomic Outline of the Prokaryotes, Bergey’s Manual of systematic Bacteriology, 2nd ed, Release 5.0, Springer-Verlag, DOI:10.1007/bergeysonline 24 Gerbi V, Zeppa G, Atonelli A, Natali N, Caracini A (1997), Mutivariate analysis of composition and sensory quality criteria of white vinegar, Science Des Aliments 17:349-359 25 Ghommidh C, NavarroJM, Durand G, (1982), A study of acetic acid production by immobilized Acetobacter cells: oxygen transfer, Biotechnology and Bioengineering 24: 605-617 26 Hickey Richard J, Vaughn Reese H, (1954), Industrial fermentation: Chapter 17-acetic acid (vinegar) Vol1 New York: Chemical Publishing Co., Inc p 498-535 27 Hutkins, R.W., (2006), Microbiology and Technology of Fermented Foods Wiley Blackwell, pp 397–417 28 Ishikawa,M., Okamoto-Kainuma, A.,Matsui, K., Takigishi, A., Kaga, T., Koizumi, Y., 2010 Cloning and characterization of clpB in Acetobacter pasteurianus NBRC 3283 Journal of Bioscience and Bioengineering, 110, 69–71 29 Luli, G.W., Strohl, W.R., 1990, Comparison of growth, acetate production, and acetate inhibition of Escherichia coli strains in batch and fed-batch fermentations Applied and Environmental Microbiology, 56, 1004–1011 30 Matsushita, K., H Toyama, and O Adachi, (1994), Respiratory chains and bioenergetics of acetic acid bacteria, p 247–301, In A.H Rose and D.W Tempest (ed.), Advances in Microbial Physiology, vol 36, Academic Press, Ltd., London 31 Menzel, U., Gottschalk, G., 1985, The internal pH of Acetobacterium wieringae and Acetobacter aceti during growth and production of acetic acid Archives of Microbiology, 143, 47–51 32 Montooth, K.L., Siebenthall, K.T., Clark, C.G., 2006, Membrane lipid physiology and toxin catabolism underlie ethanol and acetic acid tolerance in Drosophila melanogaster The Journal of Experimental Biology, 209, 3837–3850 33 Nakano, S., Fukaya, M., Horinouchi, S., (2004), Enhanced expression of aconitase raises acetic acid resistance in Acetobacter aceti, Fems Microbiology Letters 35,315–322 68 34 Nakano, S., Fukaya, M., Horinouchi, S., (2006), Putative ABC transporter responsible for acetic acid resistance in Acetobacter aceti, Applied Microbiology and Biotechnology 72, 497–505 35 Nakano, S., Fukaya, M., (2008), Analysis of proteins responsive to acetic acid in Acetobacter: molecular mechanisms conferring acetic acid resistance in acetic acid bacteria, International Journal of Food Microbiology, 125, 54– 59 36 Ndoye B, Lebecque S, Dubois-Dauphin R, Tounkara L, Kere C, Diawara B, et al., (2006), Thermoresistant properties of acetic acids bacteria isolated from tropical products of Sub-Saharan Africa and destined to industrial vinegar Enzyme Microb Technol, 39(4):916–23 37 Ndoye B, Weekers F, Diawara B, Guiro AT, Thonart P., (2007), Survival and preservation of thermoresistant acetic acids bacteria (TAAB) isolated from tropical products of Sub-Saharan Africa and destined to industrial vinegar J Food Eng, 79(4):1374–82 38 Nieto J, González-Viñas MA, Barba P, Martín-Álvarez PJ, Aldave L, García Romero E, Cabezudo MD, (1993) Recent progress in wine vinegar R&D and some indicators for the future, In Charalambous G, ed Food flavor, ingredients and composition New York: Elsevier Science p 469–99 39 Nogueira A, Guyot S Marnet N, Lequéré J M, Drilleau J F, Wosiacki G., (2008), Effect of alcoholic fermentation in the content of phenolic compounds in cider processing Brazilian Archives of Biology and Technology, 51 :1025-1032 40 Okamoto-Kainuma, A., Yan, W., Kadono, S., Tayama, K., Koizumi, Y., Yanagida, F., (2002), Cloning and characterization of groESL operon in Acetobacter aceti, Journal of Bioscience and Bioengineering 94, 140–147 41 Ohmori S, Masai H, Arima K, Beppu T.,(1980), Isolation and identification of acetic acid bacteria for submerged acetic acid fermentation at high temperature, Agric Biol Chem, 44(12):2901-6 42 Roger Phan Tan Lưu et al., (2003), Nemrord Optimization Disk 43 Romero, L.E., Gómez, J.M., Caro, I., Cantero, D., (1994), A kinetic model for growth of Acetobacter aceti in submerged culture Chemical Engineering Journal and Biochemical Engineering Journal 54, B15–B24 44 Saeki A, Theeragool G, Matsushita K, Toyama H, Lotomg N, Adachi O., (1997), Development of thermotolerant acetic acid bacteria useful for vinegar fermentation at higher temperatures, Biosci Biotechnol Biochem, 61: 138–45 45 Sokollek SJ and Hammes WP., (1997), Description of a Starter Culture Preparation for Vinegar Fermentation System Appl Microbiol, 20:481–491 46 Tesfaye W, García-Parrilla MC, Troncoso AM (2000), Set up and optimization of a laboratory scale fermentor for the production of wine vinegars, J Inst Brew, 106:215–19 69 47 Tesfaye W, Morales ML, García-Parrilla MC, Troncoso AM (2002), Evolution of phenolic compounds during an experimental aging in wood of sherry vinegar, J Agric Food Chem, 50:7053–61 48 Tesfaye W, Morales ML, García-Parrilla MC, Troncoso AM (2003), Optimising wine vinegar production: fermentation and ageing, Applied Biotechnology, Food Science and Policy: 1(2) 49 Theron, M.M., Lues, J.F.R., 2011, Organic acid and Food Preservation, Taylor& Francis Group, pp 117-120 50 Vinegar Institute (2006) Market Trends [available at www.versatilevinegar.org/markettrends.html] 51 Yamada,Y., K Katsura, H Kawasaki,Y.Widyastuti, S Saono, T Seki, T Uchimura, and K Komagata 2000 Asaia bogorensis gen nov., sp nov., an unusual acetic acid bacterium in the Proteobacteria, Int J Syst Evol Microbiol 50:823–829 52 Yamada Y, Yukphan P (2008), Genera and species in acetic acid bacteria, Int J Food Microbiol, 125:15-24 53 Zengliang Qi, Hailin Yang, Xiaole Xia, Wu Quan, Wu Wang, Xiaobin Yu, (2014), Achieving high strength vinegar fermentation via regulating cellular growth status and aeration strategy, Process Biochemistry 70 PHỤ LỤC Hình ảnh thiết bị lên men 2.000L 71 [...]... Pháp) 18 2: Phương pháp nhanh (phương pháp Đức) 3: Phương pháp tổ hợp (là phương pháp kết hợp của hai phương pháp Pháp và phương pháp Đức) 4: Phương pháp lên men chìm 1.5.2.1 Phương pháp chậm - Thùng lên men: người ta thường sử dụng thùng lên men bằng gỗ, sành sứ, thủy tinh với yêu cầu có bề mặt thoáng lớn Quá trình lên men dấm chủ yếu diễn ra trên bề mặt thoáng - Dịch lên men : thường có đầy đủ các chất... tố ảnh hưởng tới quá trình lên men dấm theo phương pháp chìm Lên men dấm là một quá trình phức tạp, có rất nhiều các nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng Quá trình sản xuất dấm bằng phương pháp lên men chìm, các yếu tố có ảnh hưởng quyết định như: thành phần các chất dinh dưỡng có trong dịch lên men, pH, nhiệt độ lên men, nồng độ oxy hòa 22 trộn trong dịch lên men, và có thể kể... có tính chất tham khảo 1.5.2.3 Phương pháp tổ hợp Phương pháp này là phương pháp kết hợp giữa phương pháp lên men chậm và phương pháp lên men nhanh được sử dụng chủ yếu ở Liên Xô cũ Thiết bị lên men gồm hai phần: - Phần trên: cấu tạo như thùng lên men theo phương pháp nhanh, bên trong thùng đổ đầy đệm, hoạt động theo phương pháp lên men nhanh - Phần dưới: chứa dịch lên men sau khi đi qua lớp đệm Ở phần... nhiều phương pháp lên men dấm, mỗi phương pháp lại có những ưu và nhược điểm khác nhau Phụ thuộc vào trình độ cũng như quy mô sản xuất mà ta có thể lựa chọn phương pháp lên men phù hợp nhất để có thể sản xuất dấm đạt được hiệu quả cao nhất với chi phí thấp nhất Thực tiễn sản xuất cho thấy có bốn phương pháp lên men được sử dụng rộng rãi là: 1: Phương pháp chậm (phương pháp Pháp) 18 2: Phương pháp nhanh... để cung cấp oxy, quá trình lên men vẫn tiếp tục diễn ra trong toàn bộ khối dịch Trong trường hợp hệ thống sục khí bị ngắt hay không hoạt động, các van thông khí sẽ được mở ra để quá trình lưu thông khí diễn ra không làm ảnh hưởng tới quá trình lên men (quá trình lên men sẽ diễn ra trên bề mặt thoáng của dịch lên men) Phương pháp tổ hợp đã khắc phục được hạn chế của phương pháp lên men chậm và được... lượng rượu trong dịch lên men còn khoảng 0,2 – 0,5% cồn, ta nên tiến hành rút dấm vào các thùng tàng trữ và đem đi bảo quản Mô hình sản xuất dấm bằng phương pháp lên men chìm ở quy mô công nghiệp được đề xuất bởi Adams (1985) Hệ thống phải được làm mát liên tục trong suốt quá trình lên men [15] Theo như nghiên cứu sản xuất của mô hình này thì các thông số tối ưu cho quá trình lên men là ở 86oF, sản phẩm... và chuyển hóa, tích lũy sản phẩm Thông thường các ảnh hưởng này thường diễn ra theo hướng bất lợi đối với yêu cầu sản xuất Chính vì vậy, việc đảm bảo môi trường đáp ứng đầy đủ các chất dinh dưỡng là cần thiết đặc biệt với quá trình lên men dấm bằng phương pháp lên men chìm theo phương pháp lên men chìm sản xuất từ rượu cồn 1.5.3.4 Ảnh hưởng của quá trình thông khí Theo như phương trình tổng quát (1)... lên men dấm bằng phương pháp lên men chìm, hương thơm của dấm có được là do thành phần nguyên liệu dùng để tiến hành lên men, thông số của quá trình lên men, thời gian tàng trữ, loại thùng dùng để tàng trữ Vì vậy, không có một tiêu chuẩn cụ thể nào dùng để đánh cho tất cả các loại dấm Phân tích thành phần hóa học của dấm cũng chỉ có thể phần nào giúp ta nhận biết một số loại dấm khác nhau Phương pháp. .. lâu dài, không bị thoái hóa giống trong suốt quá trình lên men dấm - Các điều kiện phân lập, nuôi cấy, bảo quản giống phải đơn giản, có chi phí thấp 1.4 CƠ CHẾ CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXETIC - Lên men axetic thực chất là quá trình oxy hóa rượu etanol thành axít axetic trong điều kiện hiếu khí dưới tác dụng của enzyme oxy hóa của vi khuẩn axetic Phương trình tổng quát của quá trình như sau: CH3CH2OH +... môi trường lên men trong phòng thí nghiệm - Cấp dịch lên men: quá trình cấp dịch diễn ra khi mẻ dấm trước đã kết thúc, dịch lên men sẽ được bơm vào thùng lên men thông qua bơm - Vận hành thiết bị: thiết bị lên men chìm tuy có thiết kế phức tạp hơn so với thiết bị các phương pháp lên men khác nhưng vận hành khá dễ dàng vì không cần nhiều nhân lực do thiết bị vận hành tự động - Thu hoạch dấm chín: khi