Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình thủy phân cá tạp để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng làm thức ăn cho cá lóc bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

B GIÁO D O IH CM TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P tài: NGHIÊN C U T PHÂN CÁ T S QUY TRÌNH TH Y S N XU T CH PH M SINH H C D NG LÀM TH B CH TH C NGHI M KHOA CÔNG NGH SINH H C Chuyên ngành: Vi sinh – Sinh h c phân t GVHD: SVTH: Ths Nguy ng Hồng Nhân MSSV: 1053010516 Khóa: 2010 - 2014 5, 2014 L IC L u tiên, bày t lòng bi th c hi n gian th c t p Em xin c H h c v a qua tài th c t p Em xin c c nh t cho ba m ng, d y d r t nhi u th i gian em su t th i y cô Khoa Công ngh Sinh h c, i h c M Thành ph n tâm gi ng d y cho em gi ng d y cho em su t nh Em xin g i l i c Nh t Linh tài th c t p n th y Nguy ng vi n, t o m n ki n t t nh em Em xin g i l i c n , ch Võ Ng c Y n Nhi, ch Nguy n Th M Linh anh ch phịng thí nghi m Cơng ngh V cho em nh ng kinh nghi m quý báu Tôi xin c n th c hi t i phịng thí nghi m Cơng ngh Vi sinh t p Tôi xin c th n th i gian qua ib nc tài th c t c vi c tơi r t nhi u q trình th c ng viên tinh Tôi xin chân thành c ng Hồng Nhân i SVTH NG HỒNG NHÂN DANH M C DANH M C T T VI T T T VI T T T Ti ng Vi t Ch ng b ng sông C u Long NN & PTNT Nông nghi p Phát tri n nông thôn NT Nghi m th c NTTS nuôi tr ng th y s n NXB Nhà xu t b n PTN Phịng thí nghi m TP.HCM Thành Ph H Chí Minh tr trang trung tâm ho VK vi khu n VSV ng vi sinh v t Ti ng Anh BOD Biochemical oxygen Demand CFU Colony forming unit COD Chemical oxygen Demand NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth NCBI the National Central for Biotechnology Information No number pp page RSM Response Surface Methods Vol Volume ii SVTH NG HOÀNG NHÂN DANH M C DANH M C HÌNH Channa striata Hình 1.2 Bacillus i kính hi n t 17 Hình 1.3 Thi t k CCD v m góc (cube m d c tr c l n l p l it m thí nghi m trung tâm (0, 0) 32 Hình 1.4 Ma tr n b trí thí nghi m theo thi t k Box – Behnken 33 Hình 1.5 Màn hình làm vi c c a ph n m m Minitab 16 35 i th (a) vi th (×100) (b) c a ch ng B polyfermenticus F27 60 i th (a) vi th (×100) (b) c a ch ng Bacillus subtilis Q111 61 Hình 3.3 K t qu th nghi m kh a ch ng B polyfermenticus F27 (a) B subtilis Q111 (b) 61 Hình 3.4 K t qu thí nghi i kháng vi khu n gây b nh Pseudomonas c a ch ng thí nghi m 62 Hình 3.5 K t qu thí nghi i kháng vi khu n gây b nh Streptococcus c a ch ng thí nghi m 63 Hình 3.6 K t qu thí nghi a ch ng thí nghi m 64 Hình 3.7 K t qu t y phân nguyên li u cá b ng công c t a ph n m m Minitab 16 81 Hình 3.8 K t qu t b ng cơng c t VSV sau q trình th y phân nguyên li u cá a ph n m m Minitab 16 83 Hình 3.9 K t qu t c tiêu hi u qu th y phân m VSV sau trình th y phân nguyên li u cá b ng công c t a ph n m m Minitab 16 84 Hình ph l c 2a K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v m VSV c a nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng nguyên li u cá t p 95 Hình ph l c 2b K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v ch s t ng s c a nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng nguyên li u cá t p 96 Hình ph l c 2c K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v ch s m axit amin ngày c a nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng nguyên li u cá t p 97 iii SVTH NG HỒNG NHÂN DANH M C Hình ph l c 2d K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v ch s m axit amin ngày c a nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng nguyên li u cá t p 98 Hình ph l c 4a Thơng tin mơ hình h i quy c a thí nghi nh y u t nh ng 100 Hình ph l c 4b K t qu a thí nghi nh y u t ng 100 Hình ph l c 6a Thơng tin mơ hình h i quy c a thí nghi m kh i d u 102 Hình ph l c 6b K t qu a thí nghi m kh i d u 102 Hình ph l c 7a Thơng tin mơ hình h i quy c a thí nghi m b m t ch tiêu cho m axit amin 103 Hình ph l c 7b K t qu a thí nghi m b m t ch tiêu cho m axit amin 103 Hình ph l c 8a Thơng tin mơ hình h i quy c a thí nghi m b m t ch tiêu cho hàm m VSV 104 Hình ph l c 8b K t qu a thí nghi m b m t ch tiêu cho hàm m VSV 104 iv SVTH NG HOÀNG NHÂN DANH M C DANH M C B NG B ng 1.1 Thi t k thí nghi m Plackett – Burman v i 11 y u t 27 B ng 2.1 B ng b trí thí nghi m kh o sát nhi kh trùng 53 B ng 2.2 Giá tr bi n s thí nghi nh y u t n trình th y phân theo thi t k Plackett – Burman 54 B i th vi th c a ch ng vi khu n th nghi m 60 B ng 3.2 So sánh m vi sinh v t nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng 65 B ng 3.3 K t qu ki m tra ch s m c a thí nghi m kh o sát nhi kh trùng 66 B ng 3.4 B trí k t qu thí nghi nh y u t ng theo thi t k Plackett - Burmen 69 B ng 3.5 Giá tr bi n s c a thí nghi m kh u theo thi t k Plackett – Burman 72 B ng 3.6 B trí k t qu thí nghi m kh ut u t nh h ng 73 B ng 3.7 B trí k t qu thí nghi m b m t ch tiêu t u t nh ng 76 v SVTH NG HOÀNG NHÂN DANH M C DANH M - BI ng nghiên c u c - TH ch th c nghi m 24 thí nghi m 39 Bi 3.1 So sánh m vi sinh v t c a nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng 65 Bi 3.2 So sánh ch s ng s c a nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng 66 Bi 3.3 So sánh ch s m axit amin c a nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng t i th m ngày 67 Bi 3.4 So sánh ch s m axit amin c a nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng t i th m ngày 67 th 3.5 M ng c a b n y u t kh o sát thí nghi nh y ut ng 70 th 3.6 Hàm m c tiêu v i y u t n NaCl m u ph m vi kh o sát 71 th 3.7 Hàm m c tiêu v i y u t pH m u ph m vi kh o sát 72 th 3.8 M ng c a ba y u t kh o sát thí nghi m kh u 74 th ng m c (bên trái) b m ng (bên ph i) c a t ng c p y u n trình th y phân 80 th ng m c (bên trái) b m ng (bên ph i) c a t ng c p y u nm VSV sau trình th y phân 82 t t th ph l c 3a m axit amin c a thí nghi ng chu n hóa c a y u t kh iv in nh y u t ng 99 th ph l c 3b Pareto c a y u t kh iv in m axit amin c a thí nghi nh y u t ng 99 th ph l c 5a ng chu n hóa c a y u t kh iv in m axit amin c a thí nghi m kh u 101 th ph l c 5b Pareto c a y u t kh iv in m axit amin c a thí nghi m kh u 101 vi SVTH NG HOÀNG NHÂN M CL C TV PH N T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Tình hình ni cá lóc t i Vi t Nam 1.1.1 Gi i thi u cá lóc Channa striata 1.1.2 L ch s ngh ni cá lóc 1.2 Các v hi n 1.2.1 Thi u h t ngu n th 1.2.2 V c a ngu n th 1.2.3 Ô nhi nhiên p c 10 1.2.4 D ch b nh 11 i quy t 12 1.3.1 Ch t d n d 12 1.3.2 Probiotic 13 1.4 Bacillus 17 1.5.1 Bacillus subtilis 18 1.5.2 Bacillus polyfermenticus 19 1.5.3 Kh a Bacillus 19 1.5.4 Các y u t n trình sinh enzym t Bacillus 20 1.5.5 ng d ng c a vi khu n Bacillus nuôi tr ng th y s n 21 1.6 Tình hình nghiên c u hi n 23 c 23 c 23 1.7 T ch th c nghi m 24 ch th c nghi m 24 1.7.2 Thi t k tìm y u t 1.7.3 T ng c a Plackett – Burman 26 pháp b m t ch tiêu 28 1.7.4 Ph n m m Minitab 34 PH N V T LI U U 36 M CL C 2.1 Th m nghiên c u 37 2.2 V t li u nghiên c u 37 2.2.1 Nguyên li u 37 ng – Hóa ch t 37 2.3 Thi t b - D ng c 38 2.3.1 Thi t b 38 2.3.2 D ng c 38 thí nghi m 39 nh m vi sinh v t 40 nh tr c ti p m b m bu m h ng c u 40 nh gián ti p s ng t bào b ms ng khu n l c 41 m 42 ng s b 42 háp chu Sörensen) 44 m amoniac b c 45 m axit amin 47 2.7 i th vi th c a ch ng vi khu n th nghi m 47 i th 47 2.7.2 Quan sát vi th b 2.8 Thí nghi m kh m Gram 47 a ch ng th nghi m 48 2.8.1 Nguyên lý 48 2.8.2 Chu n b 49 2.8.3 Ti n hành 49 c k t qu 49 2.9 Thí nghi m kh i kháng v i vi khu n gây b nh cá lóc c a ch ng th nghi m 50 2.9.1 Nguyên lý 50 2.9.2 Chu n b 50 viii SVTH NG HOÀNG NHÂN M CL C 2.9.3 Ti n hành 50 c k t qu 50 2.10 Thí nghi m kh a ch ng th nghi m 51 2.10.1 Nguyên lý 51 2.10.2 Chu n b 51 2.10.3 Ti n hành 51 c k t qu 52 2.11 nguyên li u cá t p 52 2.12 Thí nghi m kh o sát nhi kh trùng nguyên li u cá t p 52 2.12.1 Chu n b thí nghi m 52 2.12.2 Ti n hành thí nghi m 53 c k t qu 53 2.13 Thí nghi m x nh y u t ng 53 2.13.1 Thi t k thí nghi m 53 2.13.2 Ti n hành thí nghi m 54 c k t qu 55 2.14 Thí nghi m kh u 55 2.14.1 Thi t k thí nghi m 55 2.14.2 Ti n hành thí nghi m 56 c k t qu 56 2.15 Tìm kho ng t a y u t ng b d c 56 2.15.1 Thi t k thí nghi m 56 2.15.2 Ti n hành thí nghi m 57 c k t qu 57 2.16 Thí nghi m b m t ch tiêu 57 2.16.1 Thi t k thí nghi m 57 2.16.2 Ti n hành thí nghi m 58 c k t qu 58 PH N K T QU VÀ TH O LU N 59 ix SVTH NG HOÀNG NHÂN TÀI LI U THAM KH O [20] Tr n Th H c u ng d ng enzyme protease t vi khu n (Bacillus subtilis ph ph m cá tra”, Khoa Th y S [21] th y phân i H c Nông Lâm TP.HCM c Ph m (2004), Công ngh Vi sinh v t, NXB Nông nghi p, Hà N i [22] Vi sinh v t h ng N ng [23] Minh Chung (2009), “Kh o sát mơ hình ni cá lóc (Channa micropeltes Channa striatus) Long”, Khoa Th y s [24] Nguy ih cC n (2007), R, Ch ng b ng Sông C u ng d n phân tích s li u v bi b ng i h c Qu c gia TP.HCM [25] Tr nh Ng c Tu n (2005), “Nghiên c u hi n tr ng khai thác, nuôi tr ng thu s n Vi xu c th i”, Vi n nghiên c u NTTS 1, Trung tâm nghiên c u, quan tr c, c ng phòng ng a d ch b nh thu s n khu v c mi n B c [26] Ph ), Công ngh sinh h c T Công ngh ng, NXB Giáo D c [27] Ph m Th Lan Thanh (2007), “Phân l nh danh nghiên c u ti Probiotic c a vi khu n Lactobacillus có ngu n g c t Th [28] – c ih cT i”, Lu i h c Qu c gia TP.HCM Th Bích Th y (2012), “Nghiên c u y u t n s thu nh n ch ph m protease ngo i bào c a Bacillus amyloliquefacien n1” T p chí khoa h i h c Hu , 71(2) [29] Nguy n Th Tr n Th y (2009), “Nghiên c u n ch n ch ng vi khu n Bacillus phân l p t h c ih n sinh Protease ki m”, Lu m TP.HCM, B Giáo d o 90 SVTH NG HOÀNG NHÂN TÀI LI U THAM KH O Ti ng Anh [30] Arvanitoyannis I S and Kassaveti A (2006), “Fish industry waste: treatments, environmental impacts, current and potential uses”, International Journal of Food Science and Technology, 43, pp 726 – 745 [31] Esteban M.B., Garcia A.J., Ramos P & Marquez M.C (2006), “Evaluation of fruit–vegetable and fish wastes as alternative feedstuffs in pig diets” Waste Management, 27, pp 193 – 200 [32] Gao M T., Hirata M., Toorisaka E., Hano T (2005), “Acid hyprolysis of fish wastes for lactic acid fermentation” Bioresource Technology, 97, pp 2414 – 2420 [33] Hammoumi A., Faid M., El Yachioui M & Amarouch H (1998), “Characterization of fermented fish waste used in feeding trials with broilers” Process Biochemistry, 33, pp 423 – 427 [34] Harley J P Prescott L M (2002), Laboratory Exercises in Microbiology, 5th Edition [35] Harry P R (1965), “A Bacillus subtilis proteinase”, The Journal of Biological Chemistry, 240(1) [36] Holt J G., Krieg N R., Sneath P H A., Staley J T., Williams S T (2000), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th Edition [37] Ikram-ul-Haq and Mukhtar H (2006), “Biosynthesis of protease from Lactobacillus paracasei: Kinetic analysis of fermentation parameters” [38] Kashyap D R., Chandra S., Kaul A., Tewari R (2000), “Production, purification and characterization of pectinase form Bacillus sp DT7”, World Journal of Microbiology & Biotecnology, 16, pp 277 – 282 [39] Kim K M., Myo J K., Dong H K., You S P., Jae S K (2009), “Characterization of Bacillus polyfermenticus KJS-2 as a Probiotic”, J Microbiol Biotechnol., 19(9), pp 1013 – 1018 [40] Kim Y S., Park J W & Choi Y J (2003), “New approaches for the effective recovery of fish proteins and their physicochemical characteristics” Fisheries Science, 69, pp 1231 – 1239 91 SVTH NG HOÀNG NHÂN TÀI LI U THAM KH O [41] Konsoula Z., Kyriakides M L (2005), “ -amylase production in aqueous two-phase systems by Bacillus subtilis”, FEBS Journal, 272, pp [42] Martone C B., Perez Borla O & Sanchez J J (2005), “Fishery byproduct as a nutrient source for bacteria and archaea growth media” Bioresource Technology, 96, pp 383 – 387 [43] Mayday E E., Paquet D., Ramet J P and Linden G (1986), “Proteolytic activity of a Bacillus subtilis neutral protease preparation upon caseins and whey proteins of cow’s milk” Journal of Dairy Science, 69(2), pp 305 – 310 [44] Nguyen T T., Nguyen T L., Lindberg J E and Ogle B., (2007) “Survey of the production, processing and nutritive value of catfish by-product meals in the Mekong Delta of Vietnam”, Livestock Research for Rural Development, 19 [45] Plackett R L., Burman J P (1946), “The Design of Optimum Multifactorial Experiments”, Biometrika, 33(4), pp 305 – 325 [46] Verschuere L., Rombaut G., Sorgeloos P., Verstraete W (2000) “Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture”, Microbiol Mol Biol Rev, 64(4), pp 655 – 671 92 SVTH NG HOÀNG NHÂN TÀI LI U THAM KH O Internet [47] Tr n Th Bé (2011), “B sung ch t d n d th y s n”, http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1605, 11/11/2013 [48] Ng c Di p (2011), “Kh c ph c hi th p”, ng cá lóc b Trung tâm ng Khuy n nông An Giang http://sokhcn.angiang.gov.vn/wps/portal/!ut/p/c4/04_SB8K8xLLM9MSSzP y8xBz9CP0os3j3oBBLczdTEwN3DwsLA08jc0Njd18PI2NXQ_2CbEdFA HgZ0vc!/?WCM_GLOBAL_CONTEXT=/wps/wcm/connect/sokhcn/siteof sokhcn/tintucsukien/khcn+trong+nuoc/53, 12/11/2013 [49] H c (2011), “Ni cá lóc- Ngh m i phát” http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/vi-vn/72/45/45/77979/Nuoi-ca-locnghe-moi-phat.aspx, 11/11/2013 [50] Nguy n Kim Ki ng cá lóc”, Trung tâm Khuy n nơng An Giang http://thuysanvietnam.com.vn/nguy-co-tu-thoaihoa-giong-ca-loc-article-2205.tsvn, 12/11/2013 [51] Nguy n Quang Minh (2013), “M t s gi i pháp phịng b nh cá lóc th i ti t giao mùa”, Tr m Th y s n huy n Tam Nông http://tepbac.com/technical/full/169-Mot-so-giai-phap-phong-benh-ca-lockhi-thoi-tiet-giao-mua.htm, 11/11/2013 [52] Ph m Th Tuy t Ngân (2011), “ ng d ng dịng Bacillus sp có ích ni tr ng Th y s n”, http://uv- vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1691 11/11/2013 [53] S Nông nghi p Phát tri n nông thôn t nh Th a Thiên Hu (2011), K thu t ni cá lóc nhím b http://khuyennonghue.org.vn/default.asp?sq=News&naid=541&caid=17, 11/11/2013 93 SVTH NG HỒNG NHÂN PH L C Ph l c ng NA b sung 5% s a g y Thành ph n 1000 mL: NB 13 g B ts ag y 50 g Agar 20 g 1000 mL cc t Cách pha: Pha NB 2/3 th 1/3 th c c t, h p ti t trùng c c t h p ti t trùng Cân s a g y vào 1/3 th cc Cho d ch s a g y vào d ch NB nhi 121 OC, 15 phút, atm 121 OC, 15 phút, atm p ti t trùng m 60 OC, l nhi 60 OC u 94 NG HOÀNG NHÂN PH L C Ph l c K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi m kh o sát nhi kh trùng nguyên li u cá t p Hình ph l c 2a K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v m VSV c a nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng nguyên li u cá t p 95 NG HOÀNG NHÂN PH L C Hình ph l c 2b K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v ch s t ng s c a nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng nguyên li u cá t p 96 NG HỒNG NHÂN PH L C Hình ph l c 2c K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v ch s m axit amin ngày c a nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng nguyên li u cá t p 97 NG HOÀNG NHÂN PH L C Hình ph l c 2d K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v ch s m axit amin ngày c a nghi m th c thí nghi m kh o sát nhi kh trùng nguyên li u cá t p 98 NG HOÀNG NHÂN PH Ph l c th y u t Pareto c a thí nghi nh y u t c chu ng L C th c v b ng ph n m m Minitab 16 th ph l c 3a ng chu n hóa c a y u t kh m axit amin c a thí nghi nh y u t th ph l c 3b Pareto c a y u t kh c a thí nghi nh y u t iv in iv in ng m axit amin ng 99 NG HOÀNG NHÂN PH L C Ph l c Thơng tin mơ hình h i quy k t qu c a thí nghi nh y u t n trình th y phân nguyên li u cá t p Hình ph l c 4a Thơng tin mơ hình h i quy c a thí nghi ng Hình ph l c 4b K t qu p a thí nghi nh y u t nh y u t ng 100 NG HOÀNG NHÂN PH Ph l c th y u t Pareto c a thí nghi m kh ut c chu ut L C th ng cv b ng ph n m m Minitab 16 th ph l c 5a ng chu n hóa c a y u t kh m axit amin c a thí nghi m kh u th ph l c 5b Pareto c a y u t kh c a thí nghi m kh iv in u iv in m axit amin 101 NG HOÀNG NHÂN PH L C Ph l c Thơng tin mơ hình h i quy k t qu c a thí nghi m kh ut ut n trình th y phân nguyên li u cá t p Hình ph l c 6a Thơng tin mơ hình h i quy c a thí nghi m kh i d u Hình ph l c 6b K t qu a thí nghi m kh i d u 102 NG HOÀNG NHÂN PH L C Ph l c Thơng tin mơ hình h i quy k t qu c a thí nghi m b m t ch tiêu t ut n trình th y phân nguyên li u cá t p Hình ph l c 7a Thơng tin mơ hình h i quy c a thí nghi m b m t ch tiêu m axit amin Hình ph l c 7b K t qu a thí nghi m b m t ch tiêu m axit amin 103 NG HOÀNG NHÂN PH L C Ph l c Thơng tin mơ hình h i quy k t qu c a thí nghi m b m t ch tiêu t ut nm t VSV có l i sau trình th y phân Hình ph l c 8a Thơng tin mơ hình h i quy c a thí nghi m b m t ch tiêu cho hàm m VSV Hình ph l c 8b K t qu a thí nghi m b m t ch tiêu cho hàm m VSV 104 NG HOÀNG NHÂN ... gi i quy t v sinh v D ch cá t c cho vào th nhiên c n thi p nh m b sung c phân h y b ng vi m ch t khống t c ni b ng cá t p s h n ch xu t hi n d t t Vi sinh v cá c ao nuôi h tiêu hóa c a cá s ng... i cho cá ng phát tri n Lo i cám u so v i lo i cám khác d hi u qu kinh t D ng cá lóc b Nhu n (Ch m kho ng ng ch t, theo anh Hu nh Thanh s n xu t cá lóc gi ng, p C n Thu n, xã C Thành), cá lóc. .. (2013) b nh cá nh ng nguyên nhân sau: Ch cb i - Nhi t ng n tháng (có th xu ng th p n 25 – 27 OC) nhi – 35 O n tháng hàng u làm cho cá b ut n 30 u ki n cho sinh v t gây b nh cá làm cho cá d b nh