Nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi dứa ananas comosus

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME BROMELAIN THÔ TỪ CHỒI DỨA (ANANAS COMOSUS) NGUYỄN PHÚ THỌ AN GIANG, THÁNG 04 NĂM 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME BROMELAIN THÔ TỪ CHỒI DỨA (ANANAS COMOSUS) NGUYỄN PHÚ THỌ AN GIANG, THÁNG 04 NĂM 2014 NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME BROMELAIN THÔ TỪ CHỒI DỨA (ANANAS COMOSUS) Ths Nguyễn Phú Thọ Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Nông nghiệp-TNTN Giới thiệu Bromelain loại proteinase tìm thấy dứa (Ananas comosus), ứng dụng rộng rãi y học chế biến thực phẩm Trong y học, bromelain dùng để giảm đau nhanh sau phẫu thuật, giảm đau trường hợp viêm khớp, viêm đa khớp, giảm thời gian làm tan vết bầm tím, chống viêm Bromelain cịn có khả chống đơng tụ tiểu cầu, làm giảm đột quỵ bệnh nhân bị bệnh tim mạch, tăng khả hấp thụ loại thuốc, đặc biệt thuốc kháng sinh amoxicilline, tetracycline kiểm soát phát triển tế bào ung thư Trong công nghiệp thực phẩm, bromelain dùng để làm mềm thịt, thủy phân gan bị, đơng tụ sữa, phá đục bia, thủy phân protein gluten sản xuất bánh mì làm khối bột nhào mềm dẻo hơn, tăng hương chất lượng bánh, Bromelain có tồn dứa phế phụ phẩm dứa Ở Việt Nam, nước nhiệt đới có sản lượng dứa lớn, việc tách bromelain từ phế phụ phẩm tạo chế phẩm thương mại ứng dụng công nghiệp chưa nhiều Ở nông trường trồng dứa, dứa bị bỏ khô đất vùi làm phân bón Trong ngành công nghệ chế biến dứa, phế phẩm dứa lõi, chồi, vỏ Phần phế phẩm chiếm tỷ lệ lớn lượng dứa nguyên liệu đưa vào chế biến, khoảng 70% Ở nhà máy chế biến rau quả, phần lớn phụ phẩm dứa đưa bãi rác gây ô nhiễm môi trường Xuất phát từ tình hình thực tế đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi dứa (Ananas comosus)” thực nhằm bước đầu xây dựng qui trình thu nhận bromelain thơ từ chồi dứa góp phần đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme; làm tăng giá trị kinh tế dứa Mặt khác, đề tài cịn góp phần giải phần nguồn phụ phẩm từ công nghiệp chế biến dứa Phương pháp nghiên cứu Phụ phẩm chồi dứa chọn chồi thu chợ địa bàn thành phố Long Xuyên Đề tài gồm thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng hai loại dung dịch trích ly đệm phosphat nước tỷ lệ trích ly khác đến bromelain từ chồi dứa; ảnh hưởng ba tác nhân tủa khác ethanol, acetone ammonium sulfate đến hoạt tính bromelain nồng độ khác nhau; ảnh hưởng nhiệt độ sấy 31-65 oC đến hoạt tính bromelain trình sấy kết tủa so sánh khả thủy phân phụ phẩm cá tra sản phẩm bromelain thí nghiệm bromelain thương mại Sau thí nghiệm tiến hành xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradfrod (1996) Xác định hoạt tính bromelain theo phương pháp Kunitz (1917) cải tiến, sử dụng casein làm chất thủy phân điều chỉnh để thực ống eppendorf Hoạt tính đặc hiệu định nghĩa số đơn vị hoạt tính enzyme mg protein (U/mg) Hoạt tính thu hồi hoạt tính bromelain sau tủa chia cho hoạt tính bromelain trước tủa nhân với 100 Protein thu hồi protein sau tủa chia cho protein trước tủa nhân với 100 Kết thảo luận 3.1 Ảnh hưởng dung dịch trích tỷ lệ ly trích đến bromelain chồi dứa Theo kết bảng hàm lượng protein thu cao 1,82 mg/ml ly trích nước với tỷ lệ 1/5 hoạt tính đặc hiệu thu thấp (2,04 U/mg) Tương tự, hoạt tính đặc hiệu thấp (2,27 U/mg) ly trích đệm tỷ lệ 1/5 Điều cho thấy hàm lượng nước cao enzyme dễ dàng bị hoạt tính Bảng Ảnh hưởng dung dịch trích ly tỷ lệ trích ly đến lượng protein hoạt tính đặc hiệu bromelain Dung dịch trích ly Đệm Nước Tỷ lệ Chồi:dung môi 1/2 1/3 1/4 1/5 1/2 1/3 1/4 1/5 Protein tổng (mg)* 1,33ab 1,25ab 1,61ab 1,52ab 1,18ab 1,15b 1,70ab 1,82a Hoạt tính đặc hiệu (U/mg)** 3,21a 3,43a 2,84abc 2,27bc 2,06bc 3,54a 2,89ab 2,04c Ghi chú: *cv = 26,3%; **cv = 17,6%; Protein tổng = (protein/tỷ lệ trích ly) Các giá trị trung bình theo sau ký tự cột khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa 5% Hoạt tính đặc hiệu bromelain ly trích tỷ lệ 1/3 đệm 3,43U/mg nước 3,54U/mg cao so với nghiệm thức lại Như cho thấy tỷ lệ 1/3 thích hợp cho việc trích ly bromelain từ chồi dứa sử dụng nước để trích ly bromelain tiết kiệm chi phí cho sản xuất 3.2 Ảnh hưởng tác nhân tủa đến hoạt tính enzyme bromelain chồi dứa Bảng Ảnh hưởng tác nhân tủa đến hoạt tính protein thu hồi enzyme bromelain chồi Tỷ lệ tủa Protein thu hồi (%)* Hoạt tính thu hồi (%)** Enzyme:ethanol:1:4 Enzyme:ethanol:1:5 Enzyme:ethanol:1:6 Enzyme:ethanol:1:7 Enzyme:acetone:1:1 Enzyme:acetone:1:2 Enzyme:acetone:1:3 Enzyme:acetone:1:4 Ammonium sulfate (30%) Ammonium sulfate (40%) Ammonium sulfate (50%) Ammonium sulfate (60%) 32,58b 38,48a 38,98a 36,52a 12,40f 15,85ef 19,29cde 15,85ef 17,25de 19,71cd 21,61c 19,78cd 36,96de 55,32ab 66,62a 43,08cde 50,14bc 33,19e 48,73bcd 43,55bcde 6,97f 10,03f 14,36f 12,48f Hoạt tính đặc hiệu (U/mg)*** 5,61e 7,04de 8,38d 5,78e 19,66a 11,00c 12,28bc 13,55b 1,97f 2,49f 3,26f 3,09f Ghi chú: *cv = 9,4%; **cv = 20,3%; ***cv = 15,6% Các giá trị trung bình theo sau ký tự cột khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa 5% Chồi dứa sau trích ly nước với tỷ lệ chồi:nước:1:3 xác định hàm lượng protein ban đầu (trước tủa) 1,17 mg/ml, hoạt tính 5,72 U/ml hoạt tính đặc hiệu 4,88 U/mg Kết bảng cho thấy với tác nhân tủa ethanol tỷ lệ enzyme:ethanol 1/6 có protein thu hồi (38,98%), hoạt tính thu hồi (66,62%) hoạt tính đặc hiệu (8,38 U/mg) cao so với tỷ lệ ethanol khác Hoạt tính thu hồi hoạt tính đặc hiệu tủa với ammonium sulfate thấp so với ethanol acetone Hoạt tính thu hồi cao tủa ammonium sulfate 14,36%, hoạt tính đặc hiệu 3,26 U/mg Điều cho thấy ammonium sulfate khơng cho hiệu tủa tốt bromelain chồi kết tủa chứa nhiều protein tạp Đối với tác nhân tủa acetone tỷ lệ 1/1 hoạt tính đặc hiệu bromelain thu cao 19,66 U/mg gấp lần so với mẫu tủa ethanol tỷ lệ 1/6 (8,38 U/mg) gấp lần so với mẫu tủa ammonium sulfate 50% (3,26 U/mg) Như acetone tỷ lệ 1/1 thích hợp để tinh sơ bromelain chồi, protein thu hồi tương đối thấp (khoảng 12,4%), hoạt tính đặc hiệu cao chứng tỏ chế phẩm tinh 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính bromelain q trình sấy kết tủa Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính đặc hiệu enzyme bromelain qua q trình sấy Hoạt tính đặc hiệu (U/mg)* (oC) o (30 C) ax 14,48 a x 45 15,47 55 15,64a 65 Trung bình Trung bình (giờ) x a x 14,34 14,99 14,15 c x bc x 13,71 11,98b y a y 3,13 10,74 8,08 b y 12,24 b y 13,12 10,18 8,36b z a z 0,00 12,00 5,82 6,65 Ghi chú: *cv = 11,1%; Các kí tự từ a – b so sánh trung bình cột, kí tự từ x – z so sánh trung bình hàng Các kí tự giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% Kết bảng cho thấy thời gian sấy kéo dài hoạt tính bromelain chế phẩm bromelain giảm: Ở nhiệt độ phòng hoạt tính bromelain giảm nhanh theo thời gian sấy Do làm khô tủa bromelain chồi nhiệt độ phịng Ở nhiệt độ 45 °C, hoạt tính bromelain sấy 15,47 U/mg giảm 13,71 U/mg sau sấy Sau sấy hoạt tính bromelain 10,18 U/mg giảm đáng kể so với thời gian Như thời gian sấy thích hợp cho bromelain chồi 45 oC Ở 55 oC kéo dài thời gian sấy hoạt tính bromelain giảm nhanh theo thời gian có khác biệt ý nghĩa mốc thời gian sấy Ở nhiệt độ 65 °C, sau sấy hoạt tính giảm thấp sau hoạt tính bromelain hồn tồn nhiệt độ cao làm biến tính enzyme Như sấy kết tủa bromelain chồi 65 oC Kết thí nghiệm cho thấy chế phẩm bromelain sấy nhiệt độ 45-55 °C thích hợp với hoạt tính đặc hiệu 13,71 U/mg So với hoạt tính đặc hiệu ban đầu (18,71 U/mg) phần trăm hoạt tính lại sau sấy 73,28% 3.4 So sánh khả thủy phân phụ phẩm cá tra sản phẩm bromelain thí nghiệm với sản phẩm bromelain thương mại Theo bảng hoạt tính đặc hiệu bromelain sản phẩm thí nghiệm cao so với chế phẩm thương mại Số đơn vị hoạt tính miligam bột sản phẩm thí nghiệm (1,12 U/mg) cao so với bromelain thương mại (0,91 U/mg) Như sử dụng lượng bột enzyme sản phẩm bromelain thí nghiệm cho hiệu thủy phân cao Bảng So sánh hoạt tính sản phẩm bromelain thí nghiệm bromelain thương mại Enzyme bromelain Bromelain sản phẩm Bromelain thương mại (Sigma-Aldrich) Protein (mg/mg bột)* 0,09a Hoạt tính (U/mg bột)** 1,12a Hoạt tính đặc hiệu (U/mg)*** 13,13a 0,10b 0,91b 9,48b Ghi chú: *cv = 3,9%; **cv = 4,7%; ***cv = 5,8%; Các giá trị trung bình theo sau ký tự cột khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa 5% Xét hàm lượng protein chế phẩm bromelain thương mại có hàm lượng protein cao hoạt tính đặc hiệu thấp sản phẩm thí nghiệm Như cho thấy sản phẩm thí nghiệm có độ tinh cao so với sản phẩm thương mại Bảng Hàm lượng đạm amin dịch thủy phân phụ phẩm cá tra thủy phân hai chế phẩm bromelain Loại bột bromelain Đạm amin (g/l)* Bromelain sản phẩm 2,24a Bromelain thương mại (Sigma-Aldrich) 2,01b Không bổ sung enzyme 0,64c Ghi chú: *cv = 1,2%; Các giá trị trung bình theo sau ký tự cột khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa 5% Từ bảng nhận thấy với loại chất phụ phẩm cá tra, nồng độ enzyme khả thủy phân sản phẩm bromelain thí nghiệm cao so với sản phẩm bromelain thương mại Hàm lượng đạm amin sinh thủy phân sản phẩm bromelain thí nghiệm 2,24 g/l so với bromelain thương mại 2,01g/l So với mẫu không sử dụng enzyme hàm lượng đạm amin cao 3,5 lần dùng bromelain thí nghiệm cao 3,1 lần dùng chế phẩm thương mại Kết luận khuyến nghị Qua trình thực thu nhận enzyme bromelain từ chồi dứa nhận thấy trích ly bromelain chồi hai loại dung môi đệm phosphat nước Chồi dứa sau làm gai trích ly nước với tỷ lệ chồi ngọn:dung môi:1:3 Acetone dung mơi thích hợp cho q trình tủa bromelain chồi Tủa bromelain chồi sấy điều kiện khơng khí đối lưu nhiệt độ 45-55 oC khoảng Chế phẩm bromelain chồi có khả thủy phân protein phụ phẩm cá tra Do thời gian nghiên cứu hạn chế nên đề nghị nghiên cứu khảo sát thêm điều kiện bảo quản bromelain để đưa khuyến cáo điều kiện bảo quản tối ưu Nghiên cứu tinh chế phẩm bromelain chồi ứng dụng chế phẩm bromelain chồi vào mục đích khác nhau: thực phẩm, dược phẩm… CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG Đề tài nghiên cứu khoa học “Nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi dứa (Ananas comosus)”, tác giả Nguyễn Phú Thọ, công tác Khoa Nông Nghiệp – Tài Nguyên Thiên Nhiên thực Tác giả báo cáo kết nghiên cứu đƣợc Hội đồng Khoa học Đào tạo Trƣờng Đại học An Giang thông qua ngày 29/04/2014 Thƣ ký Phản biện Phản biện Chủ tịch Hội đồng i LỜI CẢM TẠ Chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu, Khoa Nông Nghiệp – Tài Nguyên Thiên Nhiên, Trung tâm Thực hành – Thí Nghiệm, Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, Phòng Quản lý Khoa học Hợp Tác Quốc tế Trƣờng Đại học An Giang giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành đề tài An Giang, ngày 29 tháng 04 năm 2014 Ngƣời thực Nguyễn Phú Thọ ii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi dứa đƣợc thực nhằm mục tiêu nghiên cứu qui trình sản xuất bột bromelain đơn giản rẻ tiền dựa nghiên cứu: (a) Điều kiện trích li bromelain từ chồi dứa (b) Ảnh hƣởng tác nhân tủa đến bromelain (c) Nhiệt độ sấy khô kết tủa bromelain (d) Thử khả thủy phân phụ phẩm cá tra bromelain sản phẩm bromelain thƣơng mại Kết nghiên cứu thu đƣợc: - Nƣớc dung mơi thích hợp để trích ly bromelain từ chồi dứa với tỷ lệ chồi ngọn:nƣớc:1:2 - Acetone cho hiệu tủa bromelain chồi tốt Tỷ lệ dịch trích enzyme:acetone 1:1 - Nhiệt độ sấy khô kết tủa tối ƣu 45-55 oC, thời gian sấy - Bromelain sản phẩm thu đƣợc có khả thủy phân phụ phẩm cá tra Khả thủy phân bromelain sản phẩm thí nghiệm cao bromelain thƣơng mại (Sigma-Aldrich) Từ khóa: chồi dứa (Ananas comosus), bromelain, kết tủa acetone, sấy khô kết tủa iii ABSTRACT Our study research extraction of crude bromelain in the pineapple bud The project objectives are etablishment of the simple bromelain production procedure which based on studying of: (a) Appropriate extraction condition of bromelain from pineapple bud (b) The affecting of precipitations on bromelain activity (c) Appropriate drying temperature of bromelain powder (d) Studying on the process of hydrolysis of Tra fish by-product by bromelain The results showed that: - Bromelain was extracted from the pineapple bud by ratio: Bud:Dist water: 1:2 - The best precipitation condition of bromelain is acetone by ratio: Extracted bud:Acetone:1:1 - The optimum drying temperature of bud bromelain is 45-55 oC within hours - Our bromelain product has better hydrolysis of Tra fish by-product cabability than commercial bromelain (Sigma-Aldrich) Key words: pineapple bud (Ananas comosus), bromelain, Acetone precipitation, drying precipitation iv CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Trong trình thực thu nhận enzyme bromelain từ chồi dứa nhận thấy yếu tố nhƣ loại tác nhân tủa, nhiệt độ thời gian sấy khơ kết tủa có ảnh hƣởng đến hoạt tính bromelain chồi Qua thí nghiệm, quy trình sản xuất enzyme bromelain từ chồi dứa đƣợc đề nghị: Chồi Ly trích với nƣớc theo tỷ lệ 1/3 Dịch chiết Ly tâm 6000 vòng/phút Trong phút Tủa với acetone lạnh (1:1) Để yên 60 phút Ly tâm 6000 vòng/phút Trong phút Tủa ƣớt Sấy 45-55 OC Trong Bột bromelain Bảo quản Qua trình thí nghiệm rút số kết luận: Có thể trích ly bromelain chồi hai loại dung môi đệm phosphat nƣớc Chồi dứa sau làm gai trích ly nƣớc với tỷ lệ chồi ngọn:dung môi:1:3 Acetone dung mơi thích hợp cho q trình tủa bromelain chồi Tủa bromelain chồi sấy điều kiện khơng khí đối lƣu nhiệt độ 45-55 oC khoảng 29 Chế phẩm bromelain chồi có khả thủy phân protein phụ phẩm cá tra 5.2 HẠN CHẾ Do thời gian nghiên cứu hạn chế nên chƣa thể khảo sát bảo quản chế phẩm bromelain thu đƣợc để đƣa khuyến cáo điều kiện bảo quản thích hợp 5.3 KHUYẾN NGHỊ Do điều kiện sở vật chất, phƣơng tiện nghiên cứu thời gian nghiên cứu cịn nhiều hạn chế nên khơng thể khảo sát hết yếu tố tác động ảnh hƣởng đến trình thu nhận bromelain chồi dứa Vì vậy, đề nghị hƣớng nghiên cứu sau để đề tài đƣợc hồn thiện hơn: Có thể nghiên cứu khảo sát điều kiện bảo quản bromelain để đƣa khuyến cáo điều kiện bảo quản tối ƣu Nghiên cứu tinh chế phẩm bromelain chồi Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm bromelain chồi vào mục đích khác nhau: thực phẩm, dƣợc phẩm… 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bradford M.M (1976) A rapid and sensitive method quantification of protein utilizing the principle of protein dye biding Anal Biochem 72, 248-254 Bromelain (k.n.) Truy cập từ http://en.wikipedia.org/wiki/Bromelain Coppens d’Eeckenbrugge, G & F Leal (2003) Morphology, Anatomy and Taxonomy In Bartholomew, D.P., Paull, R.E & Rohrbach, K.G (ed.): The Pineapple: Botany, Production and Uses CAB International, Wallingford (1332) Christopher W & C.W Wharton (1974) The structure and Mechanism of Stem bromelain, Biochem J, 143, 575 – 586 Devakate R.V., V.V Patil, S.S Waje & B.N Thorat (2008) Purifcation and drying of bromelain Separation and purifcation technolory, 259 - 264 Doko, M B.; Bassani V.; Casadebaig J.;Cavailles L & Jacob, M (1991) Preparation of proteolytic enzyme extracts from Ananas comosus L., Merry fruit juice using semipermeable membrane, ammonium sulfate extraction, centrifugation and freeze-drying processes International Journal of Pharmaceutics, 76, 199-206 Dƣơng Thị Hƣơng Giang, Lê Thanh Hùng, Võ Văn Song Toàn, Sonia Beeckmans, Edilbert Van Driessche & Trần Phƣớc Đƣờng (2002) Đánh giá phƣơng pháp trích ly bromelin từ nƣớc khóm thơ Tạp chí Khoa Trường Đại học Cần Thơ Dƣơng Thị Hƣơng Giang (2005) Tinh bromelain từ phụ phẩm dứa phƣơng pháp sắc ký gel mở rộng Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học Đại học Cần Thơ Đinh Thị Tình (2007) Xác định hoạt lực tách sơ enzyme bromelain từ phụ phẩm dứa Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trƣờng Đại học Nông nghiệp, Hà Nội Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy & Nguyễn Thị Xuân Sâm (2005) Công nghệ enzyme NXB Khoa học Kỹ thuật Eves M (2006), Extraction et formulation de la bromelain d’ananas Travail de find’estudes DEA, Université catholique de Louvain Gautam S S, Mishra S K., Dash V., Goyal A K And Rath G (2010) Comparative study of extraction, purification and estimation of bromelain from stem and fruit of pineapple plant Thai J Pharm, 34, 67 – 76 Hebbar, H.U., B Sumana & K.M.S Raghavarao (2008) Use of reverse micellar systems for the extraction and purification of bromelain from pineapple wastes Bioresource technolygy, 99, 4896 - 4902 Huali Nie, Shubai Li, Yuting Zhou, Tixanxing Chen, Zhiyan He, Sainan Su, Haitao Zhang, Yong Xue & Limin Zhu (2008) Purification of bromelain using immobilized metal affinity membranes Kunitz M (1974) Determination of proteolytic activity by the casein digestion method Journal of General Physiology, 30, 291 Lại Thị Ngọc Hà (2009) Nghiên cứu tách tạo chế phẩm bromelain từ phế phụ phẩm dứa Tạp chí Khoa học Phát triển, 2, 203 – 211 31 Lopes, F.L.G., J.B.S Júnior , R.R de Souza , D.D Ehrhardt, J.C.C Santana & E.B Tambourgi (2009) Concentration by membrane separation processes of a medicinal product obtained from pineapple pulp An international journal, 52, 457-464 Melissa (2005) Nghiên cứu quy trình tinh enzyme bromelain trích ly từ thân phạm vi pilot Mariela A Bruno, M.F Pardo, N.O Caffini & L.M.I López (2002) Purification of a New Endopeptidase Isolated from Fruits of Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae) Acta Farm Bonaerense, 21, 51-56 Nguyễn Công Hà (2009) Nghiên cứu trích ly enzyme bromelain từ vỏ dứa ứng dụng vào công nghệ chế biến mắm cá lóc philê ngắn ngày tỉnh An Giang Sở KH&CN An Giang Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Cƣờng, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hƣơng & Phan Thị Huyền (2004) Công nghệ enzyme TP HCM: NXB ĐHQG Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Bá Mùi (2005) Nghiên cứu phụ phẩm dứa ủ chua làm thức ăn gia súc (Luận án tiến sĩ Nông nghiệp không xuất bản) Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội, Việt Nam Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Lê Hà Ny & Lê Trung Hiếu (2013) Trích ly enzyme bromelain từ phụ phẩm dứa Cầu Đúc (Hậu Giang) Tạp chí Khoa Trường Đại học Cần Thơ, 28, 21-27 Nguyễn Phú Thọ & Dƣơng Thị Hƣơng Giang (2011) Nghiên cứu qui trình điều chế bột enzyme papain thơ từ nhựa đu đủ Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 17b, 158-166 Nguyễn Thị Thanh Trúc (2010) Tinh khảo sát nhân tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme bromelain trích ly từ thân khóm Đề Tài Nghiên cứu khoa học cấp Trƣờng Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học Đại học Cần Thơ Rabelo A.P.B., E.B Tambourigi & A Pessoa Jr (2004) Bromelain partitioning in two phase aqueous systems containing PEO-PPO-PEO block copolymers J hromatogr, 807, 61 - 68 Ravindra B B., NK Rastogi & K.S.M.S Raghavara (2008) Liquid-liquid extraction of brommelain and polyphenol oxidase using aqueous two-phase system Chemical Engineering and Processing, 83 - 89 Sản lƣợng dứa (k.n.) Truy cập từ http://vi.wikipedia.org/wiki/D%E1%BB%A9a 32 PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ CỦA CÁC THÍ NGHIỆM 1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát dung dịch trích ly tỷ lệ trích ly bromelain từ chồi dứa Bảng 18 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng dung dịch trích ly tỷ lệ trích ly đến protein tổng Nguồn biến động Giữa nhóm Trong nhóm Tổng Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P 1,33528 0,190755 1,31 0,3055 2,32151 16 0,145095 3,6568 23 Bảng 19 Ảnh hƣởng dung dịch trích ly tỷ lệ trích ly đến protein tổng theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Nghiệm thức Nƣớc 1/3 Nƣớc 1/2 Đệm 1/3 Đệm 1/2 Đệm 1/5 Đệm 1/4 Nƣớc 1/4 Nƣớc 1/5 Tổng số Trung bình 1,14769 1,18308 1,24769 1,33877 1,52372 1,61128 1,70359 1,81538 Các nhóm đồng X XX XX XX XX XX XX X Bảng 20 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng dung dịch trích ly tỷ lệ trích ly đến hoạt tính đặc hiệu bromelain Nguồn biến động Giữa nhóm Trong nhóm Tổng Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P 7,57404 1,08201 4,52 0,0060 3,83083 16 0,239427 11,4049 23 Bảng 21 Ảnh hƣởng dung dịch trích ly tỷ lệ trích ly đến hoạt tính đặc hiệu bromelain theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Nghiệm thức Nƣớc 1/5 Nƣớc 1/2 Đệm 1/5 Đệm 1/4 Nƣớc 1/4 Đệm 1/2 Đệm 1/3 Nƣớc 1/3 Tổng số Trung bình 2,0433 2,05719 2,27328 2,8406 2,89304 3,21217 3,42667 3,54264 Các nhóm đồng X XX XX XXX XX X X X Bảng 22 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng tƣơng tác dung dịch trích ly tỷ lệ trích ly đến protein tổng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự Trung bình bình phƣơng Tỷ lệ F ẢNH HƢỞNG CHÍNH A:Dung dịch trích ly 0,00617111 0,00617111 0,04 B:Tỷ lệ trích ly 1,14354 0,38118 2,22 TƢƠNG TÁC AB 0,185574 0,0618581 0,36 SỐ DƢ 2,75228 16 0,172018 TỔNG 4,08757 23 33 Giá trị P 0,8522 0,1258 0,7830 Bảng 23 Ảnh hƣởng tƣơng tác dung dịch trích ly đến protein tổng theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Dung dịch trích ly Tổng số Trung bình Độ lệch chuẩn Các nhóm đồng X Đệm 12 1,43037 0,119728 X Nƣớc 12 1,46244 0,119728 Bảng 24 Ảnh hƣởng tƣơng tác tỷ lệ trích ly đến protein tổng theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Tỷ lệ trích ly Tổng số Trung bình Độ lệch chuẩn 1/3 1,19769 0,169321 1/2 1,26092 0,169321 1/4 1,65744 0,169321 1/5 1,66955 0,169321 Các nhóm đồng X X X X Bảng 25 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng tƣơng tác dung dịch trích ly tỷ lệ trích ly đến hoạt tính đặc hiệu bromelain Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự Trung bình bình phƣơng Tỷ lệ F Giá trị P ẢNH HƢỞNG CHÍNH A:Dung dịch trích ly 0,554998 0,554998 2,98 0,1036 B:Tỷ lệ trích ly 5,46943 1,82314 9,78 0,0007 TƢƠNG TÁC AB 1,54961 0,516538 2,77 0,0754 SỐ DƢ 2,98144 16 0,18634 TỔNG 10,5555 23 Bảng 26 Ảnh hƣởng tƣơng tác dung dịch trích ly đến hoạt tính đặc hiệu bromelain theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Dung dịch trích ly Tổng số Trung bình Độ lệch chuẩn Các nhóm đồng X Nƣớc 12 2,63404 0,124613 X Đệm 12 2,93818 0,124613 Bảng 27 Ảnh hƣởng tƣơng tác tỷ lệ trích ly bromelain đến hoạt tính đặc hiệu bromelain theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Tỷ lệ trích ly Tổng số Trung bình Độ lệch chuẩn Các nhóm đồng X 1/5 2,15829 0,176229 XX 1/2 2,63468 0,176229 X 1/4 2,86682 0,176229 X 1/3 3,48465 0,176229 1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng tác nhân tủa đến hoạt tính bromelain Bảng 28 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng tác nhân tủa đến protein thu hồi bromelain chồi dứa Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 3124,4 11 284,036 55,36 0,0000 Trong nhóm 123,144 24 5,13099 Tổng 3247,54 35 34 Bảng 29 Ảnh hƣởng tác nhân tủa đến protein thu hồi bromelain chồi dứa theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Nghiệm thức Tổng số Trung bình Enzyme:acetone:1:1 12,401 Enzyme:acetone:1:2 15,8476 Enzyme:acetone:1:4 15,8476 Ammonium sulfate (30%) 17,2504 Enzyme:acetone:1:3 19,2909 Ammonium sulfate (40%) 19,7109 Ammonium sulfate (60%) 19,7779 Ammonium sulfate (50%) 21,6128 Enzyme:ethanol:1:4 32,5792 Enzyme:ethanol:1:7 36,5172 Enzyme:ethanol:1:5 38,4828 Enzyme:ethanol:1:6 38,9776 Các nhóm đồng X XX XX XX XXX XX XX X X X X X Bảng 30 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng tác nhân tủa đến hoạt tính thu hồi bromelain chồi dứa Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 12953,3 11 1177,57 23,13 0,0000 Trong nhóm 1222,06 24 50,9194 Tổng 14175,3 35 Bảng 31 Ảnh hƣởng tác nhân tủa đến hoạt tính thu hồi bromelain chồi dứa theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Nghiệm thức Tổng số Trung bình Ammonium sulfate (30%) 6,9718 Ammonium sulfate (40%) 10,032 Ammonium sulfate (60%) 12,4808 Ammonium sulfate (50%) 14,3629 Enzyme:acetone:1:2 33,1914 Enzyme:ethanol:1:4 36,959 Enzyme:ethanol:1:7 43,0794 Enzyme:acetone:1:4 43,5499 Enzyme:acetone:1:3 48,7292 Enzyme:acetone:1:1 50,1408 Enzyme:ethanol:1:5 55,3201 Enzyme:ethanol:1:6 66,6197 Các nhóm đồng X X X X X XX XXX XXXX XXX XX XX X Bảng 32 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng tác nhân tủa đến hoạt tính đặc hiệu bromelain chồi dứa Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 956,582 11 86,962 58,21 0,0000 Trong nhóm 35,8567 24 1,49403 Tổng 992,439 35 Bảng 33 Ảnh hƣởng tác nhân tủa đến hoạt tính đặc hiệu bromelain chồi dứa theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Nghiệm thức Ammonium sulfate (30%) Ammonium sulfate (40%) Ammonium sulfate (60%) Ammonium sulfate (50%) Enzyme:ethanol:1:4 Enzyme:ethanol:1:7 Enzyme:ethanol:1:5 Enzyme:ethanol:1:6 Enzyme:acetone:1:2 Enzyme:acetone:1:3 Enzyme:acetone:1:4 Enzyme:acetone:1:1 Tổng số Trung bình 1,97281 2,48757 3,08751 3,2573 5,60867 5,78113 7,03622 8,38266 11,002 12,2836 13,5519 19,6584 35 Các nhóm đồng X X X X X X XX X X XX X X 1.2.1 Tủa ethanol Bảng 34 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng tỷ lệ ethanol đến protein thu hồi bromelain chồi dứa Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 76,0976 25,3659 27,93 0,0001 Trong nhóm 7,26567 0,908209 Tổng 83,3632 11 Bảng 35 Ảnh hƣởng tỷ lệ tỷ lệ ethanol đến protein thu hồi bromelain chồi dứa theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Tỷ lệ enzyme:ethanol Tổng số Trung bình Các nhóm đồng 1/4 32,5792 X X 1/7 36,5172 X 1/5 38,4828 X 1/6 38,9776 Bảng 36 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng tỷ lệ ethanol đến hoạt tính thu hồi bromelain chồi dứa Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 1564,5 521,502 5,37 0,0255 Trong nhóm 776,544 97,0679 Tổng 2341,05 11 Bảng 37 Ảnh hƣởng tỷ lệ tỷ lệ ethanol đến hoạt tính thu hồi bromelain chồi dứa theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Tỷ lệ enzyme:ethanol Tổng số Trung bình 1/4 36,959 1/7 43,0794 1/5 55,3201 1/6 66,6197 Các nhóm đồng X X XX X Bảng 38 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng tỷ lệ ethanol đến hoạt tính đặc hiệu bromelain chồi dứa Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 14,9391 4,9797 2,31 0,1533 Trong nhóm 17,2737 2,15921 Tổng 32,2128 11 Bảng 39 Ảnh hƣởng tỷ lệ tỷ lệ ethanol đến hoạt tính đặc hiệu bromelain chồi dứa theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Tỷ lệ enzyme:ethanol Tổng số Trung bình 1/4 5,60867 1/7 5,78113 1/5 7,03622 1/6 8,38266 Các nhóm đồng X XX XX X 1.2.2 Tủa acetone Bảng 40 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng tỷ lệ acetone đến protein thu hồi bromelain chồi dứa Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 71,2049 23,735 1,98 0,1957 Trong nhóm 95,9065 11,9883 Tổng 167,111 11 36 Bảng 41 Ảnh hƣởng tỷ lệ tỷ lệ acetone đến protein thu hồi bromelain chồi dứa theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Tỷ lệ enzyme:acetone Tổng số Trung bình 1/1 12,401 1/2 15,8476 1/4 15,8476 1/3 19,2909 Các nhóm đồng X XX XX X Bảng 42 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng tỷ lệ acetone đến hoạt tính thu hồi bromelain chồi dứa Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 531,198 177,066 3,21 0,0832 Trong nhóm 441,568 55,196 Tổng 972,766 11 Bảng 43 Ảnh hƣởng tỷ lệ tỷ lệ acetone đến hoạt tính thu hồi bromelain chồi dứa theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Tỷ lệ enzyme:acetone Tổng số Trung bình Các nhóm đồng 1/2 33,1914 X 1/4 43,5499 XX X 1/3 48,7292 X 1/1 50,1408 Bảng 44 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng tỷ lệ acetone đến hoạt tính đặc hiệu bromelain chồi dứa Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 132,272 44,0906 19,13 0,0005 Trong nhóm 18,4366 2,30457 Tổng 150,708 11 Bảng 45 Ảnh hƣởng tỷ lệ tỷ lệ acetone đến hoạt tính đặc hiệu bromelain chồi dứa theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Tỷ lệ enzyme:acetone Tổng số Trung bình 1/2 11,002 1/3 12,2836 1/4 13,5519 1/1 19,6584 Các nhóm đồng X X X X 1.2.2 Tủa ammonium sulfate Bảng 46 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng ammonium sulfate đến protein thu hồi bromelain chồi dứa Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 28,8453 9,61511 3,85 0,0565 Trong nhóm 19,9717 2,49647 Tổng 48,8171 11 Bảng 47 Ảnh hƣởng nồng độ ammonium sulfate đến protein thu hồi bromelain chồi dứa theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Nồng độ ammonium sulfate (%) Tổng số Trung bình 30 17,2504 40 19,7109 60 19,7779 50 21,6128 37 Các nhóm đồng X XX XX X Bảng 48 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng ammonium sulfate đến hoạt tính thu hồi bromelain chồi dứa Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 91,9793 30,6598 62,05 0,0000 Trong nhóm 3,95288 0,49411 Tổng 95,9321 11 Bảng 49 Ảnh hƣởng nồng độ ammonium sulfate đến hoạt tính thu hồi bromelain chồi dứa theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Nồng độ ammonium sulfate (%) Tổng số Trung bình Các nhóm đồng X 30 6,9718 X 40 10,032 X 60 12,4808 X 50 14,3629 Bảng 50 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng ammonium sulfate đến hoạt tính đặc hiệu bromelain chồi dứa Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 3,10402 1,03467 56,50 0,0000 Trong nhóm 0,146514 0,0183142 Tổng 3,25053 11 Bảng 51 Ảnh hƣởng nồng độ ammonium sulfate đến hoạt tính thu hồi bromelain chồi dứa theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% Nồng độ ammonium sulfate (%) Tổng số Trung bình Các nhóm đồng 30 1,97281 X X 40 2,48757 X 60 3,08751 X 50 3,2573 1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính bromelain q trình sấy kết tủa Bảng 52 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng nhiệt độ thời gian đến hoạt tính đặc hiệu bromelain trính sấy Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P ẢNH HƢỞNG CHÍNH A:Nhiệt độ sấy 302,762 100,921 69,76 0,0000 B:Thời gian sấy 416,539 208,269 143,96 0,0000 TƢƠNG TÁC AB 125,878 20,9797 14,50 0,0000 SỐ DƢ 34,72 24 1,44667 TỔNG 879,899 35 Bảng 53 Ảnh hƣởng thời gian sấy đến hoạt tính đặc hiệu bromelain theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% nhiệt độ phòng (30 oC) Thời gian sấy (giờ) Tổng số Trung bình Các nhóm đồng 8,07777 X X 14,1528 X 14,4827 Bảng 54 Ảnh hƣởng thời gian sấy đến hoạt tính đặc hiệu bromelain theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% nhiệt độ 45 oC Thời gian sấy (giờ) Tổng số Trung bình Các nhóm đồng 10,1846 X X 13,7139 X 15,4713 38 Bảng 55 Ảnh hƣởng thời gian sấy đến hoạt tính đặc hiệu bromelain theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% nhiệt độ 55 oC Thời gian sấy (giờ) Tổng số Trung bình Các nhóm đồng X 8,3558 X 11,9807 X 15,6491 Bảng 56 Ảnh hƣởng thời gian sấy đến hoạt tính đặc hiệu bromelain theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% nhiệt độ 65 oC Thời gian sấy (giờ) Tổng số Trung bình Các nhóm đồng X 0,0 X 3,13462 X 14,3414 Bảng 57 Ảnh hƣởng nhiệt độ sấy đến hoạt tính đặc hiệu bromelain theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% thời gian Nhiệt độ sấy (oC) Tổng số Trung bình 65 14,3414 30 14,4827 45 15,4713 55 15,6491 Các nhóm đồng X X X X Bảng 58 Ảnh hƣởng nhiệt độ sấy đến hoạt tính đặc hiệu bromelain theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% thời gian Nhiệt độ sấy (oC) Tổng số Trung bình Các nhóm đồng 65 3,13462 X X 55 11,9807 XX 45 13,7139 X 30 14,1528 Bảng 59 Ảnh hƣởng nhiệt độ sấy đến hoạt tính đặc hiệu bromelain theo phép thử LSD với độ tin cậy 95% thời gian Nhiệt độ sấy (oC) Tổng số Trung bình Các nhóm đồng X 65 0,0 X 30 8,07777 X 55 8,3558 X 45 10,1846 1.4 Thí nghiệm 4: So sánh khả thủy phân phụ phẩm cá tra sản phẩm bromelain thí nghiệm bromelain thƣơng mại Bảng 60 Phân tích phƣơng sai so sánh hàm lƣợng protein sản phẩm bromelain thí nghiệm bromelain thƣơng mại Nguồn biến động Giữa nhóm Trong nhóm Tổng Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P 0,000168553 0,000168553 13,29 0,0218 0,00005072 0,00001268 0,000219273 Bảng 61 Phân tích LSD so sánh hàm lƣợng protein sản phẩm bromelain thí nghiệm bromelain thƣơng mại Enzyme Tổng số Trung bình Sản phẩm thí nghiệm 0,0854839 Sản phẩm thƣơng mại (Sigma-Aldrich) 0,0960843 39 Các nhóm đồng X X Bảng 62 Phân tích phƣơng sai so sánh hoạt tính sản phẩm bromelain thí nghiệm bromelain thƣơng mại Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 0,0683107 0,0683107 37,37 0,0036 Trong nhóm 0,00731114 0,00182779 Tổng 0,0756218 Bảng 63 Phân tích LSD so sánh hoạt tính sản phẩm bromelain thí nghiệm bromelain thƣơng mại Enzyme Tổng số Trung bình Các nhóm đồng X Sản phẩm thƣơng mại (Sigma-Alrdich) 0.908501 X Sản phẩm thí nghiệm 1.1219 Bảng 64 Phân tích phƣơng sai so sánh khả thủy phân phụ phẩm cá tra sản phẩm bromelain thí nghiệm bromelain thƣơng mại Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị P Giữa nhóm 4,48618 2,24309 5802,76 0,0000 Trong nhóm 0,00231933 0,000386556 Tổng 4,4885 Bảng 65 Phân tích phƣơng sai so sánh khả thủy phân phụ phẩm cá tra sản phẩm bromelain thí nghiệm bromelain thƣơng mại Enzyme Không bổ sung enzyme Sản phẩm thƣơng mại (Sigma-Aldrich) Sản phẩm thí nghiệm Tổng số 3 Trung bình Các nhóm đồng X 0,641667 X 2,009 X 2,24233 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 2.1 Định lƣợng protein phƣơng pháp Bradford (1976) 2.1.1 Mục đích Xác định hàm lƣợng protein dịch trích từ phần thân dứa, làm sở cho bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme 2.1.2 Nguyên tắc Phƣơng pháp Bradford dựa liên kết chất nhuộm Cooassie Brilliant Blue G250 (CBB) protein Trong môi trƣờng acid, chƣa gắn kết với protein thuốc nhuộm dạng màu đỏ có bƣớc sóng hấp thụ cực đại 465 nm Khi kết hợp với protein thuốc nhuộm chuyển sang màu xanh dƣơng hấp thụ bƣớc sóng cực đại bƣớc sóng 595 nm Độ hấp thu tỷ lệ thuận với hàm lƣợng protein dung dịch Dựng đƣờng chuẩn hàm lƣợng protein, dựa vào đƣờng chuẩn suy nồng độ protein mẫu 2.1.3 Hóa chất Chuẩn bị dung dịch thuốc khử Bradford: hòa tan 100 mg CBB G250 50 ml ethanol 95%, thêm 100ml H3PO4 (85%), sau thêm nƣớc cất cho đủ 1000 ml (dung dịch A) Lọc bỏ cặn,giữ thuốc thử tối 0C (dung dịch B) Dung dịch protein chuẩn Bovin Serum Albumin (BSA): cân mg BSA, hòa tan 1ml nƣớc cất Giữ -20 0C Đƣợc dung dịch BSA có nồng độ 3000 µg/ml Khi sử dụng pha loãng 40 2.1.4 Xây dựng đƣờng chuẩn Ống Nồng độ BSA 30 (µg/ml) Thể tích BSA 10 (µl) Thể tích đệm 1000 990 (µl) Thể tích dung 1000 1000 dịch B (µl) 60 120 180 240 300 20 40 60 80 100 980 960 940 920 900 1000 1000 1000 1000 1000 Lấy 50µl dung dịch từ ống nghiệm cho vào ống nghiệm khác đƣợc ký hiệu tƣơng tự Dùng đồng hồ bấm giây canh thời gian Tại thời điểm phút cho 1ml thuốc thử vào ống 1, lắc để yên Thời điểm phút cho 1ml thuốc thử vào ống 2, lắc để yên Thực tƣơng tự ống thời điểm cách phút Trộn ống máy vortex Tiến hành đo ống sau 10 phút (sau phút đo ống) bƣớc sóng 595 nm Sử dụng chƣơng trình Exel máy tính để vẽ đồ thị tính hàm lƣợng protein mẫu enzyme Định lƣợng protein dung dịch mẫu enzyme thực nhƣ Nếu độ hấp thu mẫu vƣợt qua sđƣờng chuẩn, tiến hành pha loãng dung dịch mẫu với tỷ lệ thích hợp kiểm tra lại Kết đo OD dựng đƣờng chuẩn : [BSA] (µg/ml) 30 60 120 180 240 300 OD 0,001 0,069 0,187 0,354 0,51 0,654 0,757 0.9 0.8 OD (595 nm) 0.7 0.6 0.5 y = 0.0026x + 0.0174 0.4 0.3 R = 0.9919 0.2 0.1 0 50 100 150 200 Nồng độ BSA (mg/ml) 41 250 300 350 2.2 Xác định hoạt tính enzyme phƣơng pháp Kunitz (1917) cải tiến 2.2.1 Cách thực Sử dụng casein làm chất thủy phân đƣợc điều chỉnh để thực ống eppendorf 2.2.2 Nguyên tắc Bromelain enzyme có khả thủy giải chất protein nhƣ casein, hemoglobin, gelatin Trong thí nghiệm sử dụng casein làm chất Sản phẩm phân giải acid amin, lƣợng sản phẩm sinh đƣợc xác định dựa vào độ hấp thụ ánh sáng tyrosin bƣớc sóng 275 nm, từ suy hoạt tính enzyme Đơn vị hoạt tính enzyme (Tyrosin Unit (TU): Một đơn vị hoạt tính enzyme (1TU) lƣợng enzyme cần thiết để thủy phân casein cho lƣợng sản phẩm tƣơng đƣơng 1µg tyrosine phút 37 0C, pH 7,5 Hoạt tính đặc hiệu: số đơn vị hoạt tính enzyme mg protein (TU/mg) 2.2.3 Thiết bị hóa chất Dung dịch đệm phosphat pH =7 (0,2 M NaH2PO4/ 0,2 Na2HPO4) Cystein 0,02 M Casein 1% (đun 95 0C để tan) Acid Trichloroacetic (TCA) 15% (w/v) Máy li tâm lạnh, Quang phổ kế 2.2.4 Tiến hành Pha loãng dung dịch enzyme nhận đƣợc dung dịch đệm tỷ lệ 10 x, 20 x, 50 x, 100 x Qui trình xác định hoạt tính enzyme theo phƣơng pháp Kunitz (1917) cải tiến: 40 µl Cystein 0,02 M 140 µl đệm 20 µl enzyme (ống đối chứng cho enzyme bất hoạt) Cho vào 600 µl Casein 1% Ủ lắc 10 phút, 37 0C, 550 rpm Cho vào 600 µl TCA 15% Để yên 10 phút Ly tâm 10.000 rmp, 10 phút, 0C Bỏ cặn Đo độ hấp thụ ánh sáng 275 nm 42 2.2.5 Tính kết Đơn vị hoạt tính enzyme đƣợc tính theo cơng thức: TU ( x *Vhh *1000 )* K T *VE x: nồng độ tyrosine (µmol/ml), đƣợc xác định dựa dịng đƣờng chuấn Tyrosine Vhh: thể tích tổng dung dịch phản ứng (1400 µl) T: thời gian phản ứng (10 phút) VE: thể tích enzyme sử dụng (20 µl), K: hệ số pha loãng 2.2.6 Xây dựng đƣờng chẩn tyrosin Chuẩn bị tyrosin chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0; 0,1; 0,125; 0,2; 0,25; 0,5; mM/ml Ống [Tyrosin](mM/ml) 0,1 0,125 0,2 0,25 0,5 Thể tích 100 125 200 250 500 1000 Tyrosin (µl) Thể tích đệm (µl) 1000 900 875 800 750 500 Thể tích dung dịch 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 B (µl) Bước sóng (275nm) Lắc ống nghiệm Sau tiến hành đo OD bƣớc sóng 275 nm Kết đo OD dựng dƣờng chuẩn Tyrosin: Tyrosin (mM/ml) OD 1,303 0,5 0,684 0,25 0,346 0,2 0,282 0,125 0,175 0,1 0,146 0 1.4 1.3 1.2 1.1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 y = 1.2987x + 0.0159 R2 = 0.9993 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 HL (mM) 43 0.7 0.8 0.9 1.1 ... THIÊN NHIÊN NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME BROMELAIN THÔ TỪ CHỒI DỨA (ANANAS COMOSUS) NGUYỄN PHÚ THỌ AN GIANG, THÁNG 04 NĂM 2014 NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME BROMELAIN THÔ TỪ CHỒI DỨA (ANANAS COMOSUS) ... trường Xuất phát từ tình hình thực tế đề tài ? ?Nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi dứa (Ananas comosus) ” thực nhằm bước đầu xây dựng qui trình thu nhận bromelain thơ từ chồi dứa góp phần... 2.3 PHƢƠNG PHÁP THU NHẬN BROMELAIN Enzyme bromelain đƣợc thu nhận thân, phần thịt chồi dứa Hiện có nhiều nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain từ phần khác dứa Phần lớn nghiên cứu tập trung chủ