Nghiên cứu thu nhận Enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá mía cám gạo

Nghiên cứu thu nhận Enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá mía cám gạo.docNghiên cứu thu nhận Enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá mía cám gạo.docluận văn tốt nghiệp thạc sĩ

Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo Chương MỞ ĐẦU Nhiều vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men nấm sợi báo cáo có khả sinh tổng hợp enzyme xylanase, nấm mốc có tiềm Xylanase sinh chủ yếu giống Aspergillus mơi trường lên men chìm môi trường lên men bán rắn với nguồn chất xylan tinh khiết, mía, cám gạo, Trước đây, xylanase sử dụng phối hợp với cellulase để chuyển hóa lignocellulose thành lượng chất trao đổi Các ứng dụng khác enzym xylanase quan tâm như: làm nước trái rượu vang, tách chiết dầu thực vật, sản xuất oligosaccharide nhằm cải thiện giá trị dinh dưỡng thức ăn gia súc Trong năm gần đây, enzyme xylanase quan tâm ứng dụng công nghiệp giấy bột giấy, công nghệ thực phẩm, công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi….từ phế thải nông nghiệp Ở nước ta, nhu cầu sử dụng chế phẩm enzyme ngày nhiều, có enzyme xylanase Nhưng việc nghiên cứu sản xuất enzyme chưa quan tâm nhiều Ở Việt Nam, nguồn mía dồi dào, có chứa cellulose nên sử dụng làm nguồn carbon sử dụng kết hợp với cám gạo (là nguồn cung cấp Nitơ- khoáng chất vitamin) để cảm ứng Aspergillus niger sinh tổng hợp enzyme xylanase lên men bán rắn Ngoài ra, nước ta hầu hết mía sau thu hoạch khơng sử dụng cho nhu cầu mà đem đốt bỏ nguồn nguyên liệu rẻ tiền ổn định dễ dàng đáp ứng cho sản xuất enzyme xylanase quy mơ lớn Dựa đặc tính nên hướng đến việc thực đề tài : ‘‘ Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía - cám gạo’’ nhằm mục đích tận dụng mía kết hợp với cám gạo làm môi trường nuôi cấy để thu nhận enzyme từ canh trường ni cấy SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger môi trường mía – cám gạo Yêu cầu đề tài:  Khảo sát số thành phần hóa học có mía cám gạo  Khảo sát tỷ lệ mía cám gạo tạo mơi trường nuôi cấy  Khảo sát điều kiện nuôi cấy (pH, độ ẩm thời gian nuôi cấy)  Thu nhận dịch chiết enzyme xylanase SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo Chương TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan nấm mốc Aspergillus niger Giống Aspergillus có khoảng 200 lồi phân bố khắp nơi tự nhiên, có lồi Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,… có giá trị sử dụng sản xuất enzyme, rượu, acid hữu cơ,… Aspergillus niger loại nấm lồi phổ biến chi Aspergillus Nó gây mốc đen số loại trái rau nho, hành tây đậu phộng; chất gây ô nhiễm phổ biến thực phẩm Nó tìm thấy đất môi trường nhà [28] Van Tieghem người phát phân lập chủng nấm mốc Aspergillus niger từ hạt chứa nhiều dầu như: hạt đậu nành, đậu phộng, hạt ngũ cốc, bắp (ngô); Aspergillus niger phân lập từ sản phẩm lên men cổ truyền [2] Hình 2.1 Nấm mốc Aspergillus niger mơi trường PGA [29] SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo 2.1.1 Vị trí phân loại Aspergillus niger Giống Aspergillus Michelli mô tả lần đầu vào năm 1729 Năm 1901 Wehmer cho đời chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn Raper Fennell (1965) dùng tên Aspergillus cho tất loài tạo thành bào tử trần Như vậy, Aspergillus niger có vị trí phân loại theo bảng 2.1 Bảng 2.1 Phân loại khoa học Aspergillus niger [30] Giới Fungi Lớp Eurotiomycetes Bộ Eurotiales Họ Trichocomaceae Chi Aspergillus Loài Aspergillus niger Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính khơng nằm bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình rõ rệt đầu tạo thành bọng lớn hình cầu – x 20 – 30 µm, đơi – 10 x 60 – 70 µm, màu nâu đen Thể bình gồm hai lớp, lớp thứ hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai; bào tử đính xịe ra, có hình cầu xù xì, có gai nhọn, có màu nâu đen đến đen than, đường kính – 5µm [1], [3] 2.1.2 Đặc điểm sinh học Aspergillus niger Aspergillus niger sinh trưởng nhiệt độ tối thiểu 6-8 oC tối đa 45-47oC, tối ưu 28-35oC, mơi trường có độ ẩm tối thiểu 23% Độ ẩm môi trường thích hợp để lên men bán rắn Aspergillus niger 60-65%, sinh trưởng phát triển có mặt O2 pH tối ưu 4-6,5 Tuy nhiên, theo Patt (1981) có chủng Aspergillus niger sinh trưởng pH Sự thay đổi pH môi trường nuôi cấy từ đến 6,5 làm thay đổi đáng kể hình thái Aspergillus niger Trên mơi trường thạch Czapek, Aspergillus niger mọc thưa, đường kính SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger môi trường mía – cám gạo khuẩn lạc khoảng 40 mm Bổ sung 0,5% cao nấm men vào môi trường làm khuẩn lạc Aspergillus niger mọc tốt to hơn, đạt đường kính trung bình khoảng 60mm Trên mơi trường thạch malt (MEA), hệ enzym mọc tốt, không to trên môi trường thạch Czapek- cao nấm men (CYA) [3] 2.1.3 Đặc điểm sinh hóa 2.1.3.1 Khả lên men đường Aspergillus niger có khả đồng hóa tốt loại đường đơn đường đôi glucose, fructose, maltose, xylose, manose, saccharose Aspergillus niger đồng hóa galactose, sorbose lactose mức độ 2.1.3.2 - Khả tổng hợp enzyme α-amylase (1,4 glucan- glucanhydrolase): Aspergillus niger có khả tổng hợp α-amylase ngoại bào để thủy phân nhanh tinh bột tạo dextrin maltose glucose Tinh bột α-amylase Dextrin (nhiều) + maltose (ít) + glucose (ít) α-amylase Aspergillus niger hoạt động tối ưu pH từ 4,5 – 4,7, để đường hóa tinh bột, pH thích hợp – 5,5, 50 oC Enzym bị hoạt tính sau 30 phút pH = 2,5 Aspergillus niger có khả tạo glucoamylase nhiều α-amylase (Lê Văn Nhương, 1978) để thủy phân tinh bột thành dextrin sau thành glucose pH nhiệt độ tối thích tương ứng 50oC Park Y.K (1970) sử dụng Aspergillus niger để sản xuất sirô glucose từ khoai mì - Protease: Theo Lương Đức Phẩm, Aspergillus niger có khả tạo hai loại protease Protease thứ phân giải protein thành polypeptid, pepton, protease thứ hai tiếp tục chuyển hóa sản phẩm thành acid amin PH - nhiệt độ tối thích cho hoạt động chúng tương ứng – 50oC Cellulase: Cellulase phức hợp nhiều enzym, chủ yếu cellulase Cl, cellulase Cx β-glucosidase hay cellobiase Cellulase có tác dụng thủy phân cellulose thành cellobiose thành glucose theo trình tự sau: SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo Cellulose cellulas Cellobiose cellobiase Glucose Cellulase Aspergillus niger có pH nhiệt độ hoạt động tối thích tương ứng 4-5 40oC chất giấy lọc CMC (carboxyl methyl cellulose) - Pectinase: Aspergillus niger có khả tạo pectinase nhiệt độ tối thích - 25oC pH 5,6 Tuy nhiên enzym thể hoạt tính khoảng pH 2,5-6,8 Xylanase: Aspergillus niger có khả tạo xylanase nhiệt độ pH tối thích 25oC 5,6 Ngồi ra, Aspergillus niger cịn có khả tổng hợp hàng loạt enzyme khác như: lipase, mananase, α- galactosidase, carboxypeptidase, α- mannosidase, β- glucanase,… [1], [2] 2.1.3.3 Lên men rượu Theo Menezes (1978), lồi Aspergillus niger có khả lên men rượu điều kiện kỵ khí tác giả tiến hành nghiên cứu sử dụng bã khoai mì để sản xuất rượu ethanol 2.1.4 Tác hại Aspergillus niger Aspergillus niger xếp vào loại an tồn thực phẩm khơng chứa độc tố aflatoxin, thường sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ ngành thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi Tuy nhiên Aspergillus niger nguyên nhân làm hư hại trái tươi sau thu hoạch táo, lê, đào, chanh, nho, dâu, xoài, lựu,…Ngồi ra, cịn làm hư hại trái sake, cà chua, hạt điều gây nhiễm mát Aspergillus niger sống bám đồ gỗ, đồ da Bệnh nấm Aspergillus niger gây bệnh thối rửa chồi bong vải, thối rửa thân dứa sợi [30] Aspergillus niger có khả gây bệnh cho người so với số loài Aspergillus khác Nhưng hít vào số lượng bào tử lớn, gây bệnh phổi nghiêm trọng Ngồi ra, Aspergillus niger nguyên nhân phổ SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger môi trường mía – cám gạo biến bệnh otomycosis (nhiễm trùng tai nấm), gây đau, tạm thời không nghe trường hợp nghiêm trọng dẫn đến hư ống tai màng nhĩ [28] 2.1.5 Các ứng dụng Aspergillus niger Từ lâu đời người ta biết sử dụng Aspergillus niger để sản xuất chế phẩm sinh học acid hữu cơ, loại enzyme, chế phẩm giàu protein,… phục vụ phát triển công nghệ thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi… Aspergillus niger nuôi để sản xuất công nghiệp Nhiều chủng Aspergillus niger sử dụng chế phẩm công nghiệp acid citric (E330) acid gluconic (E574) đánh giá chấp nhận lượng hàng ngày Tổ chức Y tế Thế giới Nhiều enzym hữu ích sản xuất cách sử dụng lên men cơng nghiệp Aspergillus niger Ví dụ, Aspergillus niger enzym glucoamylase sử dụng sản sirô bắp cao fructose, pectinaza sử dụng rượu táo rượu vang α-galactosidase, loại enzyme mà phá vỡ số loại đường phức tạp, thành phần Beano thuốc khác mà nhà sản xuất khẳng định làm giảm chứng đầy [30] 2.2 Xylanase 2.2.1 Các đặc tính cấu trúc xylan Xylan polysaccharide hỗn tạp có chứa nhóm phụ gốc acetyl, 4-Omethyl-D-glucuronosyl α-arabinofuranosyl liên kết với khung tạo gốc xylopyranose Bộ khung liên kết với theo kiểu β-1,4- glycozit Lignin bao quanh xylan, liên kết với xylan liên kết este gốc axit 4-O-methyl-Dglucuronic SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo Hình 2.2 Cấu trúc arabinoxylan cỏ Graminiae [32] Xylan, thành phần hemicellulose tìm thấy thành tế bào thực vật polysaccharide thứ hai sau cellulose, chiếm gần phần ba carbon hữu phục hồi trái đất Xylan thành phần hemicelulose, phức hợp polysaccharide gồm: xylan, xylanglucan, glucomannan, galactoglucomannan arabinogalactan Phức hợp với cellulose lignin hình thành nên thành phần polymer vách tế bào thực vật Xylan tìm thấy lượng lớn gỗ cứng từ thực vật hạt kín (15-30%), gỗ mềm từ thực vật hạt trần (7- 10%) hàng năm (30%) [15] Hình 2.3 Sơ đồ cấu trúc vách tế bào thực vật [33] Ba thành phần cấu trúc vách tế bào thực vật, tương tác với nhờ liên kết cộng hóa trị khơng cộng hóa trị Xylan ranh giới ligin cellulose, vị trí quan trọng cho kết dính chất xơ tính tồn vẹn vách tế bào thực vật SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger môi trường mía – cám gạo Hemicellulose polysaccharide màng tế bào tan dung dịch kiềm có liên kết chặt chẽ với cellulose, ba sinh khối tự nhiên Cùng với cellulose lignin, hemicellulose tạo nên thành tế bào vững thực vật Về cấu trúc, hemicellulose có thành phần D-glucose, D-galactose, Dmannose, D-xylose L-arabinose liên kết với thành phần khác nằm liên kết glycoside Hemicellulose chứa axit 4-O-methylglucuronic, axit Dgalacturonic axit glucuronic Trong đó, đường D-xylose, L-arabinose, Dglucose D-galactose phổ biến thực vật thân cỏ ngũ cốc Tuy nhiên, khác với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose thực vật thân cỏ lại có lượng lớn dạng liên kết phân nhánh phụ thuộc vào loài loại mơ lồi phụ thuộc vào độ tuổi mơ Tùy theo thành phần hemicellulose có chứa monosaccharide mà có tên tương ứng manan, galactan, glucan xylan Các polysaccharide manan, galactan, glucan hay xylan chất phổ biến thực vật, chủ yếu thành phần màng tế bào quan khác gỗ, rơm rạ,… Trong loại hemicellulose, xylan polymer thành tế bào thực vật gốc D-xylopyranose kết hợp với qua liên kết β-1,4-Dxylopyranose, nguồn lượng dồi thứ hai trái đất Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm trục chuỗi bên Các gốc thay chủ yếu khung xylan gốc acetyl, arabinosyl glucuronosyl Các nhóm có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị khơng hóa trị với lignin, cellulose polymer khác Cấu tạo, số lượng vị trí xylan loài thực vật khác khác Xylan tồn dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan gỗ cứng (Hình 2.4), hay arabino-4-O-methylglucuronoxylan gỗ mềm (Hình 2.5), hay thành phần cấu tạo xylan axit D-glucuronic, có khơng có liên kết ete 4-Omethyl arabinose loài ngũ cốc [31] SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo Hình 2.4 O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan gỗ cứng [31] Hình 2.5 Arabino-4-O-methylglucuronoxylan gỗ mềm [31] 2.2.2 Khái niệm phân loại xylanase 2.2.2.1 Khái niệm xylanase Xylanase hydrolase xúc tác thủy phân loại đường phức tạp (chủ yếu xylan số hợp chất liên quan) đến đường đơn giản (các sản phẩm xylose)  Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase;  Tên công nhận là: endo-β-1,4-xylanase; SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 10 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger môi trường mía – cám gạo Cách tiến hành: • Vơ hố mẫu - Cân xác khoảng 3g mẫu rắn tách ẩm hoàn toàn (sấy 100 – 105oC đến khối lượng khơng đổi) - Gói mẫu giấy lọc khơng tro - Chuyển mẫu vào bình vơ hố (bình Kjeldahl) - Thêm vào bình vơ hố 10ml H 2SO4 đậm đặc 0,2g hỗn hợp CuSO4 : K2SO4 theo tỉ lệ 1:3 - Đăt bình vơ hoá lên bếp đun đun đến dung dịch suốt có màu xanh ngọc (khơng cặn) dừng q trình vơ hố mẫu Để nguội - Tiến hành định mức lên 250ml • Lắp hệ thống cất đạm • Chuẩn bị vận hành hệ thống cất đạm - Cho nước vào bình đun (1/2 – 2/3V) thể tích hệ thống sinh hàn (mở van nước) - Đóng khố hệ thống - Sử dụng đèn cồn để đun nóng bình đun - Khi nước ngưng tụ đầu hệ thống sinh hàn tiến hành quy trình rửa - Cho nước cất vào phễu, nạp mẫu mở khoá để nước vào bình cất - Tắt đèn cồn, nước bình cất vào bình xả, mở khố bình xả để xả nước ngồi - Lặp lại quy trình rửa hai lần • Cất đạm - Chuẩn bị bình thu NH3 chứa 10ml dung dịch H2SO4 0,1N, giọt thị methyl red (hay phenolphtalein) nhúng ngập đầu ống sinh hàn - Mở đèn cồn để đun nóng bình đun - Mẫu vơ hố pha lỗng cho vào phễu nạp mẫu (khoảng 10ml) SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 48 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo - Mở khoá phễu nạp mẫu từ từ để đưa mẫu vào bình cất - Rửa phễu nạp mẫu lần nước cất vô đạm - Cho 10ml NaOH 40% vàp phễu nạp mẫu, mở khố từ từ lưu ý khơng xả hết - Rửa phễu nạp mẫu lần (cho từ từ vào không xả hết) - Thực trình cất đạm 10phút • Chuẩn độ Hạ bình thu NH3 khỏi đầu ống sinh hàn thực 5phút Lấy bình thu NH3 tiến hành chuẩn độ A2 Phương pháp xác định hàm lượng C tổng số Cách tiến hành: - Cân xác 0,5000 g mẫu (sai số 0,001) - Cho đất vào đáy bình tam giác chịu nhiệt có dung tích 100ml Sau đó, cho vào bình tam giác thể tích xác 10,00ml dung dịch K2Cr2O7 0,4N acid sunfuric 18N Lắc dùng phễu đậy bình - Đun bếp điện có lưới amiăng cho sơi nhẹ phút kể từ bắt đầu sôi - Lấy bình tam giác khỏi bếp điện để nguội bình đến nhiệt độ phịng Thêm giọt thị màu acid phenyl antranilic Chuẩn độ dung dịch chuẩn muối Mo 0,2N màu chuyển từ tím sang xanh 4g mẫu 50ml nước cất 50ml H2SO4 8% Đun 10 phút Lọc qua giấy lọc sấy khô đến lượng không đổi Rửa lần với nước sôi A3 Phương pháp xác định cellulose Lấy cặn Cách tiến hành: Đun 10 phút 50ml nước,9ml NaOH 30% SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang o 49 Sấy đến lượng không đổi 100oC -105 C Hình A1 Sơ đồ phương pháp định lượng Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo - Cân 4g mẫu sấy 105oC từ – vào cốc 150ml - Thêm 50ml dung dịch H2SO4 8% thêm 50ml nước cất đun sôi 10phút, - Phần cịn lại rửa cạn với nước nóng nhiều lần (5 lần) - Thêm nước cất đủ 100mL, thêm 9ml dung dịch 30% NaOH đun sôi 10 phút - Rửa gạn nước nóng nhiều lần - Chuyển cặn sang giấy lọc biết trọng lượng trước - Rửa nhiều lần giấy lọc nước nóng - Sấy cặn giấy lọc 105oC vòng – PHỤ LỤC B Phương pháp xác định hoạt độ enzyme  Hóa chất: - Dung dịch đệm citrate (0,05M; pH 5,3): hoà tan 10,5g acid citric 800ml nước cất, điều chỉnh pH 5,3 NaOH 1M Pha lỗng thành 1000ml với nước cất bình định mức - Dung dịch xylan 1%: hoà tan 1,0g xylan với khoảng 80ml đệm citrate Đun sôi máy khuấy từ có gia nhiệt Làm nguội nhiệt độ phịng Pha lỗng thành 100ml với dung dịch đệm citrate Giữ chất nhiệt độ 4oC vòng tuần - Thuốc thử DNS: Bao phủ cốc 1000ml giấy nhôm để tránh ánh sáng Đặt cốc lên bếp từ, thêm vào khoảng 600ml nước cất thỏi nam SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 50 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo châm khuấy, bắt đầu khuấy Thêm 10g 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic để hòa tan, từ từ thêm 10g NaOH vào để hòa tan Chậm chậm thêm 300g muối Rochelle khoảng 20- 30 phút Dung dịch làm ấm tới nhiệt độ tối đa 45oC để thành dung dịch suốt Lọc dung dịch giấy lọc Whatman cần Để dung dịch nguội, định mức thành 1000ml nước cất  Đường chuẩn xylose Bảng B1 Đo OD dung dich chuẩn xylose Ống nghiệm Lượng xylose µmol OD đọc đo bước sóng 540nm 0,0 0,000 0,134 3,2 0,237 0,341 10 0,628 Hình B1 Đồ thị đường chuẩn xylose PHỤ LỤC C Cách pha môi trường PGA Khoai tây gọt vỏ, rửa, cân 200g, thái nhỏ Thêm vào khoảng 500ml nước cất đun sôi khoảng 1h15 phút Lọc lấy nước trong, tiếp tục đun thêm vào 20g glucose sau 20g agar Bổ sung nước cất cho đủ 1000ml Đun sôi SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 51 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo khoảng phút ta môi trường nuôi cấy PGA PHỤ LỤC D Phương pháp đếm tế bào vi sinh vật kính hiển buồng đếm hồng cầu  Phương pháp lấy mẫu để đếm - Pha loãng mẫu nước cất vơ trùng - Đặt kính lên bề mặt buồng đếm vùng trung tâm Gữ kính cạnh bên, nghiêng cho dịch huyền phù nấm men vào cạnh phía ngồi Lực mao dẫn giúp dịch huyền phù trải khu vực đếm - Thấm nhẹ dịch huyền phù dư để ổn định phút - Quan sát đếm kính hiển vi với vật kính x40  Cách thức đếm - Đếm số lượng tế bào nấm men ô vuông nhỏ - Các tế bào ranh giới cạnh vng đếm cạnh liên tiếp - Tế bào nẩy chồi chồi tính tế bào - Thông thường phải đếm số tế bào tất vng - Có đếm số lượng tế bào ô vuông đại diện Số lượng tế bào ô đại diện phải mức 50- 200 tế bào  Tính tốn x= a.4000.b 1000 c Trong đó: x: lượng tế bào ml a: số lượng tế bào ô lớn b: tỷ lệ pha loãng canh trường (nghịch đảo nồng độ pha lỗng) c: số nhỏ lớn (c= 16.5= 80) SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 52 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo PHỤ LỤC E Kết phân tích Anova E1: Kết xử lý Anova xử lý kết khảo sát tỉ lệ LM:CG Lặp lại Tỉ lệ LM : CG 1: 2:8 3: 4: 5: 688,67 938,87 587,78 482,22 306,67 670 915,53 570 482,22 293,33 650 893,33 545,53 494,47 286,67 ANOVA Table for HOATDOENZYM by TILEMOITRUONG Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups Within groups 631339.0 157835.0 2992.61 10 299.261 527.41 0.0000 Total (Corr.) 634331.0 14 Multiple Range Tests for HOATDOENZYM by TILEMOITRUONG Method: 95.0 percent LSD TILEMOITRUONG Count Mean Homogeneous Groups 5LM:5CG 295.557 4LM:6CG 486.303 3LM:7CG 567.77 1LM:9CG 669.557 2LM:8CG 915.91 X X X X X - Contrast Difference +/- Limits - SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 53 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger môi trường mía – cám gạo 1LM:9CG - 2LM:8CG *-246.353 31.4719 1LM:9CG - 3LM:7CG *101.787 31.4719 1LM:9CG - 4LM:6CG *183.253 31.4719 1LM:9CG - 5LM:5CG *374.0 31.4719 2LM:8CG - 3LM:7CG *348.14 31.4719 2LM:8CG - 4LM:6CG *429.607 31.4719 2LM:8CG - 5LM:5CG *620.353 31.4719 3LM:7CG - 4LM:6CG *81.4667 31.4719 3LM:7CG - 5LM:5CG *272.213 31.4719 4LM:6CG - 5LM:5CG *190.747 31.4719 - E2 Kết xử lý Anova xử lý kết khảo sát pH Lặp lại pH 4,5 5,5 194,45 228,33 336,67 522,22 305,56 200 216,11 357,78 490 292,22 197,78 222,78 331,11 517,78 298,89 ANOVA Table for HOATDOENZYM by PH Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups Within groups 184208.0 46052.0 1185.26 10 118.526 388.54 0.0000 Total (Corr.) 185393.0 14 Multiple Range Tests for HOATDOENZYM by PH SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 54 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo Method: 95.0 percent LSD PH Count Mean Homogeneous Groups 197.41 4.5 222.407 298.89 341.853 5.5 510.0 X X X X X Contrast Difference +/- Limits - 4.5 *-24.9967 19.8063 - *-144.443 19.8063 - 5.5 *-312.59 19.8063 - *-101.48 19.8063 4.5 - *-119.447 19.8063 4.5 - 5.5 *-287.593 19.8063 4.5 - *-76.4833 19.8063 - 5.5 *-168.147 19.8063 - *42.9633 19.8063 5.5 - *211.11 19.8063 - E3 Kết xử lý Anova xử lý kết khảo sát độ ẩm Lặp lại Độ ẩm (%) 40 45 50 55 60 65 448,33 558,89 1220 863,33 626,11 555 451,67 552,22 1216,67 872,22 627,22 557,22 451,67 550 1218,89 870 623,89 555 ANOVA Table for HOATDOENZYM by DOAM SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 55 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.21898E6 243797.0 107.855 12 8.98793 Within groups 27124.92 0.0000 Total (Corr.) 1.21909E6 17 Multiple Range Tests for HOATDOENZYM by DOAM Method: 95.0 percent LSD DOAM Count Mean Homogeneous Groups 40 450.557 X 45 553.703 X 65 555.74 X 60 625.74 55 868.517 50 1218.52 X X X Contrast Difference +/- Limits 40 - 45 *-103.147 5.33341 40 - 50 *-767.963 5.33341 40 - 55 *-417.96 5.33341 40 - 60 *-175.183 5.33341 40 - 65 *-105.183 5.33341 45 - 50 *-664.817 5.33341 45 - 55 *-314.813 5.33341 45 - 60 *-72.0367 5.33341 45 - 65 -2.03667 5.33341 50 - 55 *350.003 5.33341 50 - 60 *592.78 5.33341 50 - 65 *662.78 5.33341 55 - 60 *242.777 5.33341 55 - 65 *312.777 5.33341 60 - 65 *70.0 5.33341 - E4 Kết xử lý Anova xử lý kết khảo sát thời gian SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 56 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo Lặp lại Thời gian (giờ) 24 48 72 96 417,78 916,67 1178,89 757,78 413,33 921,11 1152,22 760 416,67 920 1142,22 761,11 ANOVA Table for HOATDOENZYM by THOIGIAN Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups Within groups 872033.0 290678.0 745.817 93.2272 3117.95 0.0000 Total (Corr.) 872779.0 11 Multiple Range Tests for HOATDOENZYM by THOIGIAN Method: 95.0 percent LSD THOIGIAN Count Mean Homogeneous Groups 24 415.927 96 759.63 48 919.26 72 1157.78 X X X X Contrast Difference +/- Limits 24 - 48 *-503.333 18.1797 24 - 72 *-741.85 18.1797 24 - 96 *-343.703 18.1797 48 - 72 *-238.517 18.1797 48 - 96 *159.63 18.1797 72 - 96 *398.147 18.1797 - SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 57 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo PHỤ LỤC F Các thiết bị sử dụng nghiên cứu môi trường nuôi cấy Bộ chưng cất đạm Kjeldahl Máy sấy ẩm //Axis SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 58 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo Máy ly tâm Anke Nồi hấp tiệt trùng Autoclauve SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 59 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger môi trường mía – cám gạo Bút đo pH Trans Tủ sấy Memmert SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 60 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo Máy đo quang Uviline 9400 Nấm mốc Aspergillus niger môi trường PGA SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 61 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger môi trường mía – cám gạo Nấm mốc Aspergillus niger dang phát triển canh trường PHỤ LỤC G Hình ảnh sản phẩm Sản phẩm dịch chiết enzyme xylanase SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 62 ... 42 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo 5.1 Kết luận Nội dung thực đề tài tốt nghiệp ‘‘ Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus. .. Trang 24 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger mơi trường mía – cám gạo 3.1 Vật liệu 3.1.1 Lá mía, cám gạo Lá mía sử dụng từ giống mía K84/200 cung cấp từ trại mía cung... tổng hợp xylanase từ nấm mốc SVTH: Võ Lê Phương Thảo Trang 13 Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger môi trường mía – cám gạo Các enzym xylanase sinh tổng hợp từ nấm mốc