Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp

tumefaciens là một trong những vi khuẩn đang được sử dụng để sản xuất CoQ10 hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có hàm lượng CoQ10 tương đối cao so với các vi sinh vật khác, chỉ tổng

MỞ ĐẦU

Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), là một trong những loại coenzyme tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử ở cả prokaryote và eukaryote CoQ10 có vai trò quan trọng trong việc sản xuất ra ATP - nguồn năng lượng sinh học của cơ thể CoQ10 ngày càng được sử dụng nhiều làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe và được đưa vào các mỹ phẩm làm đẹp như một chất chống oxy hóa, chống lão hóa; ứng dụng trong y tế nhằm ngăn ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh về tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng hệ thống miễn dịch, giảm huyết áp

Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một tăng lên Để đáp ứng nhu cầu đó đã có nhiều giải pháp được đưa ra như tổng hợp hóa học, bán tổng hợp và công nghệ sinh học Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên hiện nay CoQ10 được sản xuất chủ yếu bằng con đường lên men nhờ vi khuẩn như

Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli, Sporobolomyces salmonicolor, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus denitrificans…

A tumefaciens là một trong những vi khuẩn đang được sử dụng để sản xuất

CoQ10 hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có hàm lượng CoQ10 tương đối cao

so với các vi sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất ở quy mô công nghiệp Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực

tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận

Coenzyme Q10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp”

 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo chủng A tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp Coenzyme Q10

- Nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận Coenzyme Q10

- Ứng dụng Coenzyme Q10 vào sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức năng

 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn chủng A tumefaciens sinh tổng hợp Coenzyme Q10

- Nghiên cứu tạo chủng A tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoenzymeQ10

- Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 và xác định đặc tính của Coenzyme Q10

từ chủng A tumefaciens tái tổ hợp

- Khảo sát khả năng ứng dụng của Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực

phẩm chức năng dưới dạng viên nang

 Những đóng góp mới của luận án

- Đã phân lập và tuyển chọn được chủng A tumefaciens TT4 sinh tổng hợp

CoQ10 cao

- Đã tách dòng và giải trình tự được 2 gen dps và dxs mã hóa cho 2 enzyme chìa khóa của con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A tumefaciens TT4 phân lập ở VN và tạo được chủng A tumefaciens tái tổ hợp mang 2 gen trên cho năng

suất sinh tổng hợp CoQ10 cao

- Xây dựng quy trình tách chiết CoQ10 từ A tumefaciens

- Bước đầu ứng dụng Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực phẩm chức

năng dưới dạng viên nang

 Bố cục của luận án

- Luận án được trình bày trong 123 trang: mở đầu (2 trang), tổng quan tài liệu (32 trang), vật liệu và phương pháp nghiên cứu (20 trang), kết quả và thảo luận (58 trang với 11 bảng, 50 hình), kết luận và kiến nghị 1 trang), danh mục các công trình đã công bố (1 trang) và tài liệu tham khảo (9 trang với 4 tài liệu tiếng Việt và 107 tài liệu tiếng Anh)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Cấu tạo Coenzyme Q10

1.2 Nguồn thu Coenzyme Q10

1.2.1 Tổng hợp hóa học

1.2.2 Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật

1.2.3 Coenzyme Q10 từ vi sinh vật

1.3.Con đường tổng hợp Coenzyme Q10 từ vi sinh vật

1.4 Lên men sinh tổng hợp Coenzyme Q10 từ A tumefaciens

1.4.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon

1.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ nitơ

1.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng

1.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ

1.4.5 Ảnh hưởng của pH

1.4.6 Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan

1.5 Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp Coenzyme Q10

1.5.1 Lên men gián đoạn

1.5.2 Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – batch)

1.8 Vai trò và ứng dụng của Coenzyme Q10

1.8.1 Vai trò của Coenzyme Q10

1.8.2 Ứng dụng của Coenzyme Q10

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

Các mẫu nốt sần cây hoa hồng được thu thập từ Tây Tựu và Mê Linh, Hà Nội

Chủng A tumefaciens EHA105 từ Viện Công nghệ Sinh học, VAST

Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu tách dòng và biểu hiện:

Mồi xuôi (DpsF): 5’-ATAGAGCTCATTGCCGCGCAAGGCGTCAGTT-3’; Mồi ngược (DpsR): 5’-TTTGGATCCTCAGTTGAGACGCTCGATGCA-3’ Mồi xuôi (DxsF): 5’-TAAGGATCCACGCATAGAACAGGCCAAAC-3’;

Mồi ngược (DxsR): 5’-ATTGTCGACTCAGCCGGCGAAACCGACGC-3’; Cặp mồi 16 S được sử dụng trong giải trình tự:

Mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’;

Mồi ngược 1492R: 5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’

Các plasmid được sử dụng trong nghiên cứu: pJet1.2/Blunt (Thermo Scientific, Mỹ), pCAMBIA1301 (Viện Công nghệ Sinh học, VAST.)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng A tumefaciens sinh tổng hợp

CoQ10 theo Islam (2010)

- Nuôi cấy chìm chủng A tumefaciens DPXS12 sinh tổng hợp Coenzyme Q10

- Tách chiết DNA tổng số, DNA plasmid từ vi khuẩn, khuếch đại gen dps, dxs, 16S bằng kỹ thuật sốc nhiệt, biến nạp DNA plasmid vào E Coli bằng sốc

nhiệt, theo Sambrook và Russel (2001)

- Phương pháp biến nạp plasmid vào A tumefaciens bằng phương pháp xung

điện

- Phương pháp tách chiết CoQ10 từ A tumefaciens theo Ranadive (2011)

- Xác định hàm lượng CoQ10 bằng phương pháp Craven

- Phương pháp phân tích Coenzyme Q10 bằng HPLC

- Phương pháp tạo phức β-cyclodextrin - CoQ10 theo Fir và cộng sự (2009)

- Phương pháp xác định hoạt tính sinh học của CoQ10 theo Fir (2009), Hisa và cộng sự (2014)

- Phương pháp điều chế viên nang cứng chứa CoQ10

- Phương pháp tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp CoQ10 bằng quy hoạch bậc hai theo Box – Behnken

- Phương pháp tin sinh học

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN A TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP

COENZYME Q10

Kết quả từ 13 mẫu nốt sần khác nhau thu thập từ vùng trồng hoa hồng Mê Linh

và Tây Tựu - Hà Nội đã phân lập được12 chủng vi khuẩn trên môi trường chọn lọc MacConkey, bao gồm 5 chủng từ nốt sần hoa hồng phường Tây Tựu, 7 chủng từ nốt

sần hoa hồng huyện Mê Linh Để chứng minh các vi khuẩn phân lập được là A tumefaciens, các chủng phân lập được tiến hành sàng lọc dựa theo một số đặc điểm

hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử

Kết quả từ 12 chủng phân lập đã sàng lọc được 4 chủng là A tumefaciens Từ các chủng phân lập trên và 3 chủng chuẩn A tumefaciens tiến hành tuyển chọn thông qua khả năng sinh tổng hợp CoQ10 Kết quả cho thấy, chủng vi khuẩn TT4 có khả năng

sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (13 mg/l) sau 96 giờ nuôi cấy so với các chủng khác

Từ các kết quả phân tích về hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử chủng vi

khuẩn phân lập TT4 được định danh là A tumfaciens TT4 Chủng này sẽ được sử

dụng cho các nghiên cứu tăng cường sự sinh tổng hợp CoQ10

3.2 NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10

Hình 3.1 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA tổng số của A

tumefaciens TT4 M, thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scientific, Mỹ)

Kết quả phổ điện di sản phẩm PCR cho thấy xuất hiện một băng DNA xấp xỉ 1,2

kb (hình 3.1A) và một băng kích thước khoảng 2,1 kb (hình 3.1B) khi sử dụng cặp mồi DpsF/R và DxsF/R tương ứng Kích thước của các sản phẩm PCR thu được là hoàn toàn phù hợp với kích thước của hai đoạn gen đích cần khuếch đại Từ kết quả

này cho thấy hai đoạn gen dps và dxs đã được khuếch đại từ khuôn DNA tổng số của chủng A tumefaciens TT4 bằng kỹ thuật PCR

Sản phẩm PCR của hai gen dps và dxs được xử lý bằng enzyme Klenow và gắn

vào vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo Scienctific, USA) Sản phẩm nối ghép

được biến nạp vào E coli DH10b để chọn dòng mang vector tái tổ hợp Kết quả biến

nạp cho thấy xuất hiện 10 và 7 khuẩn lạc trên môi trường LB thạch chứa ampicilin

(100 µg/ml) tương ứng với hai gen dps và dxs Plasmid đã được tách chiết từ những

khuẩn lạc và được sử dụng cho sàng lọc sơ bộ để chọn ra một dòng tương ứng với mỗi gen để nghiên cứu tiếp theo Trước tiên, plasmid được sử dụng làm khuôn cho

phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen dps và dxs tương ứng Kết quả cho thấy

đều xuất hiện băng sản phẩm PCR trên phổ diện di với kích thước phù hợp với kích

thước của gen dps (hình 3.2A) và dxs (hình 3.2B) Kích thước sản phẩm PCR từ

khuôn DNA plasmid tương đương với kích thước sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng

số của chủng A tumefaciens TT4 ban đầu (hình 3.2) Kết quả nhận được chứng tỏ hai dòng được lựa chọn mang gen đích tương ứng là dps và dxs Tuy nhiên, để chắc chắn

hơn DNA plasmid của hai dòng này tiếp tục được xử lý bẳng các enzyme hạn chế thích hợp

Hình 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA plasmid của

các dòng tái tổ hợp C3, C6 là khuôn DNA plasmid tách chiết từ clone số 3 và số 6 TT4 là khuôn DNA tổng số tách chiết từ chủng A tumefaciens TT4 Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ)

Theo thiết kế hai trình tự cắt của enzyme hạn chế SacI và BamHI được đưa vào đầu 5’ của cặp mồi DpsF/R và tương tự trình tự cắt của BamHI và SalI được đưa vào

cặp mồi DxsF/R Kết quả xử lý bằng enzyme cắt hạn chế cho thấy đối với cả hai

clone 3 và 6 đều văng ra băng DNA có kích thước tương ứng với kích thước gen dps khoảng 1077 bp (hình 3.3A) và gen dxs khoảng 2100 bp (hình 3.3B) Từ các kết quả

thu được có thể khẳng định rằng hai dòng số 3 và 6 là các dòng tái tổ hợp mang hai

gen đích tương ứng là dps và dxs

Hình 3.3 Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid bằng các enzyme hạn chế đối với dòng số 3

mang gen dps (A) và dòng 6 mang gen dxs (B) Đường chạy 1, 3 là DNA plasmid chưa cắt; đường chạy 2, 4 là DNA plamid được cắt bằng cặp enzyme SacI/BamHI và BamHI/SalI tương ứng với clone 3 và 6 Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ)

Để kiểm tra trình tự và khung đọc của hai gen đích dps và dxs đã được tách dòng

hai plasmid tái tổ hợp được sử dụng làm khuôn cho phản ứng xác định trình tự Trình

tự nuclecotide và axit amin suy diễn của gen dps và dxs đã được xác định Kết quả

cho thấy gen được tách dòng chứa một khung đọc mở cho phép dịch mã tổng hợp một protein nguyên vẹn

3.2.2 Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs

Trong nghiên cứu này vector pCAMBIA1301 với kích thước 11837 bp được sử

dụng làm vector biểu hiện phù hợp chủng chủ A tumefaciens Hai gen dps và dxs sẽ

được đưa độc lập và đồng thời vào vector pCAMBIA1301 để tạo ra các cấu trúc biểu

hiện pCAM-dps, pCAM-dxs và pCAM-dps-dxs

3.2.2.1 Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs độc lập

Hai gen dps và dxs được cắt ra khỏi vector tách dòng bằng hai cặp enzyme cắt hạn chế tương ứng là SacI/BamHI và BamHI/SalI Hai gen dps và dxs thu được đã

được gắn vào vector biểu hiện pCAMBIA1301 đã được mở vòng bằng cặp enzyme

cắt hạn chế tương ứng Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E coli DH10b để chọn dòng Kết quả biến nạp cho thấy xuất hiện 11 và 2 khuẩn lạc tương ứng với gen dps

và dxs trên môi trường LB thạch chứa kanamycin (100 µg/ml) DNA plasmid từ các

dòng đã được sử dụng để sàng lọc sơ bộ cho các nghiên cứu tiếp theo Đối với gen

dps, 8 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng phản ứng PCR

sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.4A) và xử lý bằng cặp enzyme cắt hạn chế SacI/BamHI

(hình 3.4B) Kết quả cho thấy cả 8 dòng đều xuất hiện băng DNA khoảng 1,1 kb

tương ứng với kích thước gen dps (1077bp) (hình 3.4B)

Hình 3.4 Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa

chọn đối với gen dps Đường chạy 1-8 tương ứng với 8 dòng được lựa chọn ĐC là sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen Đường chạy (+) là sản phẩm PCR từ khuôn gốc Đường chay (-) là sản phẩm cắt plasmid đối chứng M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ)

Hình 3.5 Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa

chọn đối với gen dxs Đường chạy 1-2 tương ứng với 2 dòng được lựa chọn ĐC là sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ)

2100 bp 

2100 bp 

1077 bp 

Tương tự đối với gen dxs, 2 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen

đích bằng phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.5A) và xử lý bằng cặp

enzyme BamHI/SalI (hình 3.5B) Kết quả cho thấy cả 2 dòng đều xuất hiện băng DNA khoảng 2,1 kb tương ứng với kích thước đọan gen đích dxs (2103 bp) (hình 3.5B) Các kết quả thu được cho thấy rằng gen dps và dxs đã được tách dòng thành

công trong vector biểu hiện pCAMBIA1301 Các cấu trúc tái tổ hợp được ký hiệu

pCAM-dps và pCAM-dxs tương ứng

3.2.2.2 Tạo cấu trúc biểu hiện mang đồng thời hai gen dps và dxs

Để tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp chứa đồng thời hai gen dps và dxs, gen dps thu được từ vector tách dòng sau khi xử lý bởi cặp enzyme cắt hạn chế SacI và BamHI được nối vào vector pCAM-dxs đã được mở vòng bởi SacI/BamHI Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E coli DH10b và kết quả thu được 10 khuẩn lạc Kết quả

PCR từ khuôn plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R cho thấy cả 10 khuẩn lạc đều cho

sản phẩm có kích thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) (hình 3.6A) Đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs không thấy xuất hiện sản phẩm, điều đó chứng tỏ plasmid từ 10 dòng thu được mang gen dps Dòng số 9 được lựa chọn để kiểm tra plasmid bằng việc cắt với SacI/BamHI, kết quả cho thấy xuất hiện 1 băng

DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.6B) Từ kết quả này có thể khẳng định rằng đã gắn được

gen dps vào vector tái tổ hợp pCAM-dxs để tạo cấu trúc tái tổ hợp mới chứa đồng thời hai gen dps và dxs, được ký hiệu pCAM-dps-dxs

Hình 3.6 Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng sử dụng cặp mồi DpsF/R

(A) và sản phẩm cắt enzyme hạn chế (B) Đường chạy 1-10, sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng tương ứng; mẫu đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs (ĐC); RE/9, dòng số 9 được

xử lý bởi SacI/BamHI thang DNA chuẩn 100 bp (M1) và 1kb (M2)

1077 bp 

1077 bp 

3.2.2.3 Tạo chủng A tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs Các cấu trúc tái tổ hợp pCAM-dps, pCAM-dxs, pCAM-dps-dxs được biến nạp vào tế bào A tumefaciens EHA 105 khả biến bằng phương pháp xung điện Các dòng

tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường chứa kanamycin (100µg/ml) Tiến hành xác

định khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng tái tổ hợp dps, dxs, pCAM-dps-dxs, và chủng đối chứng pCAM (hình 3.7) Kết quả cho thấy chủng tái tổ hợp chứa đơn gen pCAM-dps và pCAM-dxs có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 tăng lên 1,34 và 1,38 lần so với đối chứng Khi kết hợp cả hai gen dps và dxs tạo chủng pCAM-dps-dxs đã làm tăng khả năng tổng hợp CoQ10 của A tumefaciens lên 1,80 lần so với đối chứng Do đó các dòng A tumefaciens mang cấu trúc pCAM-dps- dxs được lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.7 Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng A tumefaciens tái tổ hợp Chủng tái tổ

hợp chứa vector tái tổ hợp mang đơn gen pds và dxs và đồng thời hai gen dps-dxs Chủng đối chứng mang vector pCAMBIA1301

pCAM-Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của 28 dòng A tumefaciens pCAM-dps-dxs tái tổ hợp cho thấy khả năng sinh tổng hợp CoQ10 là khác nhau (hình

3.8) Trong số 28 dòng có dòng số 12 có khả năng tổng hợp CoQ10 cao nhất so với dòng khác (19 mg/l) gấp 2,16 lần so với chủng gốc mang vector pCAM, vì vậy dòng

số 12 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

Hình 3.8 Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các dòng A tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc

pCAM-dps-dxs

0 5 10 15 20

Dòng số 12 được kiểm tra cấu trúc pCAM-dps-dxs bằng cách tiến hành tách

plasmid, thực hiện phản ứng PCR và xử lý bởi enzyme hạn chế Kết quả PCR từ khuôn plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R và DxsF/R cho thấy đều cho sản phẩm có

kích thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) và dxs (2103bp) (hình 3.9B, 3.9A) Để kiểm tra plasmid bằng việc cắt với SacI/BamHI, kết quả cho

thấy xuất hiện 1 băng DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.9C) Từ kết quả này có thể khẳng

định rằng vector tái tổ hợp pCAM-dps-dxs đã được đưa vào thành công trong A tumefaciens Dòng số 12 được ký hiệu là A tumefaciens DPXS12

Hình 3.9 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A, giếng 1) và dxs (B, giếng 2), sản phẩm cắt

enzyme hạn chế SacI/BamHI (C, giếng 3) từ DNA plasmid của A tumefaciens DPSX12 M, thang DNA

chuẩn 100 bp (Thermo Scientific)

3.3 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP

COQ10 TỪ A TUMEFACIENS TÁI TỔ HỢP

3.3.1 Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10

Khi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng

sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens trên môi trường với các loại đường khác

nhau Kết quả thể hiện trên hình 3.10A và 3.10B cho thấy, trong môi trường có chứa nguồn cacbon là sucrose cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (16 mg/l) và nồng độ đường sucrose 5% cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất

Cũng tương tự như thế khi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn

nitơ tới khả năng sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens Kết quả thể hiện trên hình

3.10C và 3.10D cho thấy, trong môi trường có chứa nguồn nitơ là cao ngô (CSL) cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (26,68 mg/L) và nồng độ cao ngô 1% cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất

Kb

3,0 - 2,0 - 1,0 -

Kb

- 3,0

- 2,0

3.3.2 Ảnh hưởng của pH đầu môi trường

Kết quả hình 3.11A cho thấy, với pH đầu là 8,0 hàm lượng CoQ10 thu được là cao nhất đạt 68,8 mg/L, vì vậy pH đầu là 8,0 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

3.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống

Kết quả hình 3.11B cho thấy, hàm lượng CoQ10 thu được cao nhất đạt khi OD = 0,8 đạt 108 mg/l cao gấp 1,6 lần so với OD = 0,05 Vì vậy tỷ lệ cấp giống với OD = 0,8 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Kết quả hình 3.11C cho thấy, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CoQ10 của A tumefaciens DPXS12 là 28oC Vì vậy cứu nhiệt độ 28oC được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

3.3.5 Ảnh hưởng của thời gian

Từ kết quả hình 3.11D cho thấy, thời gian lên men càng tăng thì hàm lượng CoQ10 được sinh tổng hợp cũng tăng Tuy nhiên hàm lượng CoQ10 thu được từ 96 giờ đến 144 giờ tăng không đáng kể, sau 144 giờ hàm lượng CoQ10 chỉ tăng 1,03%

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A), nồng độ sucrose (B), nguồn nitơ (C), nồng độ

CSL(D) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp

(tăng 2,57 mg/L) so với 96 giờ lên men Từ kết quả thu được thời gian 96 giờ được

lựa chọn để thu nhận CoQ10 trong quá trình lên men

Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH đầu môi trường (A), OD giống (B), nhiệt độ nuôi cấy (C), thời gian

(D) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp.

3.4 TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COQ10 TỪ A

TUMEFACIENS

3.4.3 Tối ƣu hóa quá trình sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp

Dựa trên cơ sở đã khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men sinh

tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp, tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời

của nồng độ đường sucrose (X1), nồng độ cao ngô (X2), nhiệt độ (X3) Kết quả được

thể hiện trên bảng 3.3

Phương trình hồi quy biểu diễn hàm lượng CoQ10 mô tả ảnh hưởng của các yếu

tố độc lập và các mối tương tác giữa chúng được biểu diễn như sau: