Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp

MỞ ĐẦU Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), loại coenzyme tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử prokaryote eukaryote CoQ10 có vai trò quan trọng việc sản xuất ATP - nguồn lượng sinh học thể CoQ10 ngày sử dụng nhiều làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe đưa vào mỹ phẩm làm đẹp chất chống oxy hóa, chống lão hóa; ứng dụng y tế nhằm ngăn ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng hệ thống miễn dịch, giảm huyết áp Với nhiều ứng dụng có lợi nên nhu cầu CoQ10 ngày tăng lên Để đáp ứng nhu cầu có nhiều giải pháp đưa tổng hợp hóa học, bán tổng hợp công nghệ sinh học Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên CoQ10 sản xuất chủ yếu đường lên men nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli, Sporobolomyces salmonicolor, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus denitrificans… A tumefaciens vi khuẩn sử dụng để sản xuất CoQ10 chúng có nhiều ưu điểm có hàm lượng CoQ10 tương đối cao so với vi sinh vật khác, tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất quy mô công nghiệp Xuất phát từ sở lý luận thực tiễn nêu tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp”  Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu tạo chủng A tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp Coenzyme Q10 - Nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận Coenzyme Q10 - Ứng dụng Coenzyme Q10 vào sản xuất số sản phẩm thực phẩm chức  Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn chủng A tumefaciens sinh tổng hợp Coenzyme Q10 - Nghiên cứu tạo chủng A tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoenzymeQ10 - Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 xác định đặc tính Coenzyme Q10 từ chủng A tumefaciens tái tổ hợp - Khảo sát khả ứng dụng Coenzyme Q10 sản xuất sản phẩm thực phẩm chức dạng viên nang  Những đóng góp luận án - Đã phân lập tuyển chọn chủng A tumefaciens TT4 sinh tổng hợp CoQ10 cao - Đã tách dòng giải trình tự gen dps dxs mã hóa cho enzyme chìa khóa đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A tumefaciens TT4 phân lập VN tạo chủng A tumefaciens tái tổ hợp mang gen cho suất sinh tổng hợp CoQ10 cao - Xây dựng quy trình tách chiết CoQ10 từ A tumefaciens - Bước đầu ứng dụng Coenzyme Q10 sản xuất sản phẩm thực phẩm chức dạng viên nang  Bố cục luận án - Luận án trình bày 123 trang: mở đầu (2 trang), tổng quan tài liệu (32 trang), vật liệu phương pháp nghiên cứu (20 trang), kết thảo luận (58 trang với 11 bảng, 50 hình), kết luận kiến nghị trang), danh mục công trình công bố (1 trang) tài liệu tham khảo (9 trang với tài liệu tiếng Việt 107 tài liệu tiếng Anh) CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Cấu tạo Coenzyme Q10 1.2 Nguồn thu Coenzyme Q10 1.2.1 Tổng hợp hóa học 1.2.2 Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật 1.2.3 Coenzyme Q10 từ vi sinh vật 1.3.Con đường tổng hợp Coenzyme Q10 từ vi sinh vật 1.4 Lên men sinh tổng hợp Coenzyme Q10 từ A tumefaciens 1.4.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon nồng độ cacbon 1.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ nồng độ nitơ 1.4.3 Ảnh hưởng nguồn khoáng 1.4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ 1.4.5 Ảnh hưởng pH 1.4.6 Ảnh hưởng nồng độ oxy hòa tan 1.5 Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp Coenzyme Q10 1.5.1 Lên men gián đoạn 1.5.2 Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – batch) 1.6 Tách chiết đặc tính Coenzyme Q10 1.6.1 Tách chiết Coenzyme Q10 1.6.2 Tinh Coenzyme Q10 1.6.3 Đặc tính Coenzyme Q10 1.7 Cải biến chủng vi sinh vật sinh tổng hợp Coenzyme Q10 1.7.1 Đột biến chủng 1.7.2 Chủng tái tổ hợp 1.8 Vai trò ứng dụng Coenzyme Q10 1.8.1 Vai trò Coenzyme Q10 1.8.2 Ứng dụng Coenzyme Q10 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU Các mẫu nốt sần hoa hồng thu thập từ Tây Tựu Mê Linh, Hà Nội Chủng A tumefaciens EHA105 từ Viện Công nghệ Sinh học, VAST Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu tách dòng biểu hiện: Mồi xuôi (DpsF): 5’-ATAGAGCTCATTGCCGCGCAAGGCGTCAGTT-3’; Mồi ngược (DpsR): 5’-TTTGGATCCTCAGTTGAGACGCTCGATGCA-3’ Mồi xuôi (DxsF): 5’-TAAGGATCCACGCATAGAACAGGCCAAAC-3’; Mồi ngược (DxsR): 5’-ATTGTCGACTCAGCCGGCGAAACCGACGC-3’; Cặp mồi 16 S sử dụng giải trình tự: Mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’; Mồi ngược 1492R: 5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’ Các plasmid sử dụng nghiên cứu: pJet1.2/Blunt (Thermo Scientific, Mỹ), pCAMBIA1301 (Viện Công nghệ Sinh học, VAST.) 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp phân lập tuyển chọn chủng A tumefaciens sinh tổng hợp CoQ10 theo Islam (2010) - Nuôi cấy chìm chủng A tumefaciens DPXS12 sinh tổng hợp Coenzyme Q10 - Tách chiết DNA tổng số, DNA plasmid từ vi khuẩn, khuếch đại gen dps, dxs, 16S kỹ thuật sốc nhiệt, biến nạp DNA plasmid vào E Coli sốc nhiệt, theo Sambrook Russel (2001) - Phương pháp biến nạp plasmid vào A tumefaciens phương pháp xung điện - Phương pháp tách chiết CoQ10 từ A tumefaciens theo Ranadive (2011) - Xác định hàm lượng CoQ10 phương pháp Craven - Phương pháp phân tích Coenzyme Q10 HPLC - Phương pháp tạo phức β-cyclodextrin - CoQ10 theo Fir cộng (2009) - Phương pháp xác định hoạt tính sinh học CoQ10 theo Fir (2009), Hisa cộng (2014) - Phương pháp điều chế viên nang cứng chứa CoQ10 - Phương pháp tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp CoQ10 quy hoạch bậc hai theo Box – Behnken - Phương pháp tin sinh học CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN A TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 Kết từ 13 mẫu nốt sần khác thu thập từ vùng trồng hoa hồng Mê Linh Tây Tựu - Hà Nội phân lập được12 chủng vi khuẩn môi trường chọn lọc MacConkey, bao gồm chủng từ nốt sần hoa hồng phường Tây Tựu, chủng từ nốt sần hoa hồng huyện Mê Linh Để chứng minh vi khuẩn phân lập A tumefaciens, chủng phân lập tiến hành sàng lọc dựa theo số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa sinh học phân tử Kết từ 12 chủng phân lập sàng lọc chủng A tumefaciens Từ chủng phân lập chủng chuẩn A tumefaciens tiến hành tuyển chọn thông qua khả sinh tổng hợp CoQ10 Kết cho thấy, chủng vi khuẩn TT4 có khả sinh tổng hợp CoQ10 cao (13 mg/l) sau 96 nuôi cấy so với chủng khác Từ kết phân tích hình thái, sinh lý, sinh hóa sinh học phân tử chủng vi khuẩn phân lập TT4 định danh A tumfaciens TT4 Chủng sử dụng cho nghiên cứu tăng cường sinh tổng hợp CoQ10 3.2 NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 3.2.1 Tách dòng gen dps dxs từ A tumefaciens TT4 DNA tổng số tách chiết từ chủng A tumefaciens TT4 dùng làm khuôn để khuếch đại hai đoạn gen dps dxs mã hóa hai enzyme chìa khóa đường tổng hợp CoQ10 decaprenyl diphosphate synthase 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate A synthase B dps M dxs Kb Kb - 3,0 - 2,0 1077 bp  - 1,2 M 2100 bp  - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5 - 0,2 - 0,5 Hình 3.1 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) dxs (B) từ DNA tổng số A tumefaciens TT4 M, thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scientific, Mỹ) Kết phổ điện di sản phẩm PCR cho thấy xuất băng DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.1A) băng kích thước khoảng 2,1 kb (hình 3.1B) sử dụng cặp mồi DpsF/R DxsF/R tương ứng Kích thước sản phẩm PCR thu hoàn toàn phù hợp với kích thước hai đoạn gen đích cần khuếch đại Từ kết cho thấy hai đoạn gen dps dxs khuếch đại từ khuôn DNA tổng số chủng A tumefaciens TT4 kỹ thuật PCR Sản phẩm PCR hai gen dps dxs xử lý enzyme Klenow gắn vào vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo Scienctific, USA) Sản phẩm nối ghép biến nạp vào E coli DH10b để chọn dòng mang vector tái tổ hợp Kết biến nạp cho thấy xuất 10 khuẩn lạc môi trường LB thạch chứa ampicilin (100 µg/ml) tương ứng với hai gen dps dxs Plasmid tách chiết từ khuẩn lạc sử dụng cho sàng lọc sơ để chọn dòng tương ứng với gen để nghiên cứu Trước tiên, plasmid sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen dps dxs tương ứng Kết cho thấy xuất băng sản phẩm PCR phổ diện di với kích thước phù hợp với kích thước gen dps (hình 3.2A) dxs (hình 3.2B) Kích thước sản phẩm PCR từ khuôn DNA plasmid tương đương với kích thước sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số chủng A tumefaciens TT4 ban đầu (hình 3.2) Kết nhận chứng tỏ hai dòng lựa chọn mang gen đích tương ứng dps dxs Tuy nhiên, để chắn DNA plasmid hai dòng tiếp tục xử lý bẳng enzyme hạn chế thích hợp A C3 TT4 M B Kb C6 TT4 M Kb - 3,0 - 2,0 1077 bp  - 1,2 2100 bp  - 0,5 - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,2 - 0,5 - 0,2 Hình 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) dxs (B) từ DNA plasmid dòng tái tổ hợp C3, C6 khuôn DNA plasmid tách chiết từ clone số số TT4 khuôn DNA tổng số tách chiết từ chủng A tumefaciens TT4 Đường chạy M thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) Theo thiết kế hai trình tự cắt enzyme hạn chế SacI BamHI đưa vào đầu 5’ cặp mồi DpsF/R tương tự trình tự cắt BamHI SalI đưa vào cặp mồi DxsF/R Kết xử lý enzyme cắt hạn chế cho thấy hai clone văng băng DNA có kích thước tương ứng với kích thước gen dps khoảng 1077 bp (hình 3.3A) gen dxs khoảng 2100 bp (hình 3.3B) Từ kết thu khẳng định hai dòng số dòng tái tổ hợp mang hai gen đích tương ứng dps dxs A M B Kb Kb - 3,0 - 2,0  1077 bp  M  2100 bp  - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 1,2 - 0,5 - 0,5 - 0,2 - 0,2 Hình 3.3 Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid enzyme hạn chế dòng số mang gen dps (A) dòng mang gen dxs (B) Đường chạy 1, DNA plasmid chưa cắt; đường chạy 2, DNA plamid cắt cặp enzyme SacI/BamHI BamHI/SalI tương ứng với clone Đường chạy M thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) Để kiểm tra trình tự khung đọc hai gen đích dps dxs tách dòng hai plasmid tái tổ hợp sử dụng làm khuôn cho phản ứng xác định trình tự Trình tự nuclecotide axit amin suy diễn gen dps dxs xác định Kết cho thấy gen tách dòng chứa khung đọc mở cho phép dịch mã tổng hợp protein nguyên vẹn 3.2.2 Tạo cấu trúc biểu mang gen dps dxs Trong nghiên cứu vector pCAMBIA1301 với kích thước 11837 bp sử dụng làm vector biểu phù hợp chủng chủ A tumefaciens Hai gen dps dxs đưa độc lập đồng thời vào vector pCAMBIA1301 để tạo cấu trúc biểu pCAM-dps, pCAM-dxs pCAM-dps-dxs 3.2.2.1 Tạo cấu trúc biểu mang gen dps dxs độc lập Hai gen dps dxs cắt khỏi vector tách dòng hai cặp enzyme cắt hạn chế tương ứng SacI/BamHI BamHI/SalI Hai gen dps dxs thu được gắn vào vector biểu pCAMBIA1301 mở vòng cặp enzyme cắt hạn chế tương ứng Sản phẩm nối ghép biến nạp vào E coli DH10b để chọn dòng Kết biến nạp cho thấy xuất 11 khuẩn lạc tương ứng với gen dps dxs môi trường LB thạch chứa kanamycin (100 µg/ml) DNA plasmid từ dòng sử dụng để sàng lọc sơ cho nghiên cứu Đối với gen dps, dòng lựa chọn để kiểm tra có mặt gen đích phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.4A) xử lý cặp enzyme cắt hạn chế SacI/BamHI (hình 3.4B) Kết cho thấy dòng xuất băng DNA khoảng 1,1 kb tương ứng với kích thước gen dps (1077bp) (hình 3.4B) ĐC M + - Kb Kb - 3,0 - 2,0 - 3,0 - 2,0 - 1,2 1077 bp  M - 1,2 - 0,5 - 0,5 - 0,2 - 0,2 B A Hình 3.4 Phổ điện di sản phẩm PCR (A) cắt enzyme hạn chế (B) dòng lựa chọn gen dps Đường chạy 1-8 tương ứng với dòng lựa chọn ĐC sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen Đường chạy (+) sản phẩm PCR từ khuôn gốc Đường chay (-) sản phẩm cắt plasmid đối chứng M thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) A 2100 bp  ĐC M Kb - 3,0 - 2,0 M Kb B - 3,0 - 2,0 2100 bp  - 1,2 - 1,2 - 0,5 - 0,5 Hình 3.5 Phổ điện di sản phẩm PCR (A) cắt enzyme hạn chế (B) dòng lựa chọn gen dxs Đường chạy 1-2 tương ứng với dòng lựa chọn ĐC sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen M thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) Tương tự gen dxs, dòng lựa chọn để kiểm tra có mặt gen đích phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.5A) xử lý cặp enzyme BamHI/SalI (hình 3.5B) Kết cho thấy dòng xuất băng DNA khoảng 2,1 kb tương ứng với kích thước đọan gen đích dxs (2103 bp) (hình 3.5B) Các kết thu cho thấy gen dps dxs tách dòng thành công vector biểu pCAMBIA1301 Các cấu trúc tái tổ hợp ký hiệu pCAM-dps pCAM-dxs tương ứng 3.2.2.2 Tạo cấu trúc biểu mang đồng thời hai gen dps dxs Để tạo cấu trúc biểu tái tổ hợp chứa đồng thời hai gen dps dxs, gen dps thu từ vector tách dòng sau xử lý cặp enzyme cắt hạn chế SacI BamHI nối vào vector pCAM-dxs mở vòng SacI/BamHI Sản phẩm nối ghép biến nạp vào E coli DH10b kết thu 10 khuẩn lạc Kết PCR từ khuôn plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R cho thấy 10 khuẩn lạc cho sản phẩm có kích thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) (hình 3.6A) Đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs không thấy xuất sản phẩm, điều chứng tỏ plasmid từ 10 dòng thu mang gen dps Dòng số lựa chọn để kiểm tra plasmid việc cắt với SacI/BamHI, kết cho thấy xuất băng DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.6B) Từ kết khẳng định gắn gen dps vào vector tái tổ hợp pCAM-dxs để tạo cấu trúc tái tổ hợp chứa đồng thời hai gen dps dxs, ký hiệu pCAM-dps-dxs 10 ĐC M1 RE/9 Kb A B - 3,0 - 2,0 - 1,2 1077 bp  - 0,5 1077 bp  M2 Kb - 3,0 - 2,0 - 1,0 - 0,5 Hình 3.6 Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid 10 dòng sử dụng cặp mồi DpsF/R (A) sản phẩm cắt enzyme hạn chế (B) Đường chạy 1-10, sản phẩm PCR từ khuôn plasmid 10 dòng tương ứng; mẫu đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs (ĐC); RE/9, dòng số xử lý SacI/BamHI thang DNA chuẩn 100 bp (M1) 1kb (M2) 3.2.2.3 Tạo chủng A tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs Các cấu trúc tái tổ hợp pCAM-dps, pCAM-dxs, pCAM-dps-dxs biến nạp vào tế bào A tumefaciens EHA 105 khả biến phương pháp xung điện Các dòng tái tổ hợp chọn lọc môi trường chứa kanamycin (100µg/ml) Tiến hành xác định khả sinh tổng hợp CoQ10 chủng tái tổ hợp pCAM-dps, pCAMdxs, pCAM-dps-dxs, chủng đối chứng pCAM (hình 3.7) Kết cho thấy chủng tái tổ hợp chứa đơn gen pCAM-dps pCAM-dxs có khả sinh tổng hợp CoQ10 tăng lên 1,34 1,38 lần so với đối chứng Khi kết hợp hai gen dps dxs tạo chủng pCAM-dps-dxs làm tăng khả tổng hợp CoQ10 A tumefaciens lên 1,80 lần so với đối chứng Do dòng A tumefaciens mang cấu trúc pCAM-dpsdxs lựa chọn cho nghiên cứu CoQ10 (mg/l) 20 15 10 pCAM pCAM-dps pCAM-dxs pCAM-dps-dxs Hình 3.7 Khả sinh tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens tái tổ hợp Chủng tái tổ hợp chứa vector tái tổ hợp mang đơn gen pCAM-pds pCAM-dxs đồng thời hai gen pCAMdps-dxs Chủng đối chứng mang vector pCAMBIA1301 Kết khảo sát khả sinh tổng hợp CoQ10 28 dòng A tumefaciens pCAM-dps-dxs tái tổ hợp cho thấy khả sinh tổng hợp CoQ10 khác (hình 3.8) Trong số 28 dòng có dòng số 12 có khả tổng hợp CoQ10 cao so với dòng khác (19 mg/l) gấp 2,16 lần so với chủng gốc mang vector pCAM, dòng số 12 lựa chọn cho nghiên cứu 20.0 18.0 CoQ10 (mg/L) 16.0 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 10 11 12 14 15 20 pCAM Các dòng tái tổ hợp Hình 3.8 Khả sinh tổng hợp CoQ10 dòng A tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs Dòng số 12 kiểm tra cấu trúc pCAM-dps-dxs cách tiến hành tách plasmid, thực phản ứng PCR xử lý enzyme hạn chế Kết PCR từ khuôn plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R DxsF/R cho thấy cho sản phẩm có kích thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) dxs (2103bp) (hình 3.9B, 3.9A) Để kiểm tra plasmid việc cắt với SacI/BamHI, kết cho thấy xuất băng DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.9C) Từ kết khẳng định vector tái tổ hợp pCAM-dps-dxs đưa vào thành công A tumefaciens Dòng số 12 ký hiệu A tumefaciens DPXS12 M 3,0 2,0 - Kb M M 2100bp - Kb - 3,0 - 2,0 3,0 1077 bp  2,0 - - 1,0 1077 bp 1,0 0,5 - - 0,5 A B C Hình 3.9 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A, giếng 1) dxs (B, giếng 2), sản phẩm cắt enzyme hạn chế SacI/BamHI (C, giếng 3) từ DNA plasmid A tumefaciens DPSX12 M, thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo Scientific) 3.3 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP COQ10 TỪ A TUMEFACIENS TÁI TỔ HỢP 3.3.1 Ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng đến khả sinh tổng hợp CoQ10 Khi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens môi trường với loại đường khác Kết thể hình 3.10A 3.10B cho thấy, môi trường có chứa nguồn cacbon sucrose cho sinh tổng hợp CoQ10 cao (16 mg/l) nồng độ đường sucrose 5% cho sinh tổng hợp CoQ10 cao Cũng tương tự tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ tới khả sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens Kết thể hình 3.10C 3.10D cho thấy, môi trường có chứa nguồn nitơ cao ngô (CSL) cho sinh tổng hợp CoQ10 cao (26,68 mg/L) nồng độ cao ngô 1% cho sinh tổng hợp CoQ10 cao 10 A CoQ10 (mg/L) CoQ10 (mg/L) 18 16 14 12 10 20 18 16 14 12 10 B 0.0% C 7.5% 10% D 60 25 50 CoQ10 (mg/L) CoQ10 (mg/L) 5.0% Nồng độ sucrose (w/v) Nguồn cacbon (đƣờng) 30 2.5% 20 15 10 40 30 20 10 0 0.5% Nguồn nitơ 1% 2% 3% 4% 5% Nồng độ CSL (w/v) Hình 3.10 Ảnh hưởng nguồn cacbon (A), nồng độ sucrose (B), nguồn nitơ (C), nồng độ CSL(D) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 3.3.2 Ảnh hƣởng pH đầu môi trƣờng Kết hình 3.11A cho thấy, với pH đầu 8,0 hàm lượng CoQ10 thu cao đạt 68,8 mg/L, pH đầu 8,0 lựa chọn cho nghiên cứu 3.3.3 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống Kết hình 3.11B cho thấy, hàm lượng CoQ10 thu cao đạt OD = 0,8 đạt 108 mg/l cao gấp 1,6 lần so với OD = 0,05 Vì tỷ lệ cấp giống với OD = 0,8 lựa chọn cho nghiên cứu 3.3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy Kết hình 3.11C cho thấy, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CoQ10 A tumefaciens DPXS12 28oC Vì cứu nhiệt độ 28oC lựa chọn cho nghiên cứu 3.3.5 Ảnh hƣởng thời gian Từ kết hình 3.11D cho thấy, thời gian lên men tăng hàm lượng CoQ10 sinh tổng hợp tăng Tuy nhiên hàm lượng CoQ10 thu từ 96 đến 144 tăng không đáng kể, sau 144 hàm lượng CoQ10 tăng 1,03% 11 (tăng 2,57 mg/L) so với 96 lên men Từ kết thu thời gian 96 lựa chọn để thu nhận CoQ10 trình lên men 80 A 60 50 40 30 20 100 80 60 40 20 10 0 6.0 140 6.5 7.0 pH 7.5 8.0 0.05 0.1 B CoQ10 (mg/l) 120 100 CoQ10 (mg/L) C 120 CoQ10 (mg/L) CoQ10 (mg/L) 70 80 60 40 20 20 25 28 30 Nhiệt độ (độ C) 140 120 100 80 60 40 20 0.2 0.8 1.2 1.6 2.0 D 37 0.4 OD giống 24 48 72 96 120 144 Thời gian (giờ) Hình 3.11 Ảnh hưởng pH đầu môi trường (A), OD giống (B), nhiệt độ nuôi cấy (C), thời gian (D) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 3.4 TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COQ10 TỪ A TUMEFACIENS 3.4.3 Tối ƣu hóa trình sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp Dựa sở khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp, tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời nồng độ đường sucrose (X1), nồng độ cao ngô (X2), nhiệt độ (X3) Kết thể bảng 3.3 Phương trình hồi quy biểu diễn hàm lượng CoQ10 mô tả ảnh hưởng yếu tố độc lập mối tương tác chúng biểu diễn sau: Hàm lượng CoQ10= - 634,73 + 36,11.X1 + 32,92.X2 + 344,62.X3 + 4,2.X1X2 0,32.X1X3 + 3,66.X2X3 – 2,78.X12 – 75,27.X22 – 81,98.X32 12 Bảng 3.1 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố hàm lượng CoQ10 thu TN 10 11 12 13 14 15 16 17 Nồng độ sucrose (%) 2,5 2,5 7,5 7,5 5,0 5,0 5,0 5,0 2,5 7,5 2,5 7,5 5,0 5,0 5,0 5.0 5.0 Nồng độ cao ngô (%) 0,5 1,5 0,5 1,5 0,5 1,5 0,5 1,5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1.0 1.0 Nhiệt độ (oC) 28 28 28 28 24 24 32 32 24 24 32 32 28 28 28 28 28 Hàm lượng CoQ10 (mg/l) 82,885 78,048 90,872 107,285 93,571 85,433 93,571 109,518 78,912 101,791 95,831 105,901 127,177 124,478 126,506 126,58 125,35 Từ kết dựa vào phương pháp tối ưu hóa tìm điều kiện lên men tối ưu nhất: nồng độ sucrose %, nồng độ bột cao ngô % nhiệt độ 28oC Khi đó, hàm lượng CoQ10 đạt 127,18 mg/l 3.5 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT COENZYME Q10 TỪ CHỦNG A TUMEFACIENS TÁI TỔ HỢP 3.5.1 Đánh giá phƣơng pháp phá vỡ tế bào Hiệu phá vỡ tế bào ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tách chiết CoQ10 Trong nghiên cứu màng tế bào A tumefaciens phá vỡ bốn phương pháp khác bao gồm siêu âm, xử lý axit HCl theo mô tả Tian, xử lý ethanol theo mô tả Ranadive xử lý enzyme theo mô tả Zahiria kết hợp với bước tách chiết Kết biểu diễn hình 3.12 Kết cho thấy phương pháp xử lý tế bào ethanol cho hiệu thu nhận CoQ10 cao so với phương pháp khác sử dụng Tương tự vi khuẩn Gram âm khác, A tumefaciens có chứa lớp màng màng mỏng tác động ethanol làm tương tác kỵ nước màng bị yếu dẫn đến cấu trúc màng tế bào bị phá vỡ giải phóng thành phần nằm màng màng môi trường Vì vậy, phương pháp xử lý tế bào ethanol lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu tối ưu sử dụng nghiên cứu 13 0.60 COQ10 (mg/g) 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 Siêu âm HCl EtOH Enzyme Phƣơng pháp xử lý tế bào Hình 3.12.Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào 3.5.2 Xác định điều kiện xử lý tế bào ethanol 3.5.2.1 Xác định tỷ lệ ethanol/sinh khối Kết cho thấy hàm lượng CoQ10 chiết xuất tăng lên tỷ lệ ethanol/sinh khối tăng (hình 3.13A) Khi so sánh hàm lượng CoQ10 thu với tỷ lệ chiết khác cho thấy tỷ lệ 10:1 cao 1,32 lần (tương đương 24,3%) so với tỷ lệ 5:1, hàm lượng CoQ10 thu tỷ lệ 15:1 cao so với tỷ lệ 10:1 1,08 lần Từ kết thu tỷ lệ ethanol/sinh khối (10 ml/g) sử dụng để tách chiết CoQ10 nghiên cứu 3.5.2.2 Xác định thời gian đồng hóa Kết hình 3.13B cho thấy hàm lượng CoQ10 thu tăng lên thời gian đồng hóa tăng đạt cao thời gian phút Tuy nhiên thời gian đồng hóa tăng tiếp hiệu thu hồi CoQ10 lại giảm Sự giảm tác động sóng siêu âm thời gian dài làm phá hủy cấu trúc CoQ10 3.5.2.3 Xác định nhiệt độ xử lý Kết hình 3.13C cho thấy nhiệt độ ủ tăng lên hàm lượng CoQ10 thu tăng (1,15 1,17 lần 37 oC 60oC tương ứng so với điều kiện 25oC Từ kết nhận được, thấy nhiệt độ 37oC phù hợp để thực xử lý tế bào ethanol Từ kết thu nghiên cứu này, quy trình tách chiết CoQ10 từ sinh khối A tumefaciens xác lập mô tả tóm tắt sau: trộn sinh khối vi khuẩn với ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa siêu âm phút, ủ nhiệt độ 37oC giờ, ly tâm loại bỏ xác tế bào, chiết với hexane theo tỷ lệ 1:1, cô đặc chân không 45oC 14 5:1 10:1 15:1 Tỷ lệ ethanol/sinh khối (ml/g) 1 0.8 0.8 CoQ10 (mg/g) CoQ10 (mg/g) CoQ10 (mg/g) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.6 0.4 0.2 0.6 0.4 0.2 0 10 Thời gian (phút) 15 25 37 60 Nhiệt độ (oC) C A B Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ ethanol/sinh khối (A), thời gian đồng hóa (B), nhiệt độ xử lý (C) đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A tumefaciens tái tổ hợp 3.5.3 Nghiên cứu tinh Coenzyme Q10 3.5.3.1 Đánh giá so sánh độ dịch chiết Coenzyme Q10 CoQ10 thu theo quy trình phân tích định lượng hệ thống HPLC với điều kiện sắc ký sau: Pha động A: Metanol 100% Pha động B: Ethanol 100% Cột C18 kích thước 250 mm x mm nhồi hạt với kích thước 5μm Nhiệt độ cột 35oC, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl, detector UV – Vis bước sóng 275 nm Kết thể hình 3.14A, 3.14B A B Hình 3.14 Phổ sắc ký HPLC CoQ10 chuẩn (A) dịch chiết từ A tumefaciens tái tổ hợp (B) Kết cho thấy với bước sóng hấp thụ cực đại CoQ10 (275 nm), thấy xuất số đỉnh phụ nhỏ so với đỉnh CoQ10 phổ sắc ký HPLC So sánh với phổ CoQ10 chuẩn hãng Sigma thấy dịch chiết CoQ10 tương đối so sánh bước sóng 275 nm Tuy nhiên, dịch chiết có chứa hợp chất khác không hấp thụ cực đại bước sóng 275 nm Do để đánh giá độ sạch, dịch chiết phân tích phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm so sánh với CoQ10 chuẩn Kết cho thấy phổ hấp phụ dịch chiết CoQ10 CoQ10 chuẩn xuất đỉnh hấp thụ cực đại bước sóng 275 nm, đỉnh CoQ10 Khi so sánh phổ hấp thụ so với dịch CoQ10 chuẩn thấy hoàn toàn tương tự Tuy nhiên, đỉnh (bước sóng 247 – 309) cường độ hấp 15 thụ dịch chiết CoQ10 cao so với CoQ10 chuẩn (hình 3.15), điều chứng tỏ dịch chiết lẫn tạp chất Phân tích tổng thể phổ hấp thụ (ngoại trừ đỉnh CoQ10) cho thấy cường độ hấp thụ mẫu CoQ10 tách chiết cao 2,59 lần so với CoQ10 chuẩn 3.0 L1 Cường độ hấp thụ 2.5 S 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 Bước sóng (nm) Hình 3.15 So sánh độ dịch chiết CoQ10 CoQ10 chuẩn (L1) dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn, (S) dịch CoQ10 chuẩn 3.5.3.2 Nghiên cứu tinh Coenzyme Q10 theo phương pháp chiết dung môi Trong nghiên cứu này, hệ dung môi để chiết tinh CoQ10 ethanol:hexane theo tỷ lệ 1:1 thể tích Dịch chiết CoQ10 với lần chiết khác nhau: 1, 2, phân tích phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm Kết so sánh phổ hấp thụ dịch chiết thu tương ứng với số lần chiết cho thấy cường độ phổ hấp thụ dịch chiết với lần chiết thấp khoảng 3,25 lần so với lần chiết 1,62 lần so với lần chiết (hình 3.16A) Điều chứng tỏ dịch chiết CoQ10 với lần chiết so với lần chiết Cường độ hấp thụ 2.5 2.0 L1 L2 3.0 L3 A 1.5 1.0 0.5 2.5 Cường độ hấp thụ 3.0 0.0 2.0 L1 L3 S B 1.5 1.0 0.5 0.0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 Bước sóng (nm) Bước sóng (nm) Hình 3.16 Phổ hấp thụ dịch chiết CoQ10 theo số lần chiết khác (A) So sánh độ dịch tinh CoQ10 CoQ10 chuẩn L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau lần chiết, L3, dịch chiết CoQ10 sau lần chiết, S dịch CoQ10 chuẩn (B) 16 Tiến hành phân tích phổ hấp thụ dịch tinh so sánh với phổ hấp thụ CoQ10 chuẩn Kết phổ hấp thụ bước sóng 309 – 800 nm dịch chiết sau lần chiết có giảm rõ rệt gần tương đương cường độ hấp thụ dịch CoQ10 chuẩn Trong giải bước sóng 309 – 800 nm, cường độ hấp thụ giảm từ 5,46 lần (đối với dịch chiết lần chiết) xuống 1,93 lần (đối với dịch chiết lần chiết) so với dịch CoQ10 chuẩn Phân tích tổng thể, cường độ hấp thụ giảm từ 2,59 xuống 1,91 dịch chiết lần chiết lần so với CoQ10 chuẩn Từ kết thu cho thấy phương pháp chiết lần chiết thu dịch chiết CoQ10 đặc biệt loại bỏ tạp chất hấp thụ bước sóng từ 309 – 800 nm Phương pháp tương đối đơn giản sử dụng hệ dung môi rẻ không độc hại nên áp dụng quy mô lớn để tách chiết tinh CoQ10 3.5.3.3 Nghiên cứu tinh Coenzyme Q10 theo phương pháp sắc ký lọc gel qua cột silica Trong nghiên cứu này, dịch chiết CoQ10 sau lần chiết tiếp tục tinh sử dụng sắc ký cột silica gel Kết cho thấy cường độ phổ hấp thụ dịch CoQ10 sau tinh sắc ký cột silica giảm hai vùng bước sóng 200-248 nm 309-800 nm Cường độ hấp thụ dải bước sóng 200-248 nm giảm khoảng 13% sau tinh sạch; cường độ hấp thụ dải bước sóng 109 – 800nm giảm 58% Phân tích tổng thể cho thấy cường độ hấp thụ giảm khoảng 24 % mẫu tinh silica gel (hình 3.17) 3.0 L3 S E Cường độ hấp thụ 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 Bước sóng (nm) Hình 3.17 So sánh độ dịch tinh CoQ10 CoQ10 chuẩn L3, dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau lần chiết; E1, dịch CoQ10 sau tinh sắc ký cột silica gel; S, dịch CoQ10 chuẩn 17 Khi so sánh với CoQ10 chuẩn, cường độ hấp thụ dịch tinh cao 1,46 lần thấp nhiều so với dịch CoQ10 chiết lần (2,59) dịch chiết lần chiết (1,91) 3.5.4 Quy trình thu nhận Coenzyme Q10 từ A tumefaciens tái tổ hợp Dựa vào kết nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy, phương pháp tách chiết CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp luận án xây dựng quy trình thu nhận CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp hình 3.18 A tumefaciens tái tổ hợp Lên men (28 C, pH đầu 8, cấp giống OD giống 0.8, thời gian 96 o Ly tâm thu sinh khối Ethanol 100% Phá vỡ tế bào Trộn sinh khối với ethanol tỷ lệ 10:1 ml/g, đồng hóa phút, ủ 37o n –hexan tỷ lệ 1:1 Ly tâm thu dịch Tách chiết n-hexane tỷ lệ 1:1 (v/v) Cô đặc chân không, áp suất 260 mbar, nhiệt độ 45oC Tinh Chiết ethanol:hexane, cô đặc, tinh cột silica Cô đặc chân không, áp suất 260 mbar, nhiệt độ 45oC Chế phẩmCoQ10 Hình 3.18 Quy trình thu nhận CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 18 3.6 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH HÓA LÝ CỦA COENZYME Q10 Nghiên cứu đặc tính cho thấy CoQ10 CoQ10 bền nhiệt – 60oC, bền vùng pH – 9, bị phá hủy ánh sáng mặt trời ánh sáng huỳnh quang (hình 3.39, 3.40, 3.41) 120 120 100 Độ bền tương đối (%) Độ bền tương đối (%) 100 80 A 60 40 20 4oC 25oC 37oC 24h 48h 72h 96h 120h B 60 40 20 60oC 0h 80 pH pH pH pH pH 144h 0h 24h Thời gian (giờ) 48h 72h 96h 120h Thời gian (giờ) Độ bền tương đối (%) 120 100 80 C 60 40 20 Che tối Chiếu sáng Leon Chiếu sáng mặt trời 0h 24h 48h 72h 96h 120h 144h Thời gian (giờ) Hình 3.19 Ảnh hưởng nhiệt độ(A), pH (B), ánh sáng (C) đến độ bền CoQ10 tách chiết từ tế bào A tumefaciens tái tổ hợp 3.7 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA COENZYME Q10 3.7.1 Hoạt tính chống oxy hóa CoQ10 Hoạt tính chống oxy hóa CoQ10 xác định thông qua việc làm giảm màu thuốc thử DPPH, xác định phép đo độ hấp thụ bước sóng 517 nm máy quang phổ Kết cho thấy hoạt tính chống oxi hóa Coenzyme Q10 tăng nồng độ Coenzyme Q10 tăng dần Dựa kết tính toán, nồng độ 0,18 mM Coenzyme Q10 có khả làm giảm 50% gốc tự 0,5 mM DPPH (EC50 = 0,18 mM) 3.7.2 Khả ức chế tế bào ung thƣ CoQ10 Ảnh hưởng CoQ10 đến tế bào ung thư đánh giá thông qua tỷ lệ tế bào sống sau xử lý với CoQ10 Kết hình 3.20 cho thấy CoQ10 ảnh hưởng đến sinh trưởng hai dòng tế bào ung thư nồng độ 20 µM sau 72 xử lý Tuy nhiên nồng độ cao 40 80 µM, CoQ10 có ảnh hưởng rõ rệt 19 lên hai dòng tế bào ung thư Đối với tế bào Hep-2C, tỷ lệ tế bào sống sau 48 72 xử lý nồng độ 40 µM 35,1 27,1%; nồng độ 80 µM 29,4 14,7% tương ứng Đối với dòng tế bào FL, tỷ lệ tế bào sống sau 48 72 xử lý nồng độ 40 µM 50,8 26,1% tương ứng; 100% tế bào bị chết nồng độ 80 µM sau 48 xử lý Kết nghiên cứu dòng tế bào thận thỏ bình thường RK13 cho thấy tế bào sinh trưởng hoàn toàn bình thường nồng độ khảo sát Số lượng tế bào/ giếng A 700000 Con trol uM 10 u M 20 u M 40 u M 80 u M 600000 500000 20 µM µM 80 µM 400000 300000 200000 100000 0h 24h 48h Thời gian (giờ) Số lượng tế bào/ giếng B 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 Control µM 0h C Số lượng tế bào/ giếng 300000 Con trol uM 10 uM 20 µM 20 uM 72h 40 uM 80 µM 24h 48h Thời gian (giờ) uM 80 uM 10 u M 20 u M 72h 40 u M 80 u M 250000 µM 20 µM 0h 24h 48h Thời gian (giờ) 80 µM 200000 150000 100000 50000 72h Hình 3.20 Ảnh hưởng CoQ10 lên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C (A), FL (B) tế bào thận thỏ bình thường RK13 (C) Một số hình ảnh tế bào đại diện nồng độ 0, 20 80 µM CoQ10 20 3.8 ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DƢỚI DẠNG VIÊN NANG 3.8.1 Nghiên cứu tạo phức hợp Coenzyme Q10 với β-Cyclodextrin Cyclodextrin chất có bề mặt ưa nước phía phần kỵ nước nằm bên trong, hình thành phức với hợp chất ưa béo làm tăng độ hòa tan nước, độ bền, hoạt tính sinh học chúng Dạng hòa tan nước CoQ10 tăng khả hấp thu vào tế bào đồng thời tăng cường trình hô hấp ty thể Vì vậy, CoQ10 tạo phức với β-cyclodextrin với tỷ lệ mol khác (1:1, 1:3, 1:5, 1:10) Để lựa chọn tỷ lệ mol CoQ10: β-CD thích hợp tiến hành đánh giá tỷ lệ thu hồi CoQ10 từ công thức thông qua hàm lượng CoQ10 trước sau sấy phun Kết cho thấy tỷ lệ CoQ10: β-CD 1:5 1:3 cho khả thu hồi CoQ10 cao đáng kể so với tỷ lệ khác Trong đó, tỷ lệ 1:5 khả thu hồi CoQ10 cao đạt 99% 3.8.2 Khảo sát số đặc tính phức CoQ10- β- Cyclodextrin 3.8.2.1 Khả hòa tan phức CoQ10- β- Cyclodextrin Kết nghiên cứu khả hòa tan nước phức β-CDQ10 cho thấy khả hòa tan tăng lên tỷ lệ tạo phức CoQ10 β-CD tăng Với tỷ lệ 1:1 1:3, dung dịch β-CDQ10 xuất kết tủa sau 60 phút, tỷ lệ 1:5 – 1:20 không thấy xuất lắng cặn Kết nghiên cứu khả hòa tan phức β-CDQ10 pH khác cho thấy mức độ hòa tan phụ thuộc vào pH tỷ lệ CoQ10: β-CD Ở pH thấp (pH ≤ 5), mức độ hòa tan so với pH Mức độ hòa tan tỷ lệ 1:1 1:3 tất pH khảo sát (pH 2-7) Tỷ lệ 1:5 có khả hòa tan tốt pH 6-7, giảm pH 2-5 120 120 100 100 CoQ10 lại (%) CoQ10 lại (%) 3.8.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ tới phức CoQ10- β- Cyclodextrin 80 60 40 20 4oC 25oC 37oC 60oC 80 60 40 Che tối Chiếu sáng Leon Chiếu sáng mặt trời 20 0 24 48 72 96 Thời gian (giờ) 120 144 A 24 48 72 96 Thời gian (giờ) B Hình 3.21 Ảnh hưởng nhiệt độ (A), ánh sáng (B) đến độ bền CoQ10 21 144 Kết hình 3.21A cho thấy hàm lượng CoQ10 không thay đổi sau 144 điều kiện nhiệt độ từ – 60oC Từ kết thu thấy phức CoQ10CD có tính bền nhiệt cao, điều có ý nghĩa cho trình tạo chế phẩm CoQ10, bảo quản ứng dụng CoQ10 sau 3.8.2.3 Ảnh hưởng ánh sáng tới phức CoQ10- β- Cyclodextrin Kết cho thấy bị chiếu sáng huỳnh quang hàm lượng CoQ10 giảm 45,4 % sau 144 chiếu sáng (hình 3.21B) Tuy nhiên mức độ giảm thấp khoảng lần so với CoQ10 tự Khi bị chiếu sáng ánh sáng mặt trời theo ngày đêm hàm lượng CoQ10 giảm đến 45% sau 96 Tương tự, tổn thất CoQ10 phức β-CDQ10 thấp CoQ10 trạng thái tự Như vậy, việc tạo phức với β-CD làm tăng đáng kể độ bền CoQ10 tác dụng ánh sáng 3.8.3 Xây dựng quy trình điều chế viên nang cứng chứa Coenzyme Q10 Dựa vào kết nghiên cứu tạo phức CoQ10 với β-cyclodextrin Quy trình công nghệ điều chế thực phẩm chức bổ sung dạng viên nang cứng chứa CoQ10 thể hình 3.22 CoQ10 β – cyclodextrin Tạo phức với β – cyclodextrin tỷ lệ 1:5 (mol/mol) Khuấy trộn 60 phút, nhiệt độ 60oC Sấy phun Nhiệt độ đầu vào 105oC, đầu 60oC Maltodextrin Phối trộn, đóng viên nang, bao gói Sản phẩm viên nang cứng CoQ10 Hình 3.22 Quy trình công nghệ sản xuất viên nang thực phẩm chức chứa CoQ10 22 3.8.4 Kiểm nghiệm viên nang chứa CoQ10 Các kết thu tiến hành kiểm nghiệm viên nang thực phẩm chức CoQ10 tiêu chí: độ đồng khối lượng, độ tan rã, độ ẩm, độ đồng hàm lượng đạt tiêu chuẩn yêu cầu viên nang theo dược điển Việt Nam IV Kiểm tra phân tích chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm: Viên nang thực phẩm chức chứa CoQ10 từ sinh khối A tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp Viện Dinh dưỡng phân tích tiêu an toàn thực phẩm Kết trình bày bảng 3.2 cho thấy sản phẩm đạt tiêu chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm Bảng 3.2 Kết phân tích viên nang thực phẩm chức CoQ10 TT Chỉ tiêu phân tích Tổng số vi khuẩn hiếu khí Coliforms E coli Đơn vị CFU/g CFU/g CFU/g Kết KPH KPH KPH S aureus CFU/g KPH 10 11 12 13 14 Shigella spp CFU/25g B cereus CFU/g Salmonella CFU/25g Tổng số bào tử nấm men, CFU/g mốc Aflatoxin G1 μg/kg Aflatoxin B1 μg/kg Aflatoxin G2 μg/kg Aflatoxin B2 μg/kg Chì μg/kg Thủy ngân μg/kg 15 Cadimi μg/kg KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 0,120 0,040 Phương pháp TCVN 4884:2005 TCVN 6848:2007 TCVN 79242:2008 TCVN 48301:2005 TCVN 7902:2008 TCVN 4992:2005 TCVN 4829:2005 TCVN 82752:2010 AOAC 990.33 AOAC 991.10 0,028 Thử nghiệm độc tính cấp viên nang thực phẩm chức Coenzyme Q10 chuột Cho chuột uống mẫu thử với mức liều từ – 20 viên/kg chuột Kết không nhận thấy biểu khác thường so với nhóm chứng, không nhận thấy có biểu ngộ độc chuột thí nghiệm thời gian theo dõi Tất chuột ăn uống, hoạt động tăng trọng bình thường Không xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) mẫu thử không gây chết chuột thử nghiệm mức liều tối đa cho uống 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Luận án thu kết sau: Từ 12 chủng vi khuẩn phân lập từ nốt sần hoa hồng huyện Tây Tựu – Hà Nội tuyển chọn chủng A tumefaciens TT4 có khả sinh tổng hợp CoQ10 cao cho nghiên cứu Đã tách dòng giải trình tự gen dxs dps mã hóa cho enzyme chìa khóa đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A tumefaciens TT4 phân lập VN tạo chủng A tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp mang gen cho suất sinh tổng hợp CoQ10 cao Xác định điều kiện thích hợp nuôi cấy chủng A tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10: sucrose %, CSL: 1%, nhiệt độ 28 oC, pH đầu 8, OD cấp giống 0.8, thời gian 96 giờ, hàm lượng CoQ10 thu đạt 127,18 mg/l Xây dựng quy trình tách chiết CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp: Ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa siêu âm phút, ủ nhiệt độ 37oC giờ, chiết hexane theo tỷ lệ 1:1, cô đặc chân không 45oC, tinh hệ dung môi ethanol:hexane cột silica Đã xác định số đặc tính hóa lý hoạt tính sinh học CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp CoQ10 bền nhiệt – 60oC, bền vùng pH – 9, không bền ánh sáng mặt trời ánh sáng huỳnh quang, có khả chống oxy hóa thông qua khử gốc tự DPPH (EC50 = 0,18 mM) Bước đầu chứng minh CoQ10 có khả ức chế hai dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep2C FL Đã tạo phức CoQ10 - β-cyclodextrin để hòa tan tốt nước ứng dụng chế tạo viên nang dạng thực phẩm chức Kiến nghị: Tiếp tục khảo sát số hoạt tính sinh học khả ứng dụng CoQ10 thực phẩm chức sữa tươi đồ uống có bổ sung CoQ10 24