Nghiên cứu thu nhận dịch đạm thủy phân từ thịt đỏ cá ngừ bằng Enzyme Protease vi sinh vật

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA  TRẦN VĂN KHIÊM NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT ĐỎ CÁC NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE VI SINH VẬT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Đà Nẵng – Năm 2018 Cơng trình hồn thành TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hoàng Minh Phản biện 1: TS Lê Lý Thùy Trâm Phản biện 2: PGS TS Trần Thị Xô Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ công nghệ sinh học họp Trường Đại học Bách khoa vào ngày 13 tháng 10 năm 2018 Có thể tìm hiểu luận văn tại:  Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng Trường Đại học Bách khoa  Thư viện Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cá ngừ (tuna) nguồn lợi hải sản có giá trị dinh dưỡng, giá trị sinh học giá trị kinh tế cao Theo Báo cáo xuất thủy sản Việt nam Quý II, năm 2011, Việt Nam xuất gần 31 nghìn cá ngừ, trị giá 148 triệu USD, tăng gần 16% khối lượng 36,5% giá trị so với kỳ năm ngối Hiện nay, có 87 doanh nghiệp tham gia xuất cá ngừ sang 73 thị trường giới Trong công nghiệp chế biến cá ngừ, thành phần khối lượng thịt cá ngừ chiếm khoảng 60%, phần lại phế phẩm đầu, xương, vây, thịt vụn… Phần thịt thu nhận sau trình chế biến bao gồm phần thịt trắng dùng để chế biến thành mặt hàng fillet, đồ hộp xơng khói, cịn phần thịt đỏ loại bỏ có chứa thành phần gây dị ứng Tùy theo loài, khối lượng phần thịt đỏ bị loại bỏ lên tới 6,4% [13] Ước tính lượng thịt đỏ cá ngừ Việt Nam khoảng 1.000 tấn/năm Quan trọng nữa, phần thịt đỏ có chứa hàm lượng protein tương đối cao (14%) Nếu lượng thịt đỏ không xử lý hết trước thải mơi trường ngồi gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới mơi trường [41] Do đó, để giải vấn đề nêu trên, nhiều nhà nghiên cứu quan tâm đến giải pháp sử dụng enzyme protease để biến đổi nguồn protein thịt đỏ cá ngừ thành axit amin Đây giải pháp không giải vấn đề ô nhiễm môi trường nêu trên, mà cịn góp phần tạo sản phẩm dinh dưỡng giá trị cao Hiện nay, giới Việt Nam có cơng trình nghiên cứu thịt đỏ cá ngừ, đặc biệt việc tìm cách sử dụng nguồn phế phẩm để phục vụ cho sống người Các nghiên cứu phát triển theo hướng sử dụng enzyme protease nội cá ngừ enzyme thương mại để thủy phân thịt đỏ cá ngừ nhằm thu hồi protein [10, 13, 20, 38, 43] Tuy nhiên, sử dụng enzyme nội khả thủy phân khơng cao, cịn với enzyme thương mại khơng hiệu mặt kinh tế Chính vậy, đề tài đặt mục tiêu nghiên cứu khả thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme protease tái tổ hợp nhằm tiết kiệm chi phí sản xuất nâng cao khả thủy phân thịt đỏ cá ngừ Mục đích nghiên cứu - Biểu gen nprC10 mã hóa protease từ Bacillus subtilis C10 chủng E coli M15 nhờ hệ thống vector pQE30 nhằm thu nhận enzyme protease tái tổ hợp - Xác định hoạt độ enzyme protease tái tổ hợp từ vi khuẩn Bacillus subtilis C10 chất thịt đỏ cá ngừ - Thu nhận dịch đạm thủy phân từ thịt đỏ cá ngừ enzyme protease tái tổ hợp Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu - Sản xuất chế phẩm enzyme protease npr C10 từ Bacillus subtilis C10 vi khuẩn E coli M15 tái tổ hợp - Khảo sát thông số thực phản ứng thủy phân thịt đỏ cá ngừ thu mua địa bàn Đà Nẵng enzyme protease tái tổ hợp - Nghiên cứu thực quy mơ phịng thí nghiệm Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp vi sinh - Nuôi cấy tế bào E coli M15 3 Phương pháp hóa sinh - Xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Anson cải tiến [12] - Xác định nồng độ protein sử dụng phương pháp Bradford (1976) [29] - Xác định hàm lượng nitơ tổng số protein thô theo phương pháp Kjeldahl [57] Phương pháp th ng v s i u - Phương pháp xử lý số liệu: Tất số liệu xử lý excel Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 5.1 Ý nghĩa hoa học Cung cấp quy trình sản xuất dịch đạm thủy phân thịt đỏ cá ngừ enzyme protease tái tổ hợp dựa thông số ảnh hưởng đến trình thủy phân khảo sát nghiên cứu (tỉ lệ enzyme/cơ chất, nhiệt độ phản ứng, thời gian phản ứng) 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Việc thực cơng trình nghiên cứu khoa học có số ý nghĩa thực tiễn sau: - Chủ động nguồn enzyme protease điều kiện phịng thí nghiệm cho việc thủy phân nguồn chất giàu protein khác - Tận dụng nguồn nguyên liệu phế phụ phẩm thịt đỏ cá ngừ giàu protein từ nhà máy chế biến thủy sản địa bàn thành phố Đà Nẵng để sản xuất dịch đạm thủy phân từ nghiên cứu phát triển mặt hàng bột dinh dưỡng, bột gia vị làm tăng giá trị cho nguyên liệu 4 - Thịt đỏ cá ngừ giàu protein thải môi trường điều kiện thích hợp cho vi sinh vật có hại phát triển Việc nghiên cứu chế biến thịt đỏ cá ngừ thành cơng góp phần ngăn ngừa nguy gây ô nhiễm môi trường Cấu trúc luận văn Luận văn gồm có chương mục sau: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan protease 1.1.1 Giới thi u chung Nhóm enzyme protease enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptit (CO-NH) phân tử protein polypeptide đến sản phẩm cuối axit amin Ngoài nhiều protease có khả liên kết este vận chuyển acid amin 1.1.2 Phân oại enzyme protease Theo Barett Donald (1956), protease chia thành hai nhóm lớn nhóm endopeptidase nhóm exopeptidase - Nhóm 1: Endopeptidase enzyme protease phân cắt liên kết peptide nằm mạch polypeptide Dựa vào động học chế xúc tác endopeptidase chia thành bốn phân nhóm: - Nhóm 2: Exopeptidase nhóm enzyme protease có khả thủy phân liên kết peptide chuỗi polypeptide, đầu amine đầu carboxyl, tách acid amin khỏi chuỗi polypeptide 1.1.3 Nguồn thu nhận protease Enzyme protein sinh vật tổng hợp tế bào chất tham gia xúc tác cho phản ứng sinh học Chính thế, sinh vật xem nguồn thu nhận để sản xuất enzyme Nhưng chủ yếu ba nguồn chính: động vật (có nhiều gan, dày bê ), thực vật (đu đủ, dứa ) vi sinh vật (vi khuẩn, nấm virus) 1.1.4 Thu nhận enzyme Enzyme thường chứa tế bào sinh vật gọi enzyme nội bào (intracellular enzyme), sinh vật tiết môi trường sống Đó enzyme ngoại bào (extracellular enzyme) Enzyme vi sinh vật thường chiết enzyme ngoại bào Để kết tủa protein cho mục đích tinh sạch, người ta thường dùng dung môi hữu ethanol hay aceton muối trung tính 1.1.5 Thủy phân protein enzyme protease Quá trình thủy phân trình phân cắt số liên kết nhị dương (dispositive bonds) hợp chất hữu thành thành phần đơn giản tác dụng chất xúc tác có tham gia yếu tố nước phản ứng [22] Dưới xúc tác enzyme protease, trình thủy phân protein diễn sau: Protein → polypeptide → peptone → peptide → acid amin a) Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein enzyme Quá trình thủy phân chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ chất enzyme, có mặt hay khơng có mặt chất hoạt hóa chất kìm hãm, lượng nước thêm vào 1.1.6 Ứng dụng protease 1.1.6.1 Trong công nghiệp thực phẩm 1.1.6.2 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa 1.1.6.3 Trong công nghiệp thuộc da 1.1.6.4 Trong y học 1.1.6.5 Trong xử lý ô nhiễm môi trường 1.1.6.6 Trong công nghiệp dệt 1.2 Tổng quan cá ngừ 1.2.1 Giới thi u cá ngừ Cá ngừ thuộc họ cá thu ngừ (Scombridae) có giá trị kinh tế quan trọng biển Việt Nam Cá ngừ phân bố khắp vùng biển Việt Nam, kích thước cá tương đối lớn (6 lồi có kích thước từ 20 70 cm, khối lượng từ 0,5 - kg [17] 1.2.2 Th nh phần hóa học cá ngừ Năm 2006, dự án cải thiện chất lượng xuất thủy sản Hiệp hội chế biến xuất thủy sản Việt Nam chủ trì cơng bố thành phần hóa học số lồi cá ngừ đại dương mô tả bảng 1.2 [4] Bảng 1.2 Thành phần hóa học số cá ngừ đại dương Nƣớc (%) Protein (%) Lipid (%) Tro (%) Loài Cá ngừ vây vàng 74,4 23,6 1,4 2,3 Cá ngừ mắt to 77,5 21 0,3 1,2 Cá ngừ vây Thịt đỏ 68,7 28,3 1,4 0,1 xanh Thịt trắng 52,6 24,3 21,4 1,3 Cá ngừ vây Thịt đỏ 56 23,6 9,3 1,4 63,9 23,1 11,6 0,3 xanh Phương Nam Thịt trắng Trong thịt đỏ cá ngừ có lượng lớn protein, nước chất béo Hàm lượng chất có thịt đỏ cá ngừ thể bảng 1.3 8 Bảng 1.3 Hàm lượng chất lượng 100 g thịt đỏ cá ngừ [50] Thành phần Hàm lƣợng Calorie (kcal/100g) 120.0 Độ ẩm (g/100g) 69.37 Protein (g/100g) 18.28 Chất béo (g/100g) 4.631 Carbohydrate (g/100g) 0.750 1.3 Tổng quan công nghệ DNA tái tổ hợp 1.3.1 Công ngh DNA tái tổ hợp Công nghệ DNA tái tổ hợp tập hợp kỹ thuật phân tử để định vị, phân lập, biến đổi nghiên cứu đoạn DNA Sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cho phép chủ động nguyên liệu cung cấp enzyme ban đầu; nâng cao hiệu suất sản xuất, chất lượng enzyme; dễ dàng công nghệ hóa q trình sản xuất nhờ làm giảm giá thành sản phẩm Để sản xuất enzyme tái tổ hợp, nhà nghiên cứu phải tạo dòng gen mã hóa cho enzyme quan tâm, thiết lập hệ thống biểu cải tiến hệ thống biểu để enzyme sản xuất nhiều theo chế điều hòa đơn giản [15] Hơn 60% loại enzyme sử dụng ngành công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm tinh bột sản phẩm tái tổ hợp [32] 9 1.3.2 H th ng biểu hi n E co i 1.3.2.1 Hệ thống vật chủ E coli Việc sản xuất protein tái tổ hợp thực nhiều hệ thống vật chủ biểu khác vi khuẩn, nấm men, nấm mốc tế bào động vật có vú, đó, hệ thống biểu sử dụng tế bào vi khuẩn E coli ưa chuộng Hiện có nhiều chủng E.coli tiêu chuẩn hóa cho q trình biểu protein tái tổ hợp có sẵn thị trường E coli BL21, E coli K12, E coli M15 1.3.2.2 Họ vector pQE Quá trình biểu protein ngoại lai tế bào E coli M15 sử dụng hệ vector pQE thực dựa hoạt động điều hịa promoter T5 Q trình biểu protein tái tổ hợp sử dụng hệ vector pQE cảm ứng IPTG IPTG gắn lên protein ức chế bất hoạt Một chất ức chế bị bất hoạt, enzyme RNA polymerase vật chủ biểu phiên mã trình tự đích Các đoạn phiên mã tạo dịch mã thành protein tái tổ hợp [62] 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu protease tái tổ hợp 1.4.1 Tình hình nghi n cứu tr n giới Trên giới có nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng enzyme protease để thủy phân protein từ nguồn chất khác nhau, nhằm sản xuất loại thực phẩm giàu dinh dưỡng dễ hấp thụ Quá trình thủy phân phụ phẩm cá tra việc sử dụng enzyme protease từ Bacillus subtilis, loại vi khuẩn có khả thích nghi cao, tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết (amylase, hemicellulase, glucanase, xylanase, protease…) trình sống để thích ứng với nhiều hồn cảnh điều kiện môi trường (E.El Mayday cộng sự, 1989) quan tâm nghiên cứu có 10 nhiều triển vọng để ứng dụng sản xuất thực tế [46] Ovissipour cộng tiến hành tối ưu hóa q trình thủy phân chất thải nội tạng cá ngừ vây vàng (Thunnus albacares) vào năm 2010 Tác giả điều kiện tối ưu để đạt đến mức thủy phân cao là: nhiệt độ 60,40C, thời gian 90,25 phút hoạt tính protease (Alcalase 2.4 L) 70.22 AU/kg protein Protein nội tạng cá ngừ sấy khơ có hàm lượng protein tương đối cao (72,34%) hàm lượng lipid thấp (1,43%) Ngoài ra, tỷ lệ hiệu suất protein thủy phân nội tạng cá ngừ 2,85-5,35 [58] 1.4.2 Tình hình nghi n cứu nước Các nghiên cứu khả thủy phân enzyme protease tiến hành từ năm đầu kỷ 21 Năm 2006, Trần Quốc Hiền Lê Văn Việt thu nhận enzyme protease từ ruột cá ba sa (Pangasius bocourti) với hoạt tính cao 15,79 UI/g CKNT (chất khơ nội tạng) điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1 (w/w); pH 9,5; nhiệt độ 350C; thời gian chiết 10 phút [18] Người tiên phong việc ứng dụng DNA tái tổ hợp liên quan đến enzyme protease Nguyễn Hoàng Lộc cộng (2011) Tác giả biểu thành cơng gen nprC10 mã hóa cho enzyme protease trung tính (NPRC10) từ Bacillus subtilis C10 hệ thống tế bào biểu E coli BL21 (DE3) [52] Nghiên cứu theo hướng sử dụng enzyme protease thương mại Nguyễn Thị Mỹ Hương thực phụ phẩm đầu cá ngừ vây vàng vào năm 2012 [10] Enzyme Protamex, enzyme thương mại phổ quát, tác giả Trần Thị Bích Thủy sử dụng để thủy phân cá trích (Sardinella Gibbosa) nghiên cứu tiến hành vào năm 2016 [20] 11 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Chủng vi sinh vật - Chủng E.coli M15 có chứa vector pQE 30 gắn gen npr C10 mã hóa cho protease phân lập từ Bacillus subtilis C10 - Bacillus subtilis C10 - Chủng E coli hoang dại 2.1.2 Nguy n i u v hóa chất * Thịt đỏ cá ngừ: thu mua khu vực Đà Nẵng - Môi trường LB - Môi trường LB cải tiến - Hóa chất sử dụng cho q trình giữ giống phân tích hóa sinh 2.1.3 Thiết bị s dụng Quá trình nghiên cứu sử dụng thiết bị có phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ Sinh học trường Đại Học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp bảo quản gi ng 2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy E.co i M15 2.2.2.1 Phương pháp hoạt hóa giống 2.2.2.2 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh 2.2.2.3 Phương pháp nuôi cấy thu nhận dịch enzyme protease thô từ vi khuẩn E.coli M15 tái tổ hợp 2.2.3 Phương pháp ây dựng đường cong tăng trưởng E.co i M15 12 2.2.4 Phương pháp định tính protease 2.2.5 Khảo sát biểu hi n vi huẩn E co i M15 tái tổ hợp 2.2.5.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 2.2.5.2 Ảnh hưởng thời gian cảm ứng 2.2.5.3 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng 2.2.6 Đánh giá hoạt độ enzyme protease thu từ q trình ni cấy E.co i M15 2.2.6.1 Xác định hoạt độ chung protease Hoạt độ chung protease enzyme NPRC10 xác định theo phương pháp Anson cải tiến [12] Một đơn vị hoạt độ protease (IU) định nghĩa lượng enzyme mà phút cần để giải phóng µg tyrosine điều kiện thí nghiệm 2.2.6.2 Xác định hoạt độ riêng protease Protein tổng số dịch chiết xác định theo phương pháp Bradford (1976) [29] Hoạt độ riêng (unit/mg) protease enzyme NPRC10 hoạt độ chung chia cho hàm lượng protein tổng số 2.2.7 Phương pháp ết tủa enzyme protease 2.2.7.1 Kết tủa enzyme muối amoni sunfat (NH4)2SO4 2.2.7.2 Kết tủa enzyme dung môi hữu 2.2.8 Xác định thông s phản ứng enzyme để thủy phân thịt đỏ cá ngừ enzyme protease tái tổ hợp 2.2.8.1 Xác định tỷ lệ enzyme/thịt đỏ 2.2.8.2 Xác định thời gian phản ứng 2.2.8.3 Xác định nhiệt độ phản ứng enzyme phù hợp 13 2.2.9 X th ng Số liệu thí nghiệm kết trung bình cộng lần lặp lại Kết thí nghiệm xử lý để thu giá trị trung bình phân tích phần mềm Excel 14 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát khả sinh trƣởng sinh enzyme protease chủng vi khuẩn E.coli M15 3.1.1 Đường cong sinh trưởng vi huẩn E.co i M15 Để khảo sát tốc độ sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn E.coli M15 tái tổ hợp, đường cong sinh trưởng chủng xây dựng dựa giá trị mật độ mật độ tế bào (giá trị OD600) sau ni cấy (hình 3.1) 50 40 30 20 10 0 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 Thời gian ni cấy (giờ) CFU/ml OD600 Hình 3.1 Đường cong sinh trưởng E.coli M15 Kết luận: Quá trình sinh tổng hợp protease tái tổ hợp phụ thuộc vào thời điểm bổ sungchất cảm ứng vào canh trường nuôi cấy.Thời điểm thường nằm pha logarit pha số lượng tế bào vi khuẩn lớn, tế bào vi khuẩn phát triển trạng thái tốt Do đó, chúng tơi định chọn thời gian cảm ứng để sinh enzyme sau nuôi cấy (OD đạt giá trị 2-3) 15 3.1.2 Xác định sinh enzyme protease vi huẩn E.co i M15 Để khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào chủng E.coli M15 tái tổ hợp, phương pháp đục lỗ thạch sử dụng Kết hình 3.2 cho thấy vòng thủy phân xuất xung quanh lỗ thạch chứa dịch enzyme protease thô thu từ canh trường nuôi cấy chủng E coli M15 tái tổ hợp chủng B subtilis hoang dại (đối chứng dương) Trong trường hợp đối chứng âm (-) dịch chiết từ chủng E coli hoang dại, vịng thủy phân khơng quan sát Điều chứng tỏ enzyme protease NprC10 tiết tế bào E coli M15 tái tổ hợp có khả phân giải casein Hình 3.2 Hình ảnh vịng trịn thủy phân casein 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 vi khuẩn E.coli M15 tái tổ hợp 16 3.2.1 Ảnh hưởng nguồn nitơ n sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 E co i M15 tái tổ hợp Nguồn nitơ (như pepton, tryptone) đóng vai trị quan trọng cho sinh trưởng phát triển vi sinh vật Để đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả sinh tổng hợp protease NprC10 tái tổ hợp, tiến hành nuôi cấy E.coli M15 tái tổ hợp mang gen nprC10 môi trường LB (chứa trypton) mơi trường LB cải tiến (chứa pepton) có bố sung kháng sinh phù hợp Dịch enzyme thô thu sau 19 cảm ứng với mM IPTG Kết hình 3.3 cho thấy hoạt độ protease nuôi môi trường LB cải tiến (6,768 U/ml) tăng gấp lần so với môi trường LB thông thường (2,83 U/ml) 8.000 [CELLREF] Hoạt độ enzyme (U/ml) 7.000 6.000 5.000 4.000 3.000 [CELLREF] 2.000 1.000 0.000 LB Môi trường ni cấy LB cải tiến Hình 3.3 Ảnh hưởng mơi trường lên hoạt độ protease Từ phân tích trên, tiến hành lựa chọn môi trường LB cải tiến cho thí nghiệm 3.2.2 Ảnh hưởng thời gian n sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 E co i M15 sau hi cảm ứng Với mục tiêu lựa chọn thời điểm thích hợp để thu nhận dịch 17 enzyme thô, sau cảm ứng, tiến hành thu dich enzyme Hoạt độ enzyme (U/ml) thô mốc thời gian 2, 4, 6, 17, 19 21 8.000 [CELLREF] 7.000 6.000 [CELLREF] [CELLREF] 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 [CELLREF] [CELLREF] [CELLREF] 0.000 17 19 21 Thời gian (giờ) Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian cảm ứng lên hoạt độ protease Kết hình 3.4 sau bổ sung chất cảm ứng hoạt tính protease tăng dần đạt giá trị cao (6,768 U/mL) thời điểm 19 Kết luận cho phần thí nghiệm này, chúng tơi lựa chọn thời điểm 19 sau cảm ứng để thu nhận dịch enzyme thô 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng n sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 E co i M15 Kết trình bày hình 3.5 cho thấy, nồng độ IPTG tăng từ 0.25 đến mM, hoạt độ enzyme tăng theo đạt giá trị cao (6,694 U/ml) giá trị 1mM IPTG Hoạt độ protease giảm 4,3 lần nồng độ IPTG cuối 1,5 dần hoạt tính nồng độ mM IPTG Điều cho thấy nồng độ cao IPTG gây độc cho tế bào E.coli 18 Hoạt độ enzyme (U/ml) 8.000 [CELLREF] [CELLREF] 7.000 6.000 [CELLREF][CELLREF] 5.000 4.000 3.000 [CELLREF] 2.000 1.000 [CELLREF] [CELLREF] 0.000 0,00 0,25 0,5 0,75 1,00 1,5 2,00 Nồng độ IPTG (mM) Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ cảm ứng lên hoạt độ protease 3.3 Kết nghiên cứu trình kết tủa protease E.coli M15 Hoạt độ enzyme (U/ml) Kết trình bày bảng 3.3 hình 3.6 35.000 30.000 25.000 20.000 15.000 10.000 5.000 0.000 [CELLREF] [CELLREF] [CELLREF] Đối chứng [CELLREF] (NH4)2SO4 Acetone (80%) Ethanol (80%) (70% độ bão hòa) Tác nhân tủa Hình 3.6 Ảnh hưởng tác nhân tủa đến hoạt độ enzyme protease Từ kết nghiên cứu thu nhận thấy rằng: 19 + Hoạt tính protease thu khác sử dụng nồng độ khác tác nhân tủa Trong tác nhân tủa, muối amoni sulfate cho hiệu tủa cao với hoạt tính protease, đạt 31,725 U/ml, (cao 15 lần so với trường hợp sử dụng ethanol, lần so với trường hợp sử dụng aceton) Do đó, chúng tơi chọn muối (NH4)2SO4 với nồng độ đạt 70% độ bão hòa tác nhân tủa thích hợp cho việc thu nhận chế phẩm protease từ E.coli M15 3.4 Xác định thông số phản ứng ảnh hƣởng đến hiệu thủy phân thịt đỏ cá ngừ enzyme protease tái tổ hợp 3.4.1 Kết ảnh hưởng tỷ enzyme/cơ chất đến hi u thủy phân enzyme protease NPRC10 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hàm lượng nitơ tổng số dịch đạm hiệu suất thu hồi nitơ từ thịt đỏ cá ngừ Hình 3.7 cho thấy tăng tỉ lệ enzyme/nguyên liệu từ 0,4% lên 6,4% hàm lượng nitơ tổng số dịch đạm thay đổi tương ứng 20 với hiệu suất thu hồi nitơ Từ kết thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy với tỉ lệ enzyme/nguyên liệu 1,6% hàm lượng nitơ tổng số dịch thủy phân (3,1%) và, hiệu suất thu hồi nitơ (68,81%) cao Đây tỉ lệ phù hợp để enzyme protease kết hợp với nguyên liệu thực trình thủy phân Từ kết phân tích cho thấy tỷ lệ enzyme so với chất 1,6% có hiệu suất thu hồi cao Vì vậy, chúng tơi chọn tỷ lệ enzyme 1,6% cho thí nghiệm 3.4.2 Xác định ảnh hưởng thời gian đến hi u thủy phân enzyme protease NPRC10 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi nitơ Kết nghiên cứu (hình 3.8) cho thấy hiệu suất thu hồi nitơ sản phẩm thủy phân tăng theo thời gian thủy phân Cụ thể, thời gian thủy phân tăng từ đến hiệu suất thu hồi nitơ tăng đáng kể từ 61,77% lên 77,11% Từ kết phân tích trên, chọn thời gian tối 21 ưu cho trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ enzyme protease tái tổ hợp 5,0 3.4.3 Xác định nhi t độ phản ứng enzyme phù hợp 85.55 90.00 78.66 Hiệu suất thu hồi Nitơ (%) 80.00 70.00 60.00 47.10 50.00 40.00 33.99 30.00 20.00 10.00 0.00 30.00 40.00 50.00 Nhiệt độ thủy phân 60.00 (0C) Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi nitơ (%) thủy phân thịt đỏ cá ngừ enzyme protease NPRC10 Kết thể hình 3.9 cho thấy nhiệt độ thủy phân có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu hồi nitơ (%) dước xúc tác enzyme protease Khi tăng nhiệt độ thủy phân từ 300C lên 500C hiệu suất thu hồi nitơ (%) tăng đáng kể từ 33,99% lên 85,55% Sau đó, giá trị giảm đáng kể nhiệt độ tăng lên 600C với hiệu suất thu hồi nitơ (%) 78,66% Kết tương ứng với kết thủy phân protein cá hồi Atlantic và cá trích [44], [20] Điều giải thích tăng nhiệt độ thủy phân tốc độ phản ứng tăng lên phân tử enzyme có động lớn hơn, tăng cường khả tiếp xúc với chất, q trình thủy phân tăng 22 cường đạt cực đại nhiệt độ tối thích Tuy nhiên tăng nhiệt độ thủy phân vượt 500C, hoạt tính enzyme protease bị giảm Điều enzyme bắt đầu bị biến tính nhiệt độ Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi nitơ (%) enzyme protease nghiên cứu tương đồng với kết nghiên cứu sử dụng enzyme Protamex thủy phân nguyên liệu giàu protein từ cá trích cá ngừ Trần Thị Bích Thủy cộng (2016) Nguyễn Thị Mỹ Hương (2012) [20], [10] Dựa vào kết phân tích ta thấy 500C enzyme hoạt động tốt Do chọn nhiệt độ tối ưu cho enzyme 500C 3.4.4 Kết uận hảo sát đơn biến Nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp để thực phản ứng thủy phân thu dịch đạm từ protein thịt đỏ cá ngừ enzyme protease tái tổ hợp NPRC10: thời gian phản ứng 5,0 giờ, tỷ lệ enzyme/cơ chất 1,6% nhiệt độ phản ứng 500C Hiệu suất thu hồi nitơ (%) đạt 85,55% 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A Kết luận Qua kết q trình nghiên cứu tơi đưa kết luận sau: - Đã xác định khả sinh protease ngoại bào vi khuẩn E.coli M15 mang vector pQE30 có gắn gen npr C10 từ Bacillus subtilis C10 với điều kiện: + Môi trường nuôi cấy: môi trường LB cải tiến (mỗi lít chứa: 10g peptone, 5g chiết xuất nấm men, 10g NaCL, pH 7,4) + Điều kiện biểu protease: Tăng sinh tế bào đến mật độ tế bào (OD600) đạt [2-3] (tương đương ni cấy), sau cảm ứng mM IPTG 19 với nhiệt độ 370C tốc độ lắc 250 vòng/phút - Đã xác định điều kiện tủa enzyme: tủa muối (NH4)2SO4 với nồng độ đạt 70% độ bão hòa - Đã xác định điều kiện thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme protease phương pháp khảo sát đơn biến với thông số phản ứng sau: thời gian phản ứng giờ; tỷ lệ enzyme/cơ chất = 1,6/100 (v/w); nhiệt độ phản ứng 500C Khi hiệu suất thu hồi nitơ (%) đạt cực đại (85,55%) B Kiến nghị - Tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp protease tái tổ hợp E.coli M15 (mật độ tế bào trước cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ tinh bột hòa tan, nồng độ ion Ca2+) - Tinh protease tái tổ hợp phương pháp sắc ký lực - Nghiên cứu sử dụng enzyme protease NPRC10 để thủy phân nguồn phế phẩm giàu protein khác  ... chất thịt đỏ cá ngừ - Thu nhận dịch đạm thủy phân từ thịt đỏ cá ngừ enzyme protease tái tổ hợp Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu - Sản xuất chế phẩm enzyme protease npr C10 từ Bacillus subtilis C10 vi. .. nghiên cứu khả thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme protease tái tổ hợp nhằm tiết kiệm chi phí sản xuất nâng cao khả thủy phân thịt đỏ cá ngừ Mục đích nghiên cứu - Biểu gen nprC10 mã hóa protease. .. Vi? ??t Nam có cơng trình nghiên cứu thịt đỏ cá ngừ, đặc biệt vi? ??c tìm cách sử dụng nguồn phế phẩm để phục vụ cho sống người Các nghiên cứu phát triển theo hướng sử dụng enzyme protease nội cá ngừ