Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

Thịt đỏ cá ngừ là phụ phẩm của ngành công nghiệp chế biến cá ngừ. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh thịt đỏ cá ngừ có hàm lượng protein cao, tuy nhiên hiện nay chưa được quan tâm nghiên cứu để chế biến. Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng chế phẩm enzyme pepsin thô. Nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết từ nội tạng cá ngừ để giảm chi phí nghiên cứu và ứng dụng. Kết quả nghiên cứu xác định được hàm lượng protein trong nguyên liệu là 26.95%, điều kiện thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng chế phẩm enzyme pepsin thô (0.0383 Uml) với các điều kiện thích hợp là: tỷ lệ enzymecơ chất = 30% (vw), tỷ lệ phối trộn nguyên liệunước = 13 (wv) ở nhiệt độ 55 o C trong thời gian 4 giờ.

LỜI NÓI ĐẦU

CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ

− CP: chế phẩm

− Da: đơn vị khối lượng phân tử

− kDa: kilo Dalton

− OD: Optical density – mật độ quang

− U: Unit – Đơn vị hoạt độ protease

− UV-Vis: Ultraviolet–visible spectroscopy – quang phổ tử ngoại khả kiến

− v/w: volume/weigh – thể tích/khối lượng

− w/v weigh/volume – khối lượng/thể tích

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cá ngừ là một trong những loại thủy sản có giá trị kinh tế cao và kim ngạch xuấtkhẩu lớn của Việt Nam: theo Tổng cục thủy sản Việt Nam, sản lượng khai thác cá ngừ

5 tháng đầu năm 2016 ước đạt 9,605 tấn [53] Trong khi đó, theo Hiệp hội chế biến vàxuất khẩu cá ngừ Việt Nam, giá trị xuất khẩu cá ngừ trong tháng 2/2017 đạt hơn 36.6triệu USD, tăng 53% so với cùng kỳ năm 2016 [51] Các sản phẩm cá ngừ xuất khẩucủa nước ta bao gồm: đóng hộp, tươi sống, đông lạnh và khô Phần thịt được sử dụngtrong sản xuất chủ yếu là phần thịt trắng, trong khi đó phần thịt đỏ không được sửdụng chiếm đến 11% tổng khối lượng của cá [21]

Trong thịt đỏ cá ngừ có chứa 18.28% protein và lượng lớn các acid amin thiếtyếu như: Isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, tryptophan,…[28].Hiện nay ở các nhà máy sản xuất các sản phẩm từ cá ngừ ở một số tỉnh, thành phố như

Đà Nẵng, Cà Mau vẫn chưa có biện pháp tối ưu để xử lý phần thịt đỏ này, mà chỉ được

sử dụng làm thức ăn chăn nuôi hoặc bán ra các đầu mối bán lẻ tại chợ với giá thành rất

rẻ từ 4.000 - 5.000 đ/kg Thịt đỏ cá ngừ có màu sắc đặc trưng vì chúng chứa các hợpchất mang màu mà chủ yếu là myoglobin (Mb) và hemoglobin (Hb) Thịt đỏ này dễ bịbiến đổi thành màu tối do sự oxi hóa nguyên tử sắt (Fe) trong nhóm hem của proteinkhi tiếp xúc với oxy để hình thành dạng metMb (Mb-Fe3+) có màu nâu không mongmuốn [20]

Ở nước ta hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu [6] tập trung vào việc tận dụngthịt đỏ cá ngừ để sản xuất các sản phẩm có giá trị gia tăng Đề tài này nghiên cứu một

số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng chế phẩm enzymepepsin thô tách chiết từ nội tạng cá như: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, tỷ lệ nguyênliệu/nước, thời gian phản ứng, pH và nhiệt độ môi trường phản ứng để có thể tạo rađược dịch đạm có hàm lượng dinh dưỡng cao và chất lượng đảm bảo với giá thành rẻ

2 Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu của đề tài này là

− Xác định được thành phần của thịt đỏ cá ngừ

− Tách chiết chế phẩm enzyme pepsin thô từ nội tạng cá ngừ

− Nghiên cứu những điều kiện tối ưu để thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ bằngchế phẩm enzyme pepsin thô được tách chiết từ nội tạng cá ngừ gồm có: tỷ lệenzyme/nguyên liệu, tỷ lệ nguyên liệu/nước, thời gian thủy phân và nhiệt độ thủyphân Hướng đến sử dụng dịch đạm thủy phân làm thức ăn dinh dưỡng cho con người

3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

− Thịt đỏ cá ngừ - sản phẩm phụ của ngành công nghiệp chế biến cá ngừ, đưcọcung cấp bởi Công ty TNHH MTV đồ hộp Hạ Long

− Nội tạng cá ngừ được thu mua tại chợ

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp vật lý: xác định nhiệt độ bằng nhiệt kế

Phương pháp hóa lý: xác định pH của môi trường và dịch đạm sau thủy phân.Phương pháp hóa sinh: thực hiện các phản ứng để thủy phân protein thịt đỏ cángừ bằng chế phẩm enzyme pepsin thô ở các điều kiện thay đổi; xác định các thànhphần hóa học của thịt đỏ cá ngừ như protein, độ ẩm, lipid, tro, ni-tơ tổng số, ni-tơamin

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về thủyphân thịt đỏ cá ngừ để tạo các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao cho người sử dụng.Nghiên cứu này giúp xác định các điều kiện tối ưu để thủy phân protein thịt đỏ cá ngừbằng chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết từ nội tạng cá Nghiên cứu này sẽ tìmthêm một hướng đi mới trong việc sản xuất dịch đạm có dinh dưỡng cao, ngoài ra việctận dụng nội tạng cá ngừ để đưa vào nghiên cứu cũng góp phần vào việc bảo vệ môitrường sống

Ý nghĩa thực tiễn: ở Việt Nam và thế giới hiện có rất ít sản phẩm được sản xuất

từ dịch đạm thủy phân có hàm lượng dinh dưỡng cao và giá thành những sản phẩmnày khá cao Đề tài này sử dụng nguyên liệu là phụ phẩm và phế phẩm của ngành côngnghiệp thủy sản do đó sẽ là hạ giá thành của sản phẩm Vì vậy đây là một đề tài có tínhthực tiễn cao, sản phẩm có tính thân thiện với môi trường và an toàn cho người sửdụng

5 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Danh sách các ký hiệu và chữ viết tắt

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Trong công nghệ chế biến cá, phần thịt đỏ thường là phế phẩm được vứt bỏ do cómùi tanh và hương vị ít thơm ngon như phần thịt trắng, phần thịt này thường chiếmđến 11% tổng trọng lượng của thịt cá [21]

Hiện tại, lượng thịt này thường được sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi vớigiá thành khá rẻ

1.1.2 Thành phần của thịt đỏ cá ngừ

Trong thịt đỏ cá ngừ có chứa một lượng lớn protein, acid amine tự do,carbohydrate và một số chất khoáng Bên cạnh đó, màu sắc của thịt đỏ là do các hợpchất mang màu mà chủ yếu là myoglobin (Mb) và hemoglobin (Hb), hàm lượng củachúng trong thịt đỏ cá ngừ cao hơn gấp 5 lần so với thịt trắng [21] Thịt đỏ dễ bị biếnđổi màu sắc do sự oxi hóa nguyên tử sắt trong nhóm hem của protein khi tiếp xúc vớikhông khí để hình thành dạng metMb (Mb-Fe3+) có màu nâu [20]

Trong thịt đỏ cá ngừ có một lượng lớn protein, nước và chất béo Hàm lượng cácchất có trong thịt đỏ cá ngừ được thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Hàm lượng các chất và năng lượng trong 100g thịt đỏ cá ngừ [35].

Trong thịt đỏ cá ngừ có một lượng lớn các acid amin thiết yếu cho cơ thể nhưacid glutamic, leucine, isoleucine Ngoài ra trong thịt đỏ có chứa một lượng nhỏhistidine, trong điều kiện thích hợp chúng sẽ chuyển hóa thành histamine – là một chấtgây nên hiện tượng dị ứng cho cơ thể người sử dụng.

Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ được trình bày trong bảng1.2 sau:

Bảng 1.2 Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ [35].

1.2.1.1 Cấu trúc và phân loại của pepsinogen

Pepsinogen của nhiều loài động vật có xương sống như động vật có vú, gia cầm,động vật lưỡng cư và cá đã được tách chiết và xác định trình tự chuỗi protein và DNA.Pepsinogen là mỗi chuỗi protein đơn bao gồm khoảng 370 acid amin, có khốilượng phân tử khoảng 42kDa và trong cấu trúc phân tử có 3 cầu nối disulfua Điểm pH

đẳng điện của pepsinogen ở pH 3.7, chúng khá bền ở pH 7 đến 9, tuy nhiên ở pH acidpepsinogen sẽ chuyển thành pepsin [37, trang 6].

Pepsinogen của các loài động vật có vú được chia thành năm nhóm bao gồmpepsinogen A (PG-A), pepsinogen B (PG-B), pepsinogen F (PG-F), pepsinogen C(PG-C, hay progastricsin) và pepsinogen Y (PG-Y hay prochymosin) [30] Sự phânloại pepsinogen ở các loài cá rất đa dạng Một vài nhà khoa học dựa vào hệ thống phânloại pepsinogen của động vật có vú và phân chia pepsinogen của cá thành 3 loại: PG-

A, B và C [26, 33], trong khi một số nhà khoa học khác phân thành I,

PG-II, PG-IPG-II, và PG-IV [46, 47].

Hình 1.1.Cấu trúc của phân tử pepsinogen tách chiết từ golden mandarin fish

(Siniperca scherzeri) [23].

Tuy nhiên, pepsinogen cá có những đặc điểm rất riêng biệt so với cácpepsinogen từ động vật có vú như: pepsinogen của các loài cá có điểm đẳng điện pIcao hơn, pH tối ưu cao hơn, hằng số Michaelis khác nhau, nhiệt độ tối ưu thấp hơn và

Quá trình hoạt hóa tiền enzyme là một quá trình phức tạp bao gồm các phản ứng

để cắt đứt các liên kết và các thay đổi về cấu trúc của zymogen, dẫn đến kết quả làmcác trung tâm hoạt động của enzyme được bộc lộ ra bên ngoài [40]

Ở pH 2, phản ứng hoạt hóa pepsinogen xảy ra rất nhanh và không xảy ra hiệntượng tự thủy phân chính nó [31, trang 6] Phản ứng hoạt hóa pepsinogen là một phảnứng tự xúc tác và một trong những sản phẩm của phản ứng này (enzyme pepsin) làchất xúc tác cho chính phản ứng này Bằng chứng là khi cho một lượng enzyme pepsinvào thì tốc độ của phản ứng hoạt hóa tăng lên

Khoảng 7 đến 9 liên kết peptide bị cắt đứt trong quá trình hoạt hóa pepsinogen,tuy nhiên cũng có thể chỉ có 1 trong những liên kết bị cắt đứt và 6 đến 8 liên kết cònlại là những vị trí liên kết yếu không liên quan đến quá trình hoạt hóa pepsinogen [41].Nhìn chung, trong quá trình hoạt hóa pepsinogen để tạo thành pepsin phải có ít nhấtmột liên kết bị cắt đứt và pepsin là chất xúc tác cho quá trình này Kết quả của quátrình hoạt hóa pepsinogen là 44 acid amin bị loại bỏ, khối lượng phân tử giảm xuống

từ 42 Kdal còn lại 35.5 Kdal và điểm pH đẳng điện từ 3.7 thay đổi thành dưới 1 Ngoài

ra, pepsinogen của lợn gồm có 363 acid amin, khi chúng được hoạt hóa thành pepsinthì chuỗi polypeptide chỉ còn lại 321 acid amin Trong quá trình hoạt hóa đã có 42 acid

amin bị mất đi trong đó có 9 lysine, 2 histidine, 2 arginine [39].

vị dạ dày của một số loài như người, gia súc, cừu, chim và cá Pepsin ở các loài độngvật có vú thường có ở dạ dày (ở cả niêm mạc và dịch vị), tuy nhiên chúng cũng đượctìm thấy một lượng nhỏ ở máu, cơ và nước tiểu Đối với cá, enzyme pepsin thường có

ở dạ dày nhưng cũng được phát hiện trong trứng cá hồi hay da cá nóc Có rất nhiềuloại enzyme pepsin khác nhau trong dạ dày, mỗi loại sẽ có cấu trúc protein và tính chấtkhác nhau [49]

Pepsin được tổng hợp và tiết ra ở màng dạ dày dưới dạng tiền hoạt động gọi làpepsinogen (PG) Khi HCl được tiết vào dịch dạ dày (lúc này pH=1.5-2.0), 44 acidamin phân giải theo cơ thế tự xúc tác để kích hoạt thành pepsin

Cấu trúc pepsin từ các loài động vật có vú đã được miêu tả chi tiết, pepsin từ cávẫn chưa được nghiên cứu sâu rộng Nghiên cứu đầu tiên là sự phát hiện cấu trúckhông gian vùng trung tâm hoạt động và thành phần amino acid của pepsin từ cá thu

gần giống với pepsin từ lợn (57,7% chuỗi đồng nhất) Pepsin của cá thu là một chuỗiđơn protein (một monome) của hai vùng xoắn cuộn tương đồng phân chia bởi một nếpgấp sâu [31].

Vùng xúc tác của pepsin được hình thành tại vùng tiếp xúc của hai vùng và cóchứa hai gốc aspartic acid là Asp 32 và Asp 215 ở mỗi vùng Trong hoạt động xúc táccủa pepsin, phân tử nước có nhiệm vụ hoạt hóa hay kìm hãm hoạt động nhóm carboxylcủa Asp 215 và Asp 32 một cách độc lập để bẽ gãy hay giữ nguyên liên kết peptidetrong phân tử protein [49]

Hình 1.2 Cấu trúc của pepsin tách chiết từ Atlantic cod (Gadus morhua) [31].

Danh pháp và phân loại pepsin dựa trên đặc điểm riêng biệt của enzyme nhưhoạt độ, độ bền, động học, thành phần của mỗi loại enzyme bao gồm cả vùng xúc tácchứa gốc aspartate, sự thoái hóa protein và cấu trúc bậc 3 Phân loại của enzymepepsin cũng từ phân loại của pepsinogen tương ứng của nó

1.2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme pepsin

Hoạt độ của pepsin được đo bởi khả năng phân giải protein chịu ảnh hưởng của

Nhìn chung, nếu trong cá có hơn một loại pepsin, pH tối ưu của chúng sẽ gầngiống nhau Tuy nhiên, điều này không áp dụng cho một số loài cá như cá trứng Bắccực Như vậy, pepsin chủ yếu bền ở điều kiện pH thấp Pepsin là một loài protease ưaacid và độ bền giảm như protein bị biến tính ở pH trên 6.0 [43].

Theo Sitthipong Nalinanon (2010) [38], pH tối ưu của enzyme pepsin từ nội tạng

cá ngừ vây dài (Thunnus alalunga) là 2 cá ngừ vằn (Katsuwonus pelamis) là 2.5, đối

với pepsin của 2 loài cá này, pH tối ưu của chúng nằm trong khoảng 2 đến 2.5

b) Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn lên hoạt động của pepsin của cá Cũng như pH,nhiệt độ tối ưu và khoảng ổn định nhiệt cũng rất quan trọng Nhiệt độ tối ưu củaenzyme của cá nằm trong khoảng 30oC đến 55oC Khi nhiệt độ xa giá trị tối ưu, hoạt độcủa enzyme sẽ giảm Nhiệt độ tối ưu của pepsin cá phụ thuộc chủ yếu vào loài cá (cásống ở vùng nước nóng hay nước lạnh) Các loài cá ở vùng nước lạnh có nhiệt độ tối

ưu thấp hơn những loài sống ở vùng nước nóng Hoạt độ của pepsin I và II từ vùngnước mặn nóng tối ưu lần lượt ở nhiệt độ 40oC và 55oC, trong khi ở vùng nước lạnh thìnhiệt độ tối ưu của hai loại pepsin này lần lượt là 38oC và 43oC [49]

Nhiệt độ cao ảnh hưởng đến độ bền của enzyme pepsin tùy thuộc vào loài cá.Tuy nhiên, pepsin từ loài nước lạnh dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ cao hơn Nhiệt độcao làm biến tính pepsin và phá hủy cấu trúc của nó

Theo Sitthipong Nalinanon (2010) [38] nhiệt độ tối ưu của enzyme pepsin từ nội

tạng cá ngừ vây dài (Thunnus alalunga) là 50oC

c) Các chất ức chế

Pepstatin A (một chất kìm hãm hoạt động aspartic proteinase) có thể cạnh tranhvới cơ chất của pepsin và ngăn cản sự gắn enzyme vào cơ chất, vì vậy làm ức chế hoạtđộng xúc tác của enzyme [22, trang 40]

Không phải tất cả các chất ức chế protease đều có ảnh hưởng ức chế lên pepsin.Một số chất tiêu biểu như phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), là một chất ức chếserine protease; ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), là một chất ức chếmetalloenzyme nhưng không có bất cứ tác dụng kìm hãm nào đối với enzyme pepsin[19]

Tuy nhiên, một số chất hóa học có khả năng ức chế hoạt động của enzymepepsin Các chất có khả năng ức chế hoạt động của pepsin như : Sodium dodecylsulfate (SDS) ở 0.05-0.1% (w/v) và cysteine ở nồng độ 5-50 mM [37] có tác dụng kìm

hãm lên pepsin từ loài cá thu ngừ (Thunnus alalunga) cá ngừ vằn (Katsuwonus

pelamis) và cá ngừ bò (Thunnus tonggol) Các hợp chất như methanol, ethanol,

amylalcol ức chế hoạt động pepsin ở nồng độ thấp, mức độ ức chế của các loại hợpchất alcohol tăng theo kích thước phân tử của chúng [45]

Adenosine tri phosphate (ATP), molybdate, NaCl, MgCl2, và CaCl2 không cóảnh hưởng nào lên hoạt động xúc tác của pepsin từ cá thu ngừ, cá ngừ đuôi dài, cá bơn

và cá đuôi chuột [36]

1.2.3 Ứng dụng trong công nghiệp của enzyme pepsin

− Chiết xuất Collagen

− Nghiên cứu y học: Pepsin được sử dụng trong việc điều trị các vấn đề về tiêuhóa, khử trùng răng và chữa các bệnh như bệnh khó tiêu, đau dạ dày, nôn mửa daidằng, bệnh tiêu chảy ở trẻ con, và cả một số bệnh ung thư

− Sản xuất phô mai

1.3.2 Quá trình thủy phân protein

Quá trình thủy phân protein là quá trình cắt mạch các phân tử peptid ở các liênkết peptid tạo ra các phân tử có kích thước nhỏ hơn như: peptone, polypeptide, peptide

và acid amin [7, trang18] Trong quá trình thủy phân protein, các liên kết peptid bị cắtđứt theo các trình tự để tạo thành các phân tử có kích thước khác nhau:

Protein Polypeptide Peptide Acid amin

Sản phẩm của quá trình thủy phân protein là các polypeptide, peptide, acid amin

và một lượng nhỏ amoniac Hầu hết các acid amin sản phẩm tạo thành chủ yếu là cácL-α amino acid [7, trang 13]

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzyme

1.3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme đến phản ứng thủy phân protein bằng enzyme

Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ enzyme thấp thì tốc độ phản ứng

enzyme phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất [2, trang 41] Khi tăng lượng cơ chất

thì tốc độ phản ứng ban đầu sẽ tăng Khi toàn bộ enzyme kết hợp với cơ chất để tạonên phức hợp phản ứng enzyme-cơ chất, nếu ta tiếp tục cho cơ chất vào thì tốc độphản ứng sẽ không đổi, khi đó tốc độ phản ứng đạt trạng thái tối đa.

Trong điều kiện dư thừa cơ chất, tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc vào nồng

độ enzyme Khi nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng Trong trường hợpnồng độ enzyme quá lớn, tốc độ phản ứng sẽ tăng chậm và sau một khoảng thời gianngắn, tốc độ phản ứng sẽ không đổi theo thời gian

1.3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme Khi nhiệt độ tăng tốc độphản ứng sẽ tăng theo, tuy nhiên tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độnhất định Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến triệttiêu

Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối

ưu Phần lớn enzyme hoạt động mạnh ở nhiệt độ 40 – 50oC, một số enzyme khác hoạtđộng mạnh ở 60oC và một số khác ở 70oC Với mỗi enzyme khác nhau thì có nhiệt độhoạt động tối ưu khác nhau Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tínhcủa enzyme sẽ giảm và không có khả năng phục hồi lại được Ngược lại, ở nhiệt độ

0oC enzyme bị ức chế hoạt động rất mạnh nhưng khi đưa nhiệt độ từ từ lên nhiệt độ tối

ưu, hoạt tính enzyme sẽ tăng dần lên đến mức tối đa [2, trang 45]

1.3.3.3 Ảnh hưởng của pH

Chỉ số pH có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản ứng enzyme Mỗi enzyme chỉhoạt động tốt ở một pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích của enzyme pH môitrường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt là độ bền củaenzyme [2, trang 44]

Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính, tuy nhiên cũng có nhiềuenzyme hoạt động mạnh ở pH acid yếu Tuy nhiên có một số loại enzyme có thể hoạtđộng mạnh ở cả pH kiềm và acid

1.3.3.4 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Thời gian phản ứng có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất của quá trình thủy phân vàtính chất của dịch thủy phân Thời gian phản ứng ngắn sẽ làm giảm hiệu suất của quátrình do enzyme chưa thủy phân hết cơ chất có trong môi trường Khi thời gian phảnứng tăng sẽ làm tăng hiệu suất thủy phân protein những kéo theo đó là sự phát triển

của các vi sinh vật tạo ra các sản phẩm như H2S, NH3,… làm giảm chất lượng của dịchthủy phân.

1.3.3.5 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm

Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi bởi một số chất hóa học khác nhau Cácchất hóa học này có trong các phản ứng enzyme nhưng không bị chuyển hóa bởi cácenzyme đó [2, trang 46]

Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô

cơ, hữu cơ và cả các phân tử protein Cơ chế kìm hãm của các chất có thể là thuậnnghịch hoặc không thuận nghịch

1.3.3.6 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa

Các chất có khả năng làm tăng hoạt tính của enzyme được gọi là các chất hoạthóa Các chất này có bản chất khác nhau, chúng có thể là các anion, các ion kim loạihoặc là các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp Các chất hoạt hóa này chỉ có khả nănghoạt hóa ở một nồng độ nhất định, vượt quá nồng độ này chúng sẽ làm ức chế hoạtđộng của enzyme [2, trang 51]

1.4 Tình hình nghiên cứu về thủy phân protein từ cá

1.4.1 Nghiên cứu trong nước

Một số nghiên cứu liên quan tới vấn đề đặt ra của luận văn được thực hiện ở điềukiện trong nước như sau:

Theo Nguyễn Trọng Cẩn thì có thể sản xuất dịch đạm thủy phân từ nguyên liệu

cá bằng cách sử dụng Aspergillus Orizae hoặc vi khuẩn Khi sử dụng mốc Aspergillus Orizae để thủy phân thịt cá thì trong mốc này có chứa hệ enzyme protease như

innulase, imetase, asparaginase, glutaminase, proteolytic Những enzyme này có tácdụng thủy phân trong điều kiện thích hợp là nhiệt độ 37-41oC, pH = 6-8, tỉ lệ nấm mốcthường sử dụng là 3-4% so với nguyên liệu Thời gian thủy phân tùy thuộc vào mức độhoạt động của nấm mốc và yêu cầu hàm lượng đạm của sản phẩm Đối với sản xuấtnước mắm, thời gian thủy phân từ 10-15 ngày thì thu được chượp chín Lượng muối

bổ sung vào quá trình thủy phân thường từ 4-6% để tránh thối rữa Nếu bổ sung mộtlượng muối cao hơn thì protease của mốc bị ức chế, không hoạt động Sản xuất dịchđạm thủy phân từ nấm mốc có thể có những nhược điểm như: Dịch đạm không cóhương thơm, dễ bị đắng, có thể là do xác vi sinh vật còn tồn tại, hoặc do các loại muối

canxi, ma-giê có trong muối ăn; dịch đạm dễ bị chua, có nhiều nguyên nhân: có thể dolượng tinh bột mà mốc sử dụng không hết trong quá trình chế biến lên men lactic, cóthể do các acid bay hơi hình thành khi cá bị ươn [5].

Trong công trình “Ảnh hưởng các điều kiện chiết khác nhau đến hiệu suất thu hồi protein từ cơ thị đỏ cá ngừ” (2012) của Phạm Thị Hiền đã đưa ra được ảnh hưởng

của pH, nhiệt độ, thời gian chiết, tỷ lệ dung môi và nguyên liệu lên hiệu quả tách chiếtprotein từ thịt đỏ cá ngừ Hiệu suất thu hồi protein cao nhất tại pH = 13, thời gian chiết1h, nhiệt độ dung môi chiết 30oC, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi chiết = 1/10 [6]

Cũng trong năm 2012 công trình “Sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu

cá ngừ vây vàng bằng protease thương mại” của Nguyễn Thị Mỹ Hương đưa ra sản

phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex 0.5% ở nhiệt

độ 45oC và pH tự nhiên trong thời gian 6 giờ với tỉ lệ nước/nguyên liệu là 1:1 Kết quảnghiên cứu đã chỉ ra độ thủy phân và tỉ lệ thu hồi nitơ trong sản phẩm thủy phân tănglên cùng với sự tăng thời gian thủy phân Sau 6 giờ thủy phân, độ thủy phân đã đạtđược 30.1% và tỉ lệ thu hồi nitơ là 85.1% Sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừvây vàng có hàm lượng protein 88.2%, lipit 1.4% và tro 8.3% Sản phẩm thủy phânprotein này có hàm lượng acid amin không thay thế cao [4]

Năm 2014, Trần Thanh Trúc và cộng sự đã thực hiện công trình “Nghiên cứu khả năng thủy phân dịch protein của thịt đầu tôm sú bằng enzyme protease nội tại” Thông

qua nội dung nghiên cứu, xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự thủy phânprotein như thời gian thủy phân thích hợp, ảnh hưởng của pH đến môi trường thủyphân Đặc biệt, điều kiện tiền xử lý nhiệt nhằm kích hoạt hệ enzyme protease nội bào.Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, thời gian thủy phân protein tốt nhất, dịch thủy phânkhông có mùi lạ là 8 giờ, đồng thời, quá trình thủy phân protein đạt tốt nhất khi điềuchỉnh pH môi trường là 9, kết hợp với thông số tối ưu của điều kiện tiền xử lý nhiệtnguyên liệu là 50.73oC và thời gian là 4.43 phút [13]

Cũng trong năm 2014, Nguyễn Thị Mỹ Hương trong nghiên cứu “Thành phần dinh dưỡng của các sản phẩm thủy phân từ đầu và xương cá chẽm (Lates calcarifer) bằng enzyme Flavourzyme” đã tiến hành thủy phân đầu và xương cá chẽm (Lates calcarifer) bằng enzyme Flavourzyme với tỉ lệ enzyme 0.5% so với nguyên liệu, tỉ lệ

nước : nguyên liệu là 1:1, quá trình thủy phân được thực hiện ở nhiệt độ 50°C, pH tựnhiên (6.5) trong thời gian 6 giờ Kết quả nghiên cứu cho thấy bột thủy phân protein

có hàm lượng protein cao (81.5%), hàm lượng lipit thấp (1.80%) và hàm lượng tro7.4% Bột protein không tan có hàm lượng protein 67.3%, hàm lượng lipit 16.5% vàhàm lượng tro 6.9% Bột thủy phân protein và bột protein không tan có giá trị dinh

dưỡng cao với các acid amin không thay thế Dầu cá từ đầu và xương cá chẽm giàuaxit béo omega 3 (26.18%), đặc biệt là axit docosahexaenoic (DHA) và axiteicosapentaenoic (EPA) [3].

Năm 2015, công trình “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protamex để thủy phân cá trích (Sardinella Gibbosa) thu dịch đạm” của Trần Thị Bích Thủy đưa ra điều kiện

thủy phân thích hợp để thu dịch đạm giàu acid amine từ protein của cá trích bằngenzyme Protamex ở pH tự nhiên với tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1 Kết quả nghiên cứucho thấy điều kiện thủy phân thích hợp là: nhiệt độ 50oC, tỷ lệ enzyme - cơ chất 0.5%(w/v), thời gian 6 giờ Độ thủy phân, hiệu suất thu hồi nitơ, hàm lượng nitơ ammonia

và hàm lượng nitơ acid amine trong dịch thủy phân thu được lần lượt đạt là 70.73%,63.04%, 1.57 g/l và 12.88 g/l [14]

Hiện nay, các công trình nghiên cứu về thịt đỏ cá ngừ vẫn còn ít, chưa toàn diện.Nghiên cứu quá trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô vẫn chưa có

1.4.2 Nghiên cứu nước ngoài

Để đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao của con người về “thực phẩm phân tử”,nhiều nước trên thế giới đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme thủy phân protein,dựa trên tính năng của các protease, để sản xuất ra một loại thực phẩm giàu dinhdưỡng và dễ hấp thụ, đó là dịch protein thủy phân

Ling Lin Liu và cộng sự (1981) đã sản xuất dịch đạm thủy phân từ cá bằngenzyme pepsin, nhưng các tác giả lại không sử dụng chế phẩm enzyme có sẵn trên thịtrường mà chỉ chiết lấy dịch thô enzyme từ dạ dày lợn để giảm chi phí sản xuất Tuynhiên, chất lượng sản phẩm chưa cao vì enzyme có chứa nhiều tạp chất [33]

Ở Anh, Imm J.Y và Lee C.M (1999) đã nghiên cứu sản xuất bột gia vị thủy sản

từ lươn đỏ Urophycis chuss bằng enzyme Flavourzyme and Savorase ở điều kiện pH

tự nhiên của cá (6.8) và tỷ lệ nước/cá là 2/5, tác giả còn bổ sung thêm 1.5% NaCl và0.4% Sodium Tripolyphosphate (STPP) để cải thiện chất lượng của gia vị bằng cáchloại bỏ vị đắng và mùi tanh đặc trưng của cá Kết quả nghiên cứu cho thấy với thờigian thủy phân 6 giờ cho hiệu suất thủy phân cao nhất, quá trình thủy phân đã làm tănghàm lượng của hầu hết các acid amin tự do, dịch thủy phân cho hàm lượng cao cácacid amin tạo vị umami và vị ngọt cao hơn so với nước dùng khi nấu nguyên liệu [29]

Ở Pháp, Guerard F (2002) đã ứng dụng công nghệ enzyme trong sản xuất dịchđạm thủy phân từ phế thải của nhà máy sản xuất cá hộp Theo tác giả, dịch thủy phânprotein cá (FPH) đang ngày càng thu hút sự quan tâm vì khả năng ứng dụng của chúngnhư một nguồn peptid có hoạt tính sinh học hoặc như nguồn cơ chất nitơ để chuẩn bịmôi trường lên men vi sinh vật Các phế thải của nhà máy chế biến cá hộp được thủy

phân với enzyme protease thương mại “Umamizyme” Quá trình thủy phân enzymeđược tiến hành trong bình lên men 1 lít, ở pH 7 nhiệt độ 45°C Các yếu tố ảnh hưởngđến quá trình thủy phân được nghiên cứu (tỷ lệ enzyme/cơ chất protein thay đổi trongkhoảng từ 0.1 đến 1.5% (w/w), mức độ thủy phân protein, hàm lượng nitơ giải phóng

ra, trọng lượng phân tử của peptid Kết quả thu được khi tỷ lệ enzyme/cơ chất là 1,5%,sau 4 giờ thủy phân thì mức độ thủy phân lên đến 22.5% Tác giả cũng đã xác địnhđược đường thẳng tuyến tính giữa mức độ thủy phân và hàm lượng nitơ thu hồi Nhân

tố giới hạn quá trình thủy phân được rút ra từ kết quả thí nghiệm là nhiệt độ 45°C và

pH 7 Các kết quả thí nghiệm cũng cho thấy khi thủy phân phế thải của quá trình chếbiến cá ngừ, enzyme “Umamizyme” có hiệu quả thủy phân tương đương với enzymeAlcalase® 2, 4L Tuy nhiên, tính ổn định của enzyme Umamizyme thấp hơn enzymeAlcalase® 2,4L [28]

Sofiane Ghorbel và cộng sự (2005) tạo môi trường cung cấp nitơ cho quá trình

nuôi Rhizopus oryzae đã sử dụng dịch thủy phân từ cá mòi bằng cách cho thủy phân

nguyên liệu cá mòi bằng enzyme Alcalase với tỷ lệ nguyên liệu/nước = 8% (w/v) ở pH8.0 và 60oC, thời gian phản ứng thủy phân là 3 giờ Kết quả chỉ ra rằng nguồn nitơ từ

cá tạo điều kiện cho R.oryzae phát triển tốt và tạo ra sản phẩm lipase tốt hơn so với

peptone, từ đó chỉ ra rằng dịch thủy phân từ cá có thể ứng dụng trong quá trình côngnghiệp lên men [42]

Anusha G.P và cộng sự (2007) cũng đã tiến hành nghiên cứu thu nhận dịch thủyphân từ cá Hake Thái Bình Dương Các điều kiện thủy phân khác nhau đã được thựchiện bao gồm tự thủy phân (1 giờ ở 52oC và pH 5.5), hoặc bằng bổ sung các enzymethương mại như Validase ® BNP hay Flavourzyme 500® L Dịch thủy phân thu được

từ loài cá này được chứng minh là có hoạt tính chống ôxy hóa [17].

Ở Malaysia, S.Y.Yu và L.K.Tan (1990) đã sử dụng enzyme alkalase 0.61 để sản

xuất dịch đạm thủy phân từ cá rô phi Oreochromis mossambicus Điều kiện thủy phân

cho hiệu suất cao là ở nhiệt độ 50oC, pH là 8.0, với tỷ lệ một phần nước và một phầnthịt cá; tỷ lệ enzyme và cơ chất là 1:50 Sau khi đã trung hòa, dịch thuỷ phân được thuhồi và làm nguyên liệu sản xuất bánh quy “Keropok” [48]

Năm 2010, Mahmoudreza Ovissipour và cộng sự, đã tạo dịch thủy phân từ nội

tạng cá ngừ vây vàng (Thunnus albacares) Điều kiện thủy phân (hoạt độ của enzyme,

nhiệt độ, và thời gian) được tối ưu hóa bằng cách sử dụng phương pháp phản ứng bềmặt Điều kiện tối ưu để đạt mức độ thủy phân cao nhất ở nhiệt độ 60.4oC, thời gian90.25 phút và hoạt độ của protease (Alcalase 2,2L) là 70,22 AU/kg protein Dịch thủy

phân được sấy khô và xác định được tỷ lệ protein tương đối cao (72.34%) và lipid thấp

(1.43%) với tỷ lệ hiệu quả trong phân giải protein từ nội tạng cá ngừ là 2.85-5.35 [34].

Trong báo cáo năm 2012 của Faouzi Ben Rebah và Nabil Miled đã chỉ ra rằngngành công nghiệp thủy sản tạo ra một lượng lớn sản phẩm phụ, tạo một vấn đề lớncho môi trường và sức khỏe của con người Để tránh lãng phí các sản phẩm phụ này,các phương pháp khác nhau đã được sử dụng bao hồm: ủ chua, lên men, thủy phân vàsản xuất dầu cá Kết quả cho thấy các sản phẩm loại bỏ trong quá trình sản xuất chếbiến thủy sản là một nguồn cung cấp dinh dưỡng tuyệt vời cho sự sinh trưởng và pháttriển của vi sinh vật trong quá trình sản xuất enzyme, mà có thể thay thế những môitrường có chi phí cao do phải cung cấp các yếu tố tăng trưởng trong môi trường Cácphụ phẩm (đầu, nội tạng, nước thải,…) đã được sử dụng và thử nghiệm làm môitrường phát triển cho các vi sinh vật sản xuất enzyme như protease, lipase, chitinolytic

và enzyme ligninolytic đã bước đầu cho thấy có nhiều lợi thế trong quá trình sản xuấtenzyme như năng suất cao, kỹ thuật đơn giản, giảm nhu cầu năng lượng và chi phí sảnxuất [25]

Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy, công nghệ enzyme có thể xúc tác choquá trình chuyển hóa các nguyên liệu giá trị thấp (cá tạp kém giá trị, phế phụ phẩmtôm, cá, ) thành một loại thực phẩm chức năng có giá trị cao gấp nhiều lần Ứngdụng enzyme để thủy phân protein sẽ triệt để hơn, thu được dịch đạm thuỷ phân cóchất lượng cao do tạo ra được nhiều các peptit và acid amin có thành phần, tỷ lệ cânđối để bổ sung vào các thực phẩm khác cho người Dịch đạm thuỷ phân được xem lànguyên liệu đầu vào cho phát triển và sản xuất một số sản phẩm giá trị gia tăng nhưbột dinh dưỡng, bột gia vị, tạo nước sốt, súp đặc trưng cho các sản phẩm từ thủy sản

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu và thiết bị sử dụng

2.1.1 Nguyên liệu

Thịt đỏ cá ngừ được Công ty TNHH MTV đồ hộp Hạ Long – Đà Nẵng cung cấp:mẫu thịt đỏ được lấy từ dây chuyền sản xuất cá hộp “cá ngừ dầm dầu”, sau công đoạnhấp loại bỏ nước tự do ở nhiệt độ 60 – 80oC

Hình 2.3 Mẫu thịt đỏ cá ngừ được cung cấp bởi Công ty TNHH MTV đồ hộp Hạ

Long – Đà Nẵng trước và sau khi rã đông.

Quy cách lấy mẫu và bảo quản mẫu: mẫu thịt đỏ được bảo quản trong túi nilonđặt trong thùng xốp được chuyển về phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học củaTrường Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng Tại đây, mẫu thịt đỏ được phân chiavào các túi PE với khối lượng 100g Các mẫu này có thể trực tiếp đem đi làm thínghiệm hoặc bảo quản trong tủ lạnh -20oC, những lần thí nghiệm tiếp theo mẫu sẽđược rã đông ở nhiệt độ phòng tới nhiệt độ khối thịt từ 0 – 1oC rồi mang đi xử lý vàkhảo sát

Vật liệu để tách chiết chế phẩm enzyme pepsin thô: nội tạng cá ngừ được thumua tại chợ Hòa Khánh thuộc phường Hòa Khánh Bắc, quận Liên Chiểu, thành phố

Đà Nẵng sau được rửa qua với dung dịch nước muối 1 – 1.5% và sau đó bảo quảntrong tủ lạnh -20oC Khi tiến hành nghiên cứu và khảo sát, mẫu mẫu sẽ được rã đông ởnhiệt độ phòng tới nhiệt độ khối thịt từ 0 – 1oC

Hình 2.4 Mẫu nội tạng cá ngừ thu mua từ chợ Hòa Khánh, Tp Đà Nẵng.

2.1.2 Thiết bị

Trong nghiên cứu này tôi sử dụng các thiết bị có trong phòng thí nghệm Côngnghệ sinh học của trường Đại học Bách khoa – Đại học Đà Nẵng:

− Cân kỹ thuật OHAUS – Mỹ

− Cân phân tích SHIMADZU AUY 220 – Nhật Bản

− Máy đo pH TOLEDO MP220 – Thụy Sĩ

− Máy xay sinh tố PANASONIC MX-SM 1031 – Malaysia

− Máy lắc khô STUART SI500 – Anh

− Máy ly tâm ROTANTA 460R – Đức

− Tủ lạnh ALASSKA – Việt Nam

− Tủ lạnh âm SANYO – Nhật Bản

− Bếp điện

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp phân tích

2.2.1.1 Xác định hàm lượng ni-tơ tổng số và protein thô thịt đỏ cá ngừ

Hàm lượng protein thô trong mẫu được xác đinh bằng phương pháp xác địnhhàm lượng ni-tơ tổng số - phương pháp Kjeldahl

Tất cả các dạng ni-tơ có trong cơ thể và các mô là ni-tơ tổng số Ni-tơ trong cácacid amin của phân tử protein được gọi là ni-tơ protein, ni-tơ không có trong proteinnhư các muối amoni, của muối vô cơ, acid nitric, các amino acid tự do, các peptide,urê và các dẫn xuất của urê, các alkaloid, các purin và pyrimidin… là các ni-tơ phiprotein

Nguyên tắc của phương pháp Kjeldahl: Vô cơ hóa mẫu bằng acid sulfuric đậmđặc, ni-tơ có trong mẫu sẽ chuyển thành amon sulfat Dùng kiềm đặc đẩy amoniac rakhỏi amon sulfat trong máy cất đạm tạo thành amon hydroxyt, sau đó định lượng bằngacid Hàm lượng ni-tơ trung bình trong phân tử protein của sản phẩm thủy sản là 16%

vì vậy hàm lượng protein thô trong mẫu thử bằng hàm lượng ni-tơ tổng số nhân với hệ

số 6.25 Quy trình được tiến hành theo TCVN 3705 – 1990 ở mục 2.1 phụ lục 2

2.2.1.2 Xác định hàm lượng chất béo thịt đỏ cá ngừ

Hàm lượng chất béo được xác định dựa theo phương pháp chiết Soxhlet theoTCVN 3703:2009 ở mục 2.2 phụ lục 2

Nguyên tắc của phương pháp: Mẫu được xử lý bằng natri sulfat hoặc canxi sulfat,chất béo giải phóng được trích ly bằng ete etylic Dung môi được làm bay hơi vàlượng chất béo được xác định bằng cách cân.

2.2.1.3 Xác định hàm lượng tro tổng số thịt đỏ cá ngừ

Nguyên tắc của phương pháp: Tro hóa hoàn toàn mẫu trong lò nung ở nhiệt độ từ

500 đến 550oC trong lò nung để chuyển hóa hoàn toàn chất hữu cơ thành tro có màuxám trắng Hàm lượng tro được xác định từ khối lượng tro còn lại sau khi tro hóa.Quy trình được tiến hành theo TCVN 5105 – 2009 ở mục 2.3 phụ lục 2

2.2.1.4 Xác định hàm lượng ẩm thịt

đỏ cá ngừ

Nguyên tắc của phương pháp: Dùng nhiệt để loại bỏ nước khỏi mẫu thử Hiệu sốkhối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô là lượng nước có trong mẫu thử.Quy trình được tiến hành theo TCVN 3700 – 1990 ở mục 2.4 phụ lục 2

2.2.1.5 Xác định hàm lượng ni-tơ amin thịt đỏ cá ngừ và dịch đạm

Nguyên tắc của phương pháp: Cho amin tác dụng với formoldehyt tạo thànhnhóm –N=CH2 ( metylic) làm cho tính bazơ yếu đi và thể hiện tính acid Do đó chuẩnbằng chất chuẩn kiềm và chất chỉ thị acid-bazơ để kết thúc phản ứng

Quy trình tiến hành theo TCVN 3707 – 1990 ở mục 2.5 phụ lục 2

2.2.2 Xác định mức độ thủy phân protein trong dịch đạm

Mức độ thủy phân (H) của protein trong dịch đạm thu được sau quá trình thủyphân dưới tác dụng của enzyme pepsin được tính theo công thức (1) sau:

%100

AA AA N N

N N H

Nguyên liệu tươi

Xử lý (nước muối 1-1.5%)

Bảo quản -20oC

Rã đông (0-1oC)

Nghiền

Phối trộn với nước theo tỉ lệ 1:1

Thu enzyme thô

Ly tâm 5000v/p, 15 phút, 4oC

Thủy phân 45oC/40 phút

Điều chỉnh pH đến 2-2.5

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tách chiết CP enzyme pepsin thô từ nội tạng cá ngừ [1].

2.2.3 Thực nghiệm thu nhận CP enzyme pepsin thô từ nội tạng cá ngừ và xác định hoạt độ của enzyme pepsin

2.2.3.1 Quy trình tách chiết enzyme

Thuyết minh quy trình:

Nội tạng cá ngừ sau khi thu mua hoặc tách từ cá nếu trực tiếp sử dụng sẽ đượcđưa đến công đoạn nghiền, còn nếu chưa được sử dụng sẽ được xử lý sơ bộ bằng cáchrửa với nước muối nồng độ 1-1.5% để loại bỏ các chất bẩn và bảo quản ở nhiệt độ-20oC Khi tiến hành nghiên cứu, nguyên liệu sẽ được rã đông ở nhiệt độ 0-1oC sau đóđược nghiền nhỏ trong máy nghiền đến kích thước khoảng 1mm Nguyên liệu sau khinghiền sẽ được trộn với nước cất theo tỉ lệ 1:1 và điều chỉnh pH đến 2-2.5 Tiếp đó sẽ

Tỷ lệ nguyên liệu/nước: 1/3 Thời gian: 2 giờ

tiến hành quá trình thủy phân các protein có trong nguyên liệu để loại bỏ chúng ra khỏi

hỗn hợp với enzyme pepsin ở 45oC trong 40 phút Khi quá trình thủy phân kết thúc,

hỗn hợp sau thủy phân sẽ được ly tâm ở tốc độ 5000v/p, trong 15 phút ở 4oC và thu lấy

phần dịch enzyme thô Dịch enzyme thu được gọi là chế phẩm enzyme pepsin thô

2.2.3.2 Xác định hoạt độ pepsin theo phương pháp Anson cải tiến [15, 52]

Nguyên tắc của phương pháp: Sử dụng casein làm cơ chất, dưới tác dụng củaenzyme protease ngoại bào trong thịt đỏ để thủy phân casein thành các đoạn peptid

ngắn và các acid amin trong đó có tyrosine Xác định lượng tyrosine tạo thành bởi

thuốc thử Folin-Ciocalteu, phản ứng của tyrosine làm thuốc thử Folin-Ciocalteu

chuyển thành màu xanh và hấp thu quang mạnh nhất ở bước sóng 660nm Dựa vào đồ

thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác

dụng của enzyme

Quy trình tiến hành theo mục 2.6 phụ lục 2

2.2.4 Thực nghiệm nghiên cứu quá trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ sử dụng CP

enzyme pepsin thô

2.2.4.1 Bố trí thí nghiệm để xác định tỷ lệ enzyme/ thịt đỏ cá ngừ thích hợp cho quá trình thủy phân

Mô tả thí nghiệm:

Cho vào 7 bình tam giác mỗi bình 20g thịt đỏ cá ngừ đã được nghiền nhỏ bằngmáy xay sau đó bổ sung nước cất theo tỷ lệ 1/3 vào các bình Điều chỉnh pH nguyên

liệu trong các bình về 2-2.5 Bổ sung enzyme pepsin đã được tách chiết trước đó vào 7

bình theo các tỷ lệ 0%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% so với nguyên liệu (v/w)

Quá trình thủy phân được tiến hành ở nhiệt độ 50oC, trong 2 giờ Sau quá trình thủy

phân, bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85-90oC trong 15 phút sau đó ly tâm thu lấy phần

dịch rồi đem đi cân và phân tích để xác định mức độ thủy phân Từ đó đánh giá và

chọn tỷ lệ enzyme/nguyên liệu tối ưu để tiến hành các thí nghiệm tối ưu hóa các thông

số khác

Trang 21

Thịt đỏ cá ngừ

Nghiền nhỏ

Phân tích hàm lượng ni-tơ amin và xác định mức độ thủy phân

Chọn thời gian tối ưu

Điều chỉnh các thông số:

pH = 2 – 2.5 Nhiệt độ: 50 ± 0.5oC

Tỷ lệ nguyên liệu/nước: 1/3 (w/v)

Tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (v/w): 30%

2.2.4.2 Bố trí thí nghiệm để xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân

Trang 22

Mô tả thí nghiệm:

Cho vào 5 bình tam giác mỗi bình 20g thịt đỏ cá ngừ đã được nghiền nhỏ bằngmáy xay sau đó bổ sung nước cất theo tỷ lệ 1 nguyên liệu 3 nước (w/v) vào các bình.Điều chỉnh pH nguyên liệu trong các bình về 2-2.5 Bổ sung enzyme pepsin đã đượctách chiết trước đó vào 5 bình theo tỷ lệ 30% so với nguyên liệu (v/w) Quá trình thủyphân được tiến hành ở nhiệt độ 50oC, trong các khoảng thời gian 1, 2, 3, 4 và 5 giờ.Sau quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85-90oC trong 15 phút sau đó lytâm thu lấy phần dịch rồi đem đi cân và phân tích để xác định mức độ thủy phân Từ

Thịt đỏ cá ngừ Nghiền nhỏ

Tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (v/w): 30%

1/7 1/1

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định tỷ lệ nước và nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân.

đó đánh giá và chọn tỷ lệ enzyme/nguyên liệu tối ưu để tiến hành các thí nghiệm tối ưuhóa các thông số khác

2.2.4.3 Bố trí thí nghiệm để xác định tỷ lệ nước và nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân

Mô tả thí nghiệm:

Cho vào 7 bình tam giác mỗi bình 20g thịt đỏ cá ngừ đã được nghiền nhỏ bằngmáy xay sau đó bổ sung nước cất theo các tỷ lệ nguyên liêu/nước 1/1, 1/2, 1/3, 1/4,1/5, 1/6, 1/7 (w/v) rồi điều chỉnh pH của nguyên liệu về 2-2.5 Bổ sung enzyme pepsin

đã được tách chiết trước đó theo tỷ lệ 1% so với dịch thủy phân Quá trình thủy phânđược tiến hành ở nhiệt độ 50oC Theo nguyên tắc kế thừa thì các thí nghiệm sau phải

kế thừa kết quả của các thí nghiệm trước, tuy nhiên do điều kiện của phòng thí nghiệm

Thịt đỏ cá ngừ Nghiền nhỏ

Phân tích hàm lượng ni-tơ amin và xác định mức độ thủy phân

Chọn nhiệt độ tối ưu

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân.

nên các thí nghiệm sau chỉ tiến hành trong 2 giờ Sau quá trình thủy phân, ta bất hoạtenzyme ở 85-90oC trong 15 phút sau đó ly tâm thu lấy phần dịch rồi đem đi cân vàphân tích để mức độ thủy phân Từ đó đánh giá và chọn tỷ lệ nguyên liệu/nước tối ưu

để tiến hành các thí nghiệm tối ưu hóa các thông số khác

2.2.4.4 Bố trí thí nghiệm để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân

Mô tả thí nghiệm:

Cho vào 5 bình tam giác mỗi bình 20g thịt đỏ cá ngừ đã được nghiền nhỏ bằngmáy xay sau đó bổ sung nước cất theo tỷ lệ nguyên liệu/nước = 1/3 (w/v) vào các bình.Điều chỉnh pH nguyên liệu trong các bình về 2-2.5 Bổ sung enzyme pepsin đã đượctách chiết trước đó vào 5 bình theo tỷ lệ 30% so với nguyên liệu (v/w) Quá trình thủy