Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

Thịt đỏ cá ngừ là phụ phẩm của ngành công nghiệp chế biến cá ngừ. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh thịt đỏ cá ngừ có hàm lượng protein cao, tuy nhiên hiện nay chưa được quan tâm nghiên cứu để chế biến. Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng chế phẩm enzyme pepsin thô. Nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết từ nội tạng cá ngừ để giảm chi phí nghiên cứu và ứng dụng. Kết quả nghiên cứu xác định được hàm lượng protein trong nguyên liệu là 26.95%, điều kiện thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng chế phẩm enzyme pepsin thô (0.0383 Uml) với các điều kiện thích hợp là: tỷ lệ enzymecơ chất = 30% (vw), tỷ lệ phối trộn nguyên liệunước = 13 (wv) ở nhiệt độ 55 o C trong thời gian 4 giờ.

TÓM TẮT LỜI NÓI ĐẦU CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ − − − − − − − − CP: chế phẩm Da: đơn vị khối lượng phân tử kDa: kilo Dalton OD: Optical density – mật độ quang U: Unit – Đơn vị hoạt độ protease UV-Vis: Ultraviolet–visible spectroscopy – quang phổ tử ngoại khả kiến v/w: volume/weigh – thể tích/khối lượng w/v weigh/volume – khối lượng/thể tích Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cá ngừ loại thủy sản có giá trị kinh tế cao kim ngạch xuất lớn Việt Nam: theo Tổng cục thủy sản Việt Nam, sản lượng khai thác cá ngừ tháng đầu năm 2016 ước đạt 9,605 [53] Trong đó, theo Hiệp hội chế biến xuất cá ngừ Việt Nam, giá trị xuất cá ngừ tháng 2/2017 đạt 36.6 triệu USD, tăng 53% so với kỳ năm 2016 [51] Các sản phẩm cá ngừ xuất nước ta bao gồm: đóng hộp, tươi sống, đông lạnh khô Phần thịt sử dụng sản xuất chủ yếu phần thịt trắng, phần thịt đỏ không sử dụng chiếm đến 11% tổng khối lượng cá [21] Trong thịt đỏ cá ngừ có chứa 18.28% protein lượng lớn acid amin thiết yếu như: Isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, tryptophan,…[28] Hiện nhà máy sản xuất sản phẩm từ cá ngừ số tỉnh, thành phố Đà Nẵng, Cà Mau chưa có biện pháp tối ưu để xử lý phần thịt đỏ này, mà sử dụng làm thức ăn chăn nuôi bán đầu mối bán lẻ chợ với giá thành rẻ từ 4.000 - 5.000 đ/kg Thịt đỏ cá ngừ có màu sắc đặc trưng chúng chứa hợp chất mang màu mà chủ yếu myoglobin (Mb) hemoglobin (Hb) Thịt đỏ dễ bị biến đổi thành màu tối oxi hóa nguyên tử sắt (Fe) nhóm hem protein tiếp xúc với oxy để hình thành dạng metMb (Mb-Fe 3+) có màu nâu không mong muốn [20] Ở nước ta chưa có nhiều nghiên cứu [6] tập trung vào việc tận dụng thịt đỏ cá ngừ để sản xuất sản phẩm có giá trị gia tăng Đề tài nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết từ nội tạng cá như: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, tỷ lệ nguyên liệu/nước, thời gian phản ứng, pH nhiệt độ môi trường phản ứng để tạo dịch đạm có hàm lượng dinh dưỡng cao chất lượng đảm bảo với giá thành rẻ Mục tiêu đề tài Mục tiêu đề tài − Xác định thành phần thịt đỏ cá ngừ − Tách chiết chế phẩm enzyme pepsin thô từ nội tạng cá ngừ − Nghiên cứu điều kiện tối ưu để thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết từ nội tạng cá ngừ gồm có: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, tỷ lệ nguyên liệu/nước, thời gian thủy phân nhiệt độ thủy phân Hướng đến sử dụng dịch đạm thủy phân làm thức ăn dinh dưỡng cho người Trang Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô Đối tượng phương pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu − Thịt đỏ cá ngừ - sản phẩm phụ ngành công nghiệp chế biến cá ngừ, đưcọ cung cấp Công ty TNHH MTV đồ hộp Hạ Long − Nội tạng cá ngừ thu mua chợ 3.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp vật lý: xác định nhiệt độ nhiệt kế Phương pháp hóa lý: xác định pH môi trường dịch đạm sau thủy phân Phương pháp hóa sinh: thực phản ứng để thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ chế phẩm enzyme pepsin thô điều kiện thay đổi; xác định thành phần hóa học thịt đỏ cá ngừ protein, độ ẩm, lipid, tro, ni-tơ tổng số, ni-tơ amin Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Ý nghĩa khoa học: Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu thủy phân thịt đỏ cá ngừ để tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao cho người sử dụng Nghiên cứu giúp xác định điều kiện tối ưu để thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết từ nội tạng cá Nghiên cứu tìm thêm hướng việc sản xuất dịch đạm có dinh dưỡng cao, việc tận dụng nội tạng cá ngừ để đưa vào nghiên cứu góp phần vào việc bảo vệ môi trường sống Ý nghĩa thực tiễn: Việt Nam giới có sản phẩm sản xuất từ dịch đạm thủy phân có hàm lượng dinh dưỡng cao giá thành sản phẩm cao Đề tài sử dụng nguyên liệu phụ phẩm phế phẩm ngành công nghiệp thủy sản hạ giá thành sản phẩm Vì đề tài có tính thực tiễn cao, sản phẩm có tính thân thiện với môi trường an toàn cho người sử dụng Kết cấu đồ án tốt nghiệp Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án Lời nói đầu Cam đoan Mục lục Danh mục bảng biểu hình ảnh Danh sách ký hiệu chữ viết tắt Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu phương pháp Trang Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu thịt đỏ cá ngừ 1.1.1 Đặc điểm thịt đỏ cá ngừ Cá ngừ loại thủy sản có giá trị dinh dưỡng kinh tế cao Trong cá ngừ có hai loại thịt thịt trắng thịt đỏ Phần thịt đỏ có vị trí nằm sát dọc theo xương sống, có màu sậm Trong công nghệ chế biến cá, phần thịt đỏ thường phế phẩm vứt bỏ có mùi hương vị thơm ngon phần thịt trắng, phần thịt thường chiếm đến 11% tổng trọng lượng thịt cá [21] Hiện tại, lượng thịt thường sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi với giá thành rẻ 1.1.2 Thành phần thịt đỏ cá ngừ Trong thịt đỏ cá ngừ có chứa lượng lớn protein, acid amine tự do, carbohydrate số chất khoáng Bên cạnh đó, màu sắc thịt đỏ hợp chất mang màu mà chủ yếu myoglobin (Mb) hemoglobin (Hb), hàm lượng chúng thịt đỏ cá ngừ cao gấp lần so với thịt trắng [21] Thịt đỏ dễ bị biến đổi màu sắc oxi hóa nguyên tử sắt nhóm hem protein tiếp xúc với không khí để hình thành dạng metMb (Mb-Fe3+) có màu nâu [20] Trong thịt đỏ cá ngừ có lượng lớn protein, nước chất béo Hàm lượng chất có thịt đỏ cá ngừ thể bảng 1.1 Bảng 1.1 Hàm lượng chất lượng 100g thịt đỏ cá ngừ [35] Thành phần Calorie (kcal/100g) Độ ẩm (g/100g) Protein (g/100g) Chất béo (g/100g) Carbohydrate (g/100g) Hàm lượng 120 69.37 18.28 4.631 0.75 Trang Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô Trong thịt đỏ cá ngừ có lượng lớn acid amin thiết yếu cho thể acid glutamic, leucine, isoleucine Ngoài thịt đỏ có chứa lượng nhỏ histidine, điều kiện thích hợp chúng chuyển hóa thành histamine – chất gây nên tượng dị ứng cho thể người sử dụng Hàm lượng số acid amin có thịt đỏ cá ngừ trình bày bảng 1.2 sau: Bảng 1.2 Hàm lượng số acid amin có thịt đỏ cá ngừ [35] Thành phần Hàm lượng (g/100g khô) Acid glutamic 13.35 Leucine 8.57 Isoleucine Valine 4.24 Lysine 4.17 Histidine 2.38 Tryptophan 0.45 Hàm lượng số chất khoáng có thịt đỏ cá ngừ thể bảng 1.3 sau: Bảng 1.3 Hàm lượng chất khoáng có thịt đỏ cá ngừ [35] Thành phần Tro (g/100g khô) Kali (mg/100g khô) Canxi (mg/100g khô) Natri (mg/100g khô) Sắt (mg/100g khô) Hàm lượng 1.224 238.4 134.4 53.74 11.05 1.2 Tổng quan pepsinogen enzyme pepsin 1.2.1 Pepsinogen Pepsinogen dạng tiền enzyme enzyme pepsin, chúng sản xuất tế bào gốc tuyến oxyntic Pepsinogen thường có biểu mô thành dày tiết dày, chúng hoạt hóa thành pepsin có dự diện HCl [37, trang 6] 1.2.1.1 Cấu trúc phân loại pepsinogen Pepsinogen nhiều loài động vật có xương sống động vật có vú, gia cầm, động vật lưỡng cư cá tách chiết xác định trình tự chuỗi protein DNA Pepsinogen chuỗi protein đơn bao gồm khoảng 370 acid amin, có khối lượng phân tử khoảng 42kDa cấu trúc phân tử có cầu nối disulfua Điểm pH Trang Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô đẳng điện pepsinogen pH 3.7, chúng bền pH đến 9, nhiên pH acid pepsinogen chuyển thành pepsin [37, trang 6] Pepsinogen loài động vật có vú chia thành năm nhóm bao gồm pepsinogen A (PG-A), pepsinogen B (PG-B), pepsinogen F (PG-F), pepsinogen C (PG-C, hay progastricsin) pepsinogen Y (PG-Y hay prochymosin) [30] Sự phân loại pepsinogen loài cá đa dạng Một vài nhà khoa học dựa vào hệ thống phân loại pepsinogen động vật có vú phân chia pepsinogen cá thành loại: PGA, PG-B PG-C [26, 33], số nhà khoa học khác phân thành PG-I, PGII, PG-III, PG-IV [46, 47] Hình 1.1.Cấu trúc phân tử pepsinogen tách chiết từ golden mandarin fish (Siniperca scherzeri) [23] Tuy nhiên, pepsinogen cá có đặc điểm riêng biệt so với pepsinogen từ động vật có vú như: pepsinogen loài cá có điểm đẳng điện pI cao hơn, pH tối ưu cao hơn, số Michaelis khác nhau, nhiệt độ tối ưu thấp độ bền nhiệt thấp [49] 1.2.1.2 Sự chuyển đổi pepsinogen thành pepsin Pepsin số enzyme khác tổng hợp dày thường tồn dạng zymogen (tiền enzyme), chúng chuyển thành dạng hoạt động nhờ có mặt aicd dịch vị dày [37, trang 6] Quá trình hoạt hóa tiền enzyme trình phức tạp bao gồm phản ứng để cắt đứt liên kết thay đổi cấu trúc zymogen, dẫn đến kết làm trung tâm hoạt động enzyme bộc lộ bên [40] Trang Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô Ở pH 2, phản ứng hoạt hóa pepsinogen xảy nhanh không xảy tượng tự thủy phân [31, trang 6] Phản ứng hoạt hóa pepsinogen phản ứng tự xúc tác sản phẩm phản ứng (enzyme pepsin) chất xúc tác cho phản ứng Bằng chứng cho lượng enzyme pepsin vào tốc độ phản ứng hoạt hóa tăng lên Khoảng đến liên kết peptide bị cắt đứt trình hoạt hóa pepsinogen, nhiên có liên kết bị cắt đứt đến liên kết lại vị trí liên kết yếu không liên quan đến trình hoạt hóa pepsinogen [41] Nhìn chung, trình hoạt hóa pepsinogen để tạo thành pepsin phải có liên kết bị cắt đứt pepsin chất xúc tác cho trình Kết trình hoạt hóa pepsinogen 44 acid amin bị loại bỏ, khối lượng phân tử giảm xuống từ 42 Kdal lại 35.5 Kdal điểm pH đẳng điện từ 3.7 thay đổi thành Ngoài ra, pepsinogen lợn gồm có 363 acid amin, chúng hoạt hóa thành pepsin chuỗi polypeptide lại 321 acid amin Trong trình hoạt hóa có 42 acid amin bị có lysine, histidine, arginine [39] 1.2.2 Pepsin 1.2.2.1 Cấu tạo, nguồn gốc phân loại pepsin Pepsin enzyme thuộc họ aspatic protease dày động vật có xương sống Enzyme pepsin thuộc nhóm endopeptidase hoạt động điều kiện acid, chúng giữ vai trò quan trọng trình tiêu hóa động vật có xương sống [27] Cấu trúc chúng gồm chuỗi polypeptide đơn có chứa 321 acid amin, có khối lượng phân tử khoảng 35.5 kDa Pepsin tìm thấy phân lập chủ yếu dịch vị dày số loài người, gia súc, cừu, chim cá Pepsin loài động vật có vú thường có dày (ở niêm mạc dịch vị), nhiên chúng tìm thấy lượng nhỏ máu, nước tiểu Đối với cá, enzyme pepsin thường có dày phát trứng cá hồi hay da cá Có nhiều loại enzyme pepsin khác dày, loại có cấu trúc protein tính chất khác [49] Pepsin tổng hợp tiết màng dày dạng tiền hoạt động gọi pepsinogen (PG) Khi HCl tiết vào dịch dày (lúc pH=1.5-2.0), 44 acid amin phân giải theo tự xúc tác để kích hoạt thành pepsin Cấu trúc pepsin từ loài động vật có vú miêu tả chi tiết, pepsin từ cá chưa nghiên cứu sâu rộng Nghiên cứu phát cấu trúc không gian vùng trung tâm hoạt động thành phần amino acid pepsin từ cá thu Trang Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô gần giống với pepsin từ lợn (57,7% chuỗi đồng nhất) Pepsin cá thu chuỗi đơn protein (một monome) hai vùng xoắn cuộn tương đồng phân chia nếp gấp sâu [31] Vùng xúc tác pepsin hình thành vùng tiếp xúc hai vùng có chứa hai gốc aspartic acid Asp 32 Asp 215 vùng Trong hoạt động xúc tác pepsin, phân tử nước có nhiệm vụ hoạt hóa hay kìm hãm hoạt động nhóm carboxyl Asp 215 Asp 32 cách độc lập để bẽ gãy hay giữ nguyên liên kết peptide phân tử protein [49] Hình 1.2 Cấu trúc pepsin tách chiết từ Atlantic cod (Gadus morhua) [31] Danh pháp phân loại pepsin dựa đặc điểm riêng biệt enzyme hoạt độ, độ bền, động học, thành phần loại enzyme bao gồm vùng xúc tác chứa gốc aspartate, thoái hóa protein cấu trúc bậc Phân loại enzyme pepsin từ phân loại pepsinogen tương ứng 1.2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme pepsin Hoạt độ pepsin đo khả phân giải protein chịu ảnh hưởng pH, nhiệt độ chất ức chế a) pH Cả pH tối ưu (giá trị pH cho hoạt động xúc tác hiệu nhất) pH ổn định (giá trị pH giữ độ bền enzyme) có ảnh hưởng lớn đến hoạt động pepsin cá Khi pH xa dần giá trị tối ưu độ hoạt độ pepsin giảm dần El-Beltagy cộng (2004) nghiên cứu pepsin I II từ loài cá rô phi thấy hai loại có pH tối ưu 2.5 chứng minh xa pH tối ưu hoạt lực pepsin giảm [24] Trang Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô Nhìn chung, cá có loại pepsin, pH tối ưu chúng gần giống Tuy nhiên, điều không áp dụng cho số loài cá cá trứng Bắc cực Như vậy, pepsin chủ yếu bền điều kiện pH thấp Pepsin loài protease ưa acid độ bền giảm protein bị biến tính pH 6.0 [43] Theo Sitthipong Nalinanon (2010) [38], pH tối ưu enzyme pepsin từ nội tạng cá ngừ vây dài (Thunnus alalunga) cá ngừ vằn (Katsuwonus pelamis) 2.5, pepsin loài cá này, pH tối ưu chúng nằm khoảng đến 2.5 b) Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn lên hoạt động pepsin cá Cũng pH, nhiệt độ tối ưu khoảng ổn định nhiệt quan trọng Nhiệt độ tối ưu enzyme cá nằm khoảng 30oC đến 55oC Khi nhiệt độ xa giá trị tối ưu, hoạt độ enzyme giảm Nhiệt độ tối ưu pepsin cá phụ thuộc chủ yếu vào loài cá (cá sống vùng nước nóng hay nước lạnh) Các loài cá vùng nước lạnh có nhiệt độ tối ưu thấp loài sống vùng nước nóng Hoạt độ pepsin I II từ vùng nước mặn nóng tối ưu nhiệt độ 40 oC 55oC, vùng nước lạnh nhiệt độ tối ưu hai loại pepsin 38oC 43oC [49] Nhiệt độ cao ảnh hưởng đến độ bền enzyme pepsin tùy thuộc vào loài cá Tuy nhiên, pepsin từ loài nước lạnh dễ bị ảnh hưởng nhiệt độ cao Nhiệt độ cao làm biến tính pepsin phá hủy cấu trúc Theo Sitthipong Nalinanon (2010) [38] nhiệt độ tối ưu enzyme pepsin từ nội tạng cá ngừ vây dài (Thunnus alalunga) 50oC c) Các chất ức chế Pepstatin A (một chất kìm hãm hoạt động aspartic proteinase) cạnh tranh với chất pepsin ngăn cản gắn enzyme vào chất, làm ức chế hoạt động xúc tác enzyme [22, trang 40] Không phải tất chất ức chế protease có ảnh hưởng ức chế lên pepsin Một số chất tiêu biểu phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), chất ức chế serine protease; ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), chất ức chế metalloenzyme tác dụng kìm hãm enzyme pepsin [19] Tuy nhiên, số chất hóa học có khả ức chế hoạt động enzyme pepsin Các chất có khả ức chế hoạt động pepsin : Sodium dodecyl sulfate (SDS) 0.05-0.1% (w/v) cysteine nồng độ 5-50 mM [37] có tác dụng kìm hãm lên pepsin từ loài cá thu ngừ (Thunnus alalunga) cá ngừ vằn (Katsuwonus Trang Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô pelamis) cá ngừ bò (Thunnus tonggol) Các hợp chất methanol, ethanol, amylalcol ức chế hoạt động pepsin nồng độ thấp, mức độ ức chế loại hợp chất alcohol tăng theo kích thước phân tử chúng [45] Adenosine tri phosphate (ATP), molybdate, NaCl, MgCl 2, CaCl2 ảnh hưởng lên hoạt động xúc tác pepsin từ cá thu ngừ, cá ngừ đuôi dài, cá bơn cá đuôi chuột [36] 1.2.3 Ứng dụng công nghiệp enzyme pepsin − Chiết xuất Collagen − Nghiên cứu y học: Pepsin sử dụng việc điều trị vấn đề tiêu hóa, khử trùng chữa bệnh bệnh khó tiêu, đau dày, nôn mửa dai dằng, bệnh tiêu chảy trẻ con, số bệnh ung thư − Sản xuất phô mai − Sản xuất cá hộp − Xử lý chế biến cá [49] 1.3 Tổng quan protein trình thủy phân protein 1.3.1 Protein Protein cá polymer phân tử lớn tạo thành từ monomer mà chủ yếu L-acid amin kết hợp với qua liên kết peptide [7, trang 10] 1.3.2 Quá trình thủy phân protein Quá trình thủy phân protein trình cắt mạch phân tử peptid liên kết peptid tạo phân tử có kích thước nhỏ như: peptone, polypeptide, peptide acid amin [7, trang18] Trong trình thủy phân protein, liên kết peptid bị cắt đứt theo trình tự để tạo thành phân tử có kích thước khác nhau: Protein Polypeptide Peptide Acid amin Sản phẩm trình thủy phân protein polypeptide, peptide, acid amin lượng nhỏ amoniac Hầu hết acid amin sản phẩm tạo thành chủ yếu L-α amino acid [7, trang 13] 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein enzyme 1.3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ chất nồng độ enzyme đến phản ứng thủy phân protein enzyme Ở giai đoạn đầu phản ứng, nồng độ enzyme thấp tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc tuyến tính với nồng độ chất [2, trang 41] Khi tăng lượng chất Trang 10 Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Food Technology, Songkla University Nalinanon S., Soottawat Benjakul, Hideki Kishimura (2010) Biochemical properties of pepsinogen and pepsin from the stomach of albacore tuna (Thunnus alalunga) Food Chemistry, Vol 121, pp 49–55 Rajagopalan T.G., William H Stein and Stanford Moore (1966) The Inactivation of Pepsin by Diazoacetylnorleucine Methyl Ester J Biol Chem, Vol 241(18), pp 4295-4297 Richter C., Tanaka T And Rickey Y Yada R.Y (1998) Mechanism of activation of the gastric aspartic proteinases: pepsinogen, progastricsin and prochymosin Biochem J., Vol 335, pp 481-490 Roger M Herriott (2005) Pepsinogen and Pepsin The Journal of General Physiology, Vol 5, pp 57-76 Sofiane Ghorbel, Nabil Souissi, Yosra Triki-Ellouz, Laurent Dufossé, Fabienne Guérard and Moncef Nasri (2005) Preparation and testing of Sardinella protein hydrolysates as nitrogen source for extracellular lipase production by Rhizopus oryzae World Journal of Microbiology and Biotechnology, vol 21, 33-38 Squires E.J., Haard N.F., Feltham L.A (1986) Gastric proteases of the Greenland cod Gadus ogac I Isolation and kinetic properties Biochem Cell Biol, Vol 64, pp 205-214 Syama Dayal J., Ponniah A.G., Imran Khan H., Madhu Babu E.P., Ambasankar K.and Kumarguru Vasagam K.P (2013) Shrimps – a nutritional perspective Current science, Vol 104, No 11, pp 1487-1491 Tang J (1965) Competitive inhibition of pepsin by aliphatic alcohols The Journal of Biological Chemistry J Biol Chem., Vol 240(10), pp 3810-3815 Tanji M., Yakabe E., Kageyama T., Yokobori S., Ichinose M., Miki K., Ito H., Takahashi K (2007) Purification and characterization of pepsinogens from the gastric mucosa of African coelacanth, Latimeria chalumnae, and properties of the major pepsins Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, Vol 146(3), pp 412420 Wu T., Sun L., Du C., Cai Q., Zhang Q., Su W., Cao M (2009) Identification of pepsinogens and pepsins from the stomach of European eel (Anguilla anguilla) Food Chemistry, Vol 115(1), pp 137-142 Yu S.Y., Tan L.K (1990) Acceptability of crackers (‘Keropok’) with fish protein hydrolysate International Journal of Food Science & Technology, Vol 25, pp.204-208 Trang 37 Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô [49] Zhao L., Budge S.M., Ghaly A.E., Brooks M.S and Dave D (2011) Extraction, Purification and Characterization of Fish Pepsin: A Critical Review J Food Process Technol, Vol 2(6) 1000126 [50] Широнина А Ю (2015) Совершенствование технологии протеолиза рыбных белков и изучение коллоидно-химических свойств гидролизатов Диссертация на соискание учёной степени кандидата технических наук, Мурманск 2015 Tài liệu internet [51] http://vasep.com.vn/Tin-Tuc/1211_47480/Xuat-khau-ca-ngu-cua-Viet-Nam-tang16.htm (Truy cập ngày 28/04/2017) [52] http://www.sigmaaldrich.com/life-science/learning-center/life-sciencevideo/universal-protease.html (Truy cập ngày 28/05/2017) [53] https://tongcucthuysan.gov.vn/vi-vn/khai-th%C3%A1c-th%E1%BB%A7y-s %E1%BA%A3n/doc-tin/005295/2016-06-08/tong-san-luong-thuy-san-5-thangdau-nam-2016-tang-19 (Truy cập ngày 28/04/2017) Trang 38 PHỤ LỤC SỐ LIỆU CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1.1 Đường chuẩn Tyrosine hoạt độ enzyme pepsin Bảng Các thông số để thiết lập đường chuẩn Tyrosine [Tyrosine] (mM) 0.1 0.2 0.4 0.8 HCl 0,1M (ml) 0.9 0.8 0.6 0.2 Tyrosine 1mM (ml) 0.1 0.2 0.4 0.8 A660nm 0.122 0.251 0.529 1.105 1.314 Hình Đường chuẩn Tyrosine Bảng Độ hấp thụ quang mẫu enzyme từ nguyên liệu tươi nguyên liệu đông lạnh bước sóng 660nm (mẫu pha loãng lần trước đo độ hấp thụ) OD 660 nm Lần Lần Lần Enzyme từ nguyên liệu tươi 0.132 0.156 0.153 Enzyme từ nguyên liệu đông lạnh 0.175 0.16 0.148 Bảng Hoạt độ mẫu enzyme từ nguyên liệu tươi nguyên liệu đông lạnh Mẫu Lần Lần Lần Trung bình Enzyme từ nguyên liệu tươi (U/ml) 0.0452 0.0415 0.0385 0.0417 ± 0.0033 Enzyme từ nguyên liệu đông lạnh (U/ml) 0.0345 0.0405 0.0385 0.0383 ± 0.0032 1.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình thủy phân Bảng Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ enzyme đến trình thủy phân Tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (v/w) Hàm lượng ni-tơ amin (%) Mẫu 0% 20% 25% 30% 35% 40% 45% Lần 0.368 0.597 0.603 0.637 0.583 0.568 0.58 Lần 0.376 0.566 0.573 0.624 0.578 0.59 0.571 Lần 0.385 0.588 0.621 0.624 0.557 0.581 0.558 Phụ lục 39 Mức độ thủy phân (%) Trung bình 0.376 0.584 0.599 0.628 0.573 0.58 0.569 Lần 0.443 6.23 6.41 7.25 5.88 5.5 5.79 Lần 0.66 5.46 5.64 6.92 5.77 6.06 5.57 Lần 0.88 6.01 6.84 6.92 5.23 5.83 5.25 Trung bình 0.663 5.9 6.3 7.03 5.62 5.8 5.54 Bảng Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/nước đến trình thủy phân Tỷ lệ nguyên liệu/nước (v/w) Hàm lượng ni-tơ amin (%) Mức độ thủy phân (%) Mẫu 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 Lần 0.518 0.513 0.641 0.558 0.548 0.51 0.501 Lần 0.551 0.548 0.618 0.593 0.559 0.51 0.524 Lần 0.518 0.536 0.583 0.57 0.548 0.533 0.536 Trung bình 0.529 0.532 0.614 0.574 0.552 0.518 0.52 Lần 4.24 4.12 7.35 5.25 4.04 3.81 Lần 5.08 6.77 6.14 5.28 4.04 4.39 Lần 4.24 4.7 5.88 5.56 4.62 4.7 Trung bình 4.52 4.61 6.67 5.65 5.09 4.23 4.3 Bảng Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân Thời gian (giờ) Hàm lượng ni-tơ amin (%) Phụ lục Mẫu Lần 0.328 0.525 0.551 0.569 0.582 0.591 Lần 0.368 0.516 0.529 0.551 0.569 0.564 Lần 0.333 0.529 0.543 0.551 0.573 0.578 Trung bình 0.343 0.523 0.541 0.557 0.575 0.578 40 Mức độ thủy phân (%) Lần 4.42 5.08 5.53 5.86 6.09 Lần 4.19 4.52 5.08 5.53 5.4 Lần 4.52 4.87 5.08 5.63 5.76 Trung bình 4.38 4.82 5.23 5.67 5.75 Bảng Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân Nhiệt độ (oC) Hàm lượng ni-tơ amin (%) Mức độ thủy phân (%) Mẫu 35 40 45 50 55 60 Lần 0.507 0.501 0.487 0.527 0.548 0.523 Lần 0.49 0.527 0.511 0.519 0.531 0.506 Lần 0.49 0.518 0.479 0.519 0.54 0.506 Trung bình 0.496 0.515 0.492 0.522 0.54 0.512 Lần 3.96 3.81 3.46 4.47 4.37 Lần 3.54 4.47 4.07 4.27 4.57 3.94 Lần 3.54 4.24 3.26 4.27 4.8 Trung bình 3.68 4.17 3.6 4.34 4.79 3.94 4.08 1.3 Hàm lượng ni-tơ amin mức độ thủy phân dịch thủy phân điều kiện tối ưu Hàm lượng ni-tơ amin (%) Lần Lần Lần Trung bình 0.544 0.509 0.527 0.527 Mức độ thủy phân (%) Lần Lần Lần Trung bình 4.91 4.01 4.46 4.46 PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU HÓA SINH 2.1 Phương pháp xác định hàm lượng ni-tơ tổng số protein thô theo phương pháp Kjeldahl 2.1.1 Nguyên tắc Phụ lục 41 Tất dạng ni-tơ có thể hay mô gọi ni-tơ tổng số Ni-tơ có thành phần amino acid protein ni-tơ protein Ni-tơ thành phần protein muối vô cơ, acid nitric, amino acid tự do, pepit, ure dẫn xuất ure, alkaloid, purin pyrimidin ni-tơ phi protein Ni-tơ tổng số = ni-tơ protein + ni-tơ phi protein Trước tiên mẫu vô hóa H 2SO4 đặc nhiệt độ cao có chất xúc tác Các phản ứng trình vô hóa xảy sau: H2SO4  2H2O + 2SO2 +O2 Oxi tạo thành phản ứng lại oxi hóa nguyên tố khác Các phân tử chứa ni-tơ tác dụng H2SO4 tạo thành NH3 Ví dụ protein bị thủy phân thành amino acid , C H amino acid tạo thành CO2 H2O, ni-tơ giải phóng dạng NH3 kết hợp với H2 SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan dung dịch 2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4 Các nguyên tố P, K, Ca, Mg….chuyển thành dạng oxit: P2O5, MgO, CaO, K2O Đuổi amoniac khỏi dung dịch NaOH: (NH4)2SO4 + 2NaOH  Na2SO4 + H2O + 2NH3 NH3 bay với nước sang bình hứng, bình hứng chứa H3BO3 NH4OH + H3BO3  (NH4)2B4O7 + 7H2O 2.1.2 Dụng cụ − − − − − − − − − − − − − − Máy cất đạm Bình Kjeldahl, dung tích 100, 250ml Bình định mức dung tích 100ml Ống đong dung tích 10, 100ml Buret 25ml Pipet 10, 20, 50ml Bình nón, dung tích 250ml Chén cân Phễu thủy tinh Thìa nhựa Bếp điện Giấy lọc không tro Giấy đo pH Cân phân tích, độ xác 0.001 g 2.1.3 Hóa chất − Axit sunfuric (H2SO4) đậm đặc dung dịch 0.1N − Natri hydroxyt (NaOH), dung dịch 33% dung dịch 0.1N − Hỗn hợp xúc tác: đồng sunfat (CuSO 4) + Kali sunfat (K2SO4), tỷ lệ 1/10 (theo khối lượng) − Chỉ thị hỗn hợp: 200mg đỏ metyl 100mg xanh metylen hòa tan 200ml etanol (C2H5OH) 96% Phụ lục 42 − Phenolphtalein, dung dịch 1% etanol 60% 2.1.4 Cách tiến hành Cân xác 0.3 – 0.5g mẫu thử vào mẩu giấy lọc không tro, cuộn lại, cho vào bình Kjeldahl cho mẫu thử không dính vào cổ bình, cho tiếp 1g hỗn hợp xúc tác 10ml axit sunfuric đậm đặc − Nếu mẫu thử loại mắm đặc: cho mẫu thử vào chén cân với thìa nhựa lấy khoảng 0.5g mẫu thử vào mẩu giấy lọc không tro, cuộn lại, cho vào bình Kjeldahl để vô hóa Thìa nhựa lại đặt vào bình cân, cân khối lượng lại M Hiệu số hai lần cân khối lượng mẫu thử lấy để phân tích − Nếu mẫu thử nước mắm: Dùng pipet lấy xác 10ml nước mắm lọc cho vào bình định mức dung tích 200ml, thêm nước cất đến vạch mức, lắc Hút xác 20ml dịch pha loãng, cho vào bình Kjeldahl, thêm chất xúc tác – 5ml axit sunfuric đặc vào để vô hóa Dùng phễu nhỏ đậy bình Kjeldahl, đặt bình nghiêng 40 độ bếp điện tủ hốt Đun 15-20 phút cho chất lỏng bình không sủi phồng, không bắn lên cổ bình (có thể để qua đêm đun) Sau đặt bình thấp gần bếp dịch vô hóa bình suốt xanh (không có màu vàng nhạt) mặt bình hoàn toàn Ngừng đun, để nguội Trong trình đun, thấy mẫu không trắng, ngừng đun, để nguội, cho thêm khoảng 0.5g chất xúc tác vào tiếp tục đun Nếu thấy mẫu đen mà cạn, lấy để nguội, cho thêm khoảng 3ml axit sunfuric đậm đặc vào tiếp tục đun dung dịch đạt yêu cầu Lấy xác lượng axit sunfuric 0.1N không lớn 25ml (tùy theo loại mẫu thử) giọt thị hỗn hợp vào bình nón dung tích 250ml, đặt bình vào ống sinh hàn máy cất đạm cho đầu ống sinh hàn ngập hẳn vào dung dịch Cho cẩn thận dịch vô hóa vào bình cất, tráng bình Kjeldahl nhiều lần nước cất nước tráng hết phản ứng axit (thử giấy đo pH) Cho tiếp vào bình cất giọt phenolphtalein 1% dung dịch natrihydroxyt 33% dung dịch bình chuyển thành màu hồng, cho tiếp vào dung dịch kiềm, tráng nước cất cho kiềm phễu khóa máy lại Cuối cho lớp nước cất cao 1.5 – 2cm phễu để kiểm tra độ kín máy (Ghi toàn lượng nước cất dùng để biết lượng nước cất cho vào chuẩn độ mẫu trắng) Cho nước lạnh chảy qua ống sinh hàn bắt đầu chưng cất liên tục 40 phút kể từ dung dịch bình bắt đầu sôi Hạ bình hứng để ống sinh hàn lên khỏi mặt nước, dùng bình tia rửa đầu ống sinh hàn, tiếp tục chưng cất vài phút Sau hứng nước chưng chảy đầu ống sinh hàn, thử giấy đo pH thấy phản ứng kiềm Dùng natri hydroxyt 0.1N chuẩn độ lượng axit dư bình hứng dung dịch bình chuyển từ màu tím sang xanh mạ Phụ lục 43 Tiến hành xác định mẫu trắng với tất lượng hóa chất nước cất bước thí nghiệm trên, mẫu thử 2.1.5 Tính kết Hàm lượng nitơ tổng số (X7) tính phần trăm theo công thức: X7 = (V1 − V2 ) * 0.0014 * 100 m Trong đó: V1 – Thể tích dung dịch natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính ml; V2 – Thể tích dung dịch natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính ml; m – khối lượng mẫu thử, tính g; 0,0014 – Số g nitơ tương ứng với 1ml dung dịch natri – hydroxyt 0,1N; 100 – Hệ số tính phần trăm Chú thích: Đối với nước mắm, mẫu thử pha loãng 20 lần, lấy 20ml dịch pha loãng để xác định Hàm lượng nitơ tổng số (X7) tính g/l theo công thức: X7 = (V1 − V2 ) * 0.0014 * 20 * 1000 = 2.8(V1 − V2 ) 10 Trong đó: 20 – Độ pha loãng nước mắm; 10 – Thể tích nước mắm pha loãng lấy để xác định, tính ml; 1000 – Hệ số tính g/l; Các ký hiệu khác ghi Phương pháp tính hàm lượng prôtein thô Hàm lượng nitơ trung bình phân tử protein sản phẩm thủy sản 16% Vì hàm lượng protein thô mẫu thử hàm lượng nitơ tổng số nhân với hệ số 6.25 Hàm lượng protein thô (X8) tính phần trăm theo công thức: X8 = X7 6.25 Trong đó: X7 – Hàm lượng nitơ tổng số, tính phần trăm; 6.25 – Hệ số chuyển nitơ tổng số protein thô (100:16 = 6.25) 2.2 Phương pháp xác định hàm lượng chất béo có nguyên liệu 2.2.1 Nguyên tắc Chất béo nguyên liệu trích ly ete etylic thiết bị chiết Soxhlet Dung môi làm bay lượng chất béo lại xác định cách cân Phụ lục 44 2.2.2 Dụng cụ − − − − − − − Thiết bị chưng cất Soxhlet Cối chày Nồi cách thủy Cân phân tích Bình hút ẩm Giấy lọc Bông thấm nước 2.2.3 Hóa chất − Natri sulfat (Na2SO4) khan canxi sulfat (CaSO4) khan − Ete etylic (C2H5OC2H5), tinh khiết phân tích 2.2.4 Cách tiến hành Cân từ 5g đến 10g mẫu thử chuẩn bị, xác đến 0.001 g, cho vào cối sứ nghiền với khoảng 20g đến 30g natri sulfat khan canxi sulfat khan để thu hỗn hợp bột khô Chuyển hết hỗn hợp thu vào gói giấy lọc kín đầu, dùng thấm ete lau cối chày sứ cho vào ống giấy, sau gói kín đầu lại (gói giấy phải bỏ lọt vào bình chiết thiết bị phải thấp chiều cao ống xiphông) Gói tiếp lần giấy lọc nữa, ý không để hai mép giấy hai lần gói trùng vào Đặt gói mẫu vào bình chiết thiết bị nối với bình cầu (đã biết trước khối lượng) Cho ete vào bình chiết cho vừa ngập ống gói mẫu Ngâm mẫu ete khoảng đến ngâm qua đêm Sau thời gian ngâm mẫu, nâng ống sinh hàn lên, cho thêm ete vào bình chiết vừa đủ để chảy xuống bình cầu Chờ cho ete chảy hết, cho tiếp ete vào đến khoảng nửa chiều cao ống xiphông Lắp ống sinh hàn vào cho nước lạnh chảy qua Chưng cất nồi cách thủy khoảng 10 đến 12 Chú ý điều chỉnh nồi cách thủy cho ete tuần hoàn từ bình chiết xuống bình cầu ngược lại khoảng lần đến lần giờ, tránh đun nhiệt độ cao (trên 60oC) làm hao hụt dung môi Sau thời gian chưng cất, chờ cho dung môi chảy hết xuống bình cầu ngừng đun, để nguội tháo ống sinh hàn lấy gói mẫu khỏi bình chiết Lắp lại ống sinh hàn vào chưng cất tiếp cho dung môi ngưng hết lên bình chiết máy cất Ngừng đun lấy bình cầu ra, cho vào tủ sấy sấy nhiệt độ 50 oC đến 60oC 30 phút đến 40 phút Đem để nguội bình hút ẩm 30 phút cân, xác đến 0.001 g Lại sấy tiếp 15 để nguội cân Lặp lại thao tác đến thu khối lượng không đổi Khối lượng chất béo tính lấy khối lượng bình cầu chứa chất béo sấy khô trừ khối lượng bình cầu 2.2.5 Tính kết Hàm lượng chất béo, X, biểu thị phần trăm khối lượng (%), theo công thức: Phụ lục 45 X= m * 100 m Trong đó: m1 – khối lượng chất béo thu được, tính gam (g) m – khối lượng mẫu thử, tính gam (g) 2.3 Phương pháp xác định hàm lượng tro tổng số 2.3.1 Nguyên tắc Mẫu nung nhiệt độ khoảng từ 500 oC đến 550oC để đốt cháy hết hợp chất hữu cân phần tro lại 2.3.2 Dụng cụ − − − − − − − − − Chén nung Lò nung, điều chỉnh nhiệt độ, xác đến ± 10oC Tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ, xác đến ± 2oC Cân phân tích, cân xác đến 0.001 g Bình hút ẩm Cốc thủy tinh, dung tích 250ml Phễu thủy tinh Đũa thủy tinh Giấy lọc không tro 2.3.3 Hóa chất Hydro peroxit (H2O2) axit nitric (HNO3) đậm đặc 2.3.4 Cách tiến hành Cân 10g đến 15g mẫu thử, xác đến 0.001 g, cho vào chén nung biết trước khối lượng Mẫu thử đốt từ từ bếp điện có lót lưới amiăng cháy hoàn toàn thành than đen (khi đốt không để mẫu thử cháy thành lửa) Cho chén chứa mẫu thử vào lò nung, nâng nhiệt độ từ từ đến khoảng từ 500 oC đến 550oC giữ nhiệt độ khoảng đến đến mẫu thử thành tro trắng Nếu sau thời gian trên, tro đen lấy chén nung ra, để nguội cho thêm vài giọt hydro peroxit axit nitric đậm đặc tiếp tục nung mẫu đến thành tro trắng Tắt điện lò nung, chờ cho nhiệt độ hạ bớt lấy chén tro ra, cho vào bình hút ẩm, để nguội 30 phút cân, xác đến 0.001 g Tiếp tục nung nhiệt độ 30 phút, để nguội cân Tiến hành nung cân thu khối lượng không đổi 2.3.5 Tính kết Hàm lượng tro tổng số, X1, biểu thị phần trăm khối lượng, tính theo công thức: (G1 − G) × 100 X1 = m đó: Phụ lục 46 G – khối lượng chén nung, tính gam (g) G1 – khối lượng chén nung tro tổng số, tính gam (g) M – khối lượng mẫu thử, tính gam (g) 2.4 Phương pháp xác định hàm lượng ẩm 2.4.1 Nguyên tắc Dùng nhiệt để loại bỏ nước khỏi mẫu thử Hiệu số khối lượng mẫu thử trước sau sấy khô lượng nước có mẫu thử 2.4.2 Dụng cụ − − − − − Chén cân có nắp mài, dung tích 30ml Bình hút ẩm Cân phân tích, độ xác 0.001g Tủ sấy, độ xác ±2oC Đũa thủy tinh nhỏ, dẹt đầu 2.4.3 Cách tiến hành Cân xác - 5g mẫu thử cho vào chén cân, dùng đũa thủy tinh trộn mẫu thử, dàn thành lớp mỏng Cho tất vào tủ sấy sấy 60-80 oC giờ, sau nâng nhiệt độ lên 100-150oC giữ nhiệt độ Chú ý sấy, sau lại dùng đũa thủy tinh nghiền nhỏ cục ra, đảo đều, dàn mỏng sấy Sau sấy giờ, đậy nắp chén cân lại, cho vào bình hút ẩm, để nguội 30 phút, đem cân (cả đũa thủy tinh) Lại sấy tiếp 30 phút nữa, để nguội đem cân Tiến hành sấy cân khối lượng hai lần cân liên tiếp chênh lệch không 0.001g 2.4.4 Tính kết Hàm lượng nước (X1) tính phần trăm theo công thức: X1 = (G1 − G2 ) 100 m , với m = G1 - G Trong đó: G – Khối lượng chén cân + nắp chén + đũa thủy tinh, tính g; G1 – k hối lượng chén cân + nắp chén + đũa thủy tinh + mẫu thử trước sấy mẫu, tính g; G2 – khối lượng chén cân + nắp chén + đũa thủy tinh + mẫu thử sau sấy mẫu, tính g; m – khối lượng mẫu thử, tính g; 100 – Hệ số tính phần trăm 2.5 Xác định hàm lượng ni-tơ amin phương pháp chuẩn độ formol 2.5.1 Nguyên tắc Trong phân tử acid amin, peptide… có chứa nhóm –NH nhóm –COOH nên dung dịch tính bazơ hay acid Nếu acid amin tác dụng với formoldehyt Phụ lục 47 tạo thành nhóm –N=CH2 ( metylic) làm cho tính bazơ yếu thể tính acid Do chuẩn chất chuẩn kiềm chất thị acid-bazơ để kết thúc phản ứng 2.5.2 Dụng cụ − − − − − − − − − Bình định mức dung tích 100, 250, 1000ml Bình nón, nút mài dung tích 100, 250ml Cốc thủy tinh dung tích 100, 250ml Buret 25ml Pipet 1, 10, 25ml Phễu thủy tinh Cân phân tích có độ xác 0.001g Đũa thủy tinh Giấy lọc 2.5.3 Hóa chất − − − − − Natri hydroxyt (NaOH), dung dịch 0.1N Bromothimol xanh, dung dịch 0.05% etanol 60% Phenolphtalein, dung dịch 0.5% etanol 60% Thimolphtalein, dung dịch 1% etanol 60% Foocmon tinh khiết, dung dịch trung tính 30%, chuẩn bị sau: 50 thể tích dung dịch foocmon 30% hòa tan với thể tích dung dịch thimolphtalein 1%, thêm dung dịch natri hydroxyt 0.1N dung dịch vừa có màu xanh nhạt − Chỉ thị hỗn hợp: Trộn lẫn thể tích dung dịch bromo-thimol xanh 0.05% với thể tích dung dịch phenolphtalein 0.5% − Natri hydrophotphat, dung dịch M/15(A): cân xác 2.59g Na2HPO4.12H2O (hoặc 1.1876g Na2HPO4.2H2O) hòa tan bình định mức dung tích 100ml, thêm nước cất đến vạch mức − Kali dihydrophophat, dung dịch M/15(B): cân xác 0.707 KH 2PO4, hòa tan bình định mức dung tích 100ml, thêm nước cất đến vạch mức − Dung dịch đệm pH = 7.0: Hòa lẫn 61.2ml dung dịch (A) 38.8ml dung dịch (B) − Dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 7.0: Cho vào bình nón dung tích 100ml : 20 ml dung dịch đệm pH = 7.0 0,1ml dung dịch thị hỗn hợp, dung dịch có màu xanh mạ − Dung dịch đệm pH = 9.2: Cân xác 1.9018g natri tetraborat (Na 2B4O7.10H2O) hòa tan bình định mức dung tích 100ml, thêm nước cất đến vạch mức − Dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 9.2: Cho vào bình nón dung tích 100ml: 20ml dung dịch đệm pH = 9.2, 1ml dung dịch thị hỗn hợp Dung dịch có màu tím 2.5.4 Cách tiến hành Cân xác 10 – 15g mẫu thử cho vào cốc thủy tinh dung tích 100ml Dùng nước cất hòa tan mẫu chuyển toàn (cả nước tráng cốc) vào bình định mức dung tích 250ml, thêm nước cất đến khoảng 200ml Sau đó, lắc phút, để yên phút, lặp lại lần Thêm nước cất đến vạch mức, lắc lọc Phụ lục 48 Dùng pipet lấy xác 20ml dịch lọc vào bình nóng dung tích 250ml, thêm 1ml dung dịch thị hỗn hợp, trung hòa dịch lọc dung dịch có màu giống dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 7.0 Sau dùng buret cho thêm 20ml dung dịch foocmon trung tính 30% vào đậy nút bình lại, lắc đều, để yên phút Chuẩn độ dung dịch natri hydroxyt 0.1N dung dịch có màu giống dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 9.2 Tiến hành xác định mẫu trắng với tất lượng hóa chất bước thử nghiệm trên, thay dịch mẫu thử 20ml nước cất 2.5.5 Tính kết Hàm lượng nitơ-amoniac (X10) tính phần trăm theo công thức: X10 = (V1 − V2 ) ⋅ 0.0014 ⋅ 250 ⋅ 100 20 ⋅ m Trong đó: V1 – Thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính ml V2 – Thể tích dung dịch NaOH 0.1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính ml m – Khối lượng mẫu thử, tính g 0.0014 – Số g nitơ tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0.1N 250 – Thể tích toàn dịch lọc, tính ml 20 – Thể tích dịch lọc để xác định, tính ml 100 – Hệ số tính phần trăm 2.6 Xác định hoạt độ enzyme pepsin phương pháp Anson cải tiến 2.6.1 Nguyên tắc Pepsin enzyme thuộc họ protease Dưới tác dụng pepsin, casein bị phân giải thành đoạn peptide ngắn acid amin có tyrosine Xác định lượng tyrosine tạo thành thuốc thử Folin, phản ứng tyrosine làm Folin chuyển thành màu xanh hấp thu quang mạnh bước sóng 660nm Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân tác dụng enzyme 2.6.2 Dụng cụ − − − − − − − − − Ống nghiệm Giấy lọc Bể ổn nhiệt Tủ ấm Cối sứ Máy đo quang phổ UV-Vis Máy đo pH Bình định mức 50 ml, 100 ml, 1000 ml Pipet ml, ml, 10 ml, 25 ml 2.6.3 Hóa chất − HCl 0.1M Phụ lục 49 − − − − − − − Na2CO3 0.4M Dung dịch Trichloracetic 0.4M Tyrosin tinh khiết NaOH 0.1M Thuốc thử Folin H3PO4 1/30M Dung dịch Casein 1%: Cân 0.5g casein từ sữa Thêm 12.5 ml dung dịch NaOH 0.1 M, đun nóng bồn nước nhiệt độ 90 – 95 oC 10 phút (tuyệt đối không để nước sôi) Sau làm lạnh, điều chỉnh pH đến 2.0 dung dịch acid phosphoric 1/30 M Thêm nước cất vừa đủ 50ml 2.6.4 Cách tiến hành 1.6.4.1 Dựng đường chuẩn Tyrosin Pha dung dịch Tyrosin 1mM: Cân xác 90.595mg Tyrosin thêm dung dịch HCl 0.1M cho vừa đủ 500ml Từ dung dịch pha tiếp dung dịch Tyrosin nồng độ khác nhau: 0; 0.1; 0.2; 0.4; 0.8 mM Cách pha theo bảng sau: [Tyrosine](mM) 0.1 0.2 0.4 0.8 HCl 0,1M (ml) 0.9 0.8 0.6 0.2 Tyrosine 1mM (ml) 0.1 0.2 0.4 0.8 Thêm ml dung dịch Na2CO3 0.4 M vào ml dung dịch Tyrosin (các nồng độ khác trên) thêm ml thuốc thử Folin pha loãng lần vào dung dịch hỗn hợp Sau trộn đều, để ổn định dung dịch 15 phút Đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 660 nm (ghi nhận kết A0; A1; A2; A3; A4; A5) Dựng đường chuẩn theo hàm lượng µg Tyrosin độ hấp thụ 1.6.4.2 Xác định hoạt tính enzyme protease Cho ml dung dịch chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ nhiệt độ 50 ± 0.5oC 10 -15 phút Sau thời gian ủ, cho ml dung dịch enzyme vào lắc Đem ủ hỗn hợp nhiệt độ 37 ± 0.5oC 60 phút Sau đó, cho vào hỗn hợp ml dung dịch acid Trichloracetic 0.4M Để ổn định dung dịch 15 phút, sau lọc dung dịch qua giấy lọc để loại tủa Cho ml dung dịch Na 2CO3 0.4M vào ml dịch lọc, thêm ml thuốc thử Folin pha loãng lần vào dung dịch hỗn hợp Trộn đều, để yên 15 phút Khi dung dịch xuất màu xanh, đem đo độ hấp thụ bước sóng 660 nm (Am) Mẫu đối chứng: lấy ml enzyme, ml dung dịch acid Trichloracetic 0.4M cho vào ống nghiệm lắc Thêm ml dung dịch chất casein 1% tiến hành bước tương tự mẫu thí nghiệm với điều kiện Ghi nhận kết độ hấp thụ bước sóng 660 nm (At) 2.6.5 Tính kết Một đơn vị hoạt tính (Unit) enzyme protease xác định lượng enzyme để tạo lượng amino acid tương đương với 1µmol Tyrosin phút điều kiện thí nghiệm Hoạt tính enzyme protease: Phụ lục 50 N= [ ( Am − At ) − b] × a (11) (10) × (1) × (2) Trong đó: N – Hoạt độ enzyme pepsin (U/ml) Am – Độ hấp thụ mẫu At – Độ hấp thụ mẫu đối chứng a,b – Là hệ số lấy từ phương trình đường chuẩn tyrosin ( y= ax+b) (11) – Tổng thể tích thực phản ứng (ml) (10) – Thời gian phản ứng (phút) (1) – Tổng thể tích enzyme sử dụng (ml) (2) – Thể tích sử dụng phép đo độ hấp thụ quang (ml) PHỤ LỤC CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 3.1 Cân phân tích 3.2 Cân kỹ thuật 3.3 Máy đo pH 3.4 Máy xay sinh tố 3.5 Máy lắc khô 3.6 Máy ly tâm lạnh 3.7 Tủ lạnh 4oC 3.8 Tủ lạnh âm 20oC 3.9 Bếp điện Phụ lục 51 ... nghiệm để xác định tỷ lệ enzyme /thịt đỏ thích hợp cho trình thủy phân Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô Thịt đỏ cá ngừ Nghiền nhỏ Điều chỉnh thông số: pH = – 2.5 Nhiệt... định thành phần thịt đỏ cá ngừ − Tách chiết chế phẩm enzyme pepsin thô từ nội tạng cá ngừ − Nghiên cứu điều kiện tối ưu để thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết... kìm hãm lên pepsin từ loài cá thu ngừ (Thunnus alalunga) cá ngừ vằn (Katsuwonus Trang Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô pelamis) cá ngừ bò (Thunnus tonggol) Các hợp chất