Nghiên cứu thủy phân protein trong phế liệu tôm bằng enzyme protease

i LỜI CẢM ƠN Đề tài này được hoàn thành là nhờ sự g iúp đỡ tận tình của nhiều thầy cô giáo, bạn bè và gia đình.Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến tất cả tập thể và cá nhân đã giúp đỡ em trong thời gian học tập và thực hiện đề tài: Em xin chân thành bày t ỏ lòng biết ơn cô Th.S Ngô Th ị Hoài Dương, người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em thực hiện đề tài. Em xin chân thành bi ết ơn các thầy cô trong khoa Chế biến đã truyền đạt cho em những kiến thức trong suốt quá trình học tập. Em xin chân thành bi ết ơn Phòng thí nghiệm hoá sinh của bộ môn Công nghệ Chế biến thuỷ sản, Phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình thực tập. Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thành viên trong gia đình, các bạn đồng môn đã động viên và nhiệt tình giúp đỡ em thực hiện đề tài. Sinh viên NGUYỄN THỊ THẮM ii MỤC LỤC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ PHẾ LIỆU TÔM VÀ CÁC BIỆN PHÁP THU HỒI PROTEIN 3 1.1.1. Phế liệu tôm 3 1.1.2 Thành phần hoá học của phế liệu tôm. 7 1.1.3 Hệ enzyme protease của tôm. 8 1.1.4. Các hướng tận dụng PLT 10 1.1.4. Các phương pháp thu nh ận protein 11 1.1.5 Các nghiên cứu về việc thu hồi protein bằng enzyme. 14 1.2. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PROTEASE VÀ QUÁ TRÌNH TH ỦY PHÂN 16 1.2.1. Enzyme protease 16 1.2.2. Protein thủy phân 19 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 22 1.2.4 Một số ứng dụng của enzyme 24 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm 27 2.1.2. Enzyme Protease 27 2.1.3 Hóa chất 28 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 29 2.2.1 Xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng. 29 2.2.2 Xác định chế độ tối ưu cho quá trình thủy phân phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng 2 loại enzyme Alcalse và Flavourzyme. 29 2.2.3 Đánh giá giá trị sinh học của sản phẩm thủy phân. 29 iii 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 29 2.3.1 Phương pháp nghiên c ứu: 29 2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu 31 2.4 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 32 2.4.1 Xây dựng đường chuẩn BSA theo ph ương pháp Biuret 32 2.4.2 Quy trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme dự kiến 34 2.4.3. Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng enzyme Alcalase .35 2.4.4 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng enzyme Flavourzyme 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN THEO PH ƯƠNG PHÁP BIURET 39 3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM 40 3.3 KẾT QUẢ TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM BẰNG ENZYME ALCALASE. 40 3.4 KẾT QUẢ TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM BẰNG ENZYME FLAVOURZYME. 45 3.5 GIÁ TRỊ SINH HỌC CỦA DỊCH THỦY PHÂN 49 3.5.1 So sánh về giá trị sinh học của dịch thủy phân pr otein từ phế liệu tôm bằng enzyme Alcalase và Flavourzyme. 49 3.5.2 So sánh về hiệu quả kinh tế khi thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm bằng enzyme Alcalase và Flavourzyme. 51 3.5.3 Quy trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme đề xuất 52 iv CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 53 4.1 KẾT LUẬN 53 4.2 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Khối lượng phế liệu tôm ở Khánh Hòa qua các n ăm. 6 Bảng 1.2. Thành phần (%) đầu và vỏ tôm 7 Bảng 2.1: Thể tích của các dung dịch hóa chất cho vào các ống nghiệm 33 Bảng 2.2 Mức thí nghiệm của các yếu tố 36 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm ở giá trị biên 37 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm ở tâm ph ương án 37 Bảng 2.5 Mức thí nghiệm của các yếu tố 38 Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm ở giá trị biên 38 Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm ở tâm ph ương án 38 Bảng 3.1: Mật độ quang học của các mẫu đường chuẩn 39 Bảng 3.2 Thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng (tính theo vật chất khô) 40 Bảng 3.3 Ma trận quy hoạch thực nghiệm 41 Bảng 3.4 Ma trận quy hoạc h thực nghiệm có biến ảo 41 Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm ở tâm ph ương án 41 Bảng 3.6 Bảng kết quả kiểm tra mức ý nghĩa của các h ệ số hồi quy 42 Bảng 3.7 Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân phế liệu tôm bằng enzyme Alcalase 44 Bảng 3.8 Ma trận quy hoạch thực nghiệm 45 Bảng 3.9 Ma trận quy hoạch thực nghiệm có biến ảo 46 Bảng 3.10 Kết quả thí nghiệm ở tâm ph ương án 46 Bảng 3.11 Bảng kết quả kiểm tra mức ý nghĩa của các hệ số hồi quy 46 Bảng 3.12 Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân phế liệu tôm bằng enzyme Flavourzyme 48 Bảng 3.13 Giá trị sinh học của dịch thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm bằng enzyme. 50 Bảng 3.14 So sánh về hiệu quả thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng emzyme Alcalase so với enzyme Flavourzyme (tính cho 1kg nguyên liệu tươi ban đầu). 51 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Phản ứng thủy phân protein 19 Hình 1.2. Phản ứng thủy phân protein xúc tác bởi protease 21 Hình 2.1. Công thức của phức Biuret. 30 Hình 2.2 Sự bắt màu của phản ứng Biuret. 30 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 32 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme dự kiến. 34 Hình 3.1: Đồ thị đường chuẩn BSA 39 Hình 3.2: Sơ đồ quy trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme đề xuất 52 1 LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong công nghiệp chế biến thuỷ sản xuất khẩu, tỷ lệ c ơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70÷ 80% công suất chế biến. Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn. Cùng với sự tăng sản lượng thì hàng năm ngành thuỷ sản thải ra một lượng phế liệu khổng lồ mà chủ yếu là phế liệu của n gành chế biến tôm. Phế liệu tôm nếu không được thu gom và xử lý thì vừa gây lãng phí vừa gây ô nhiễm môi trường. Hiện nay phế liệu tôm được đưa vào để sản xuất Chitin-chitosan đang là hướng chủ yếu. Thông thường, quy trình sản xuất chitin -chitosan từ phế liệu tôm có quá trình khử protein, phế liệu tôm được khử protein bằng base mạnh, dịch protein thu được sau quá trình thường thải bỏ do có nồng độ hóa chất cao gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng hoặc mới chỉ thu hồi protein để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Theo một số nghiên cứu khoa học chỉ ra rằng dịch thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm có chứa các thành phần axit amin khá cao và có giá trị về mặt sinh học. Và hướng nghiên cứu để thu hồi protein từ phế liệu tôm để bổ sung vào thực phẩm đang là một hướng mới được nhiều người quan tâm, trong tương lai nó sẽ được phát triển và mở rộng. Dưới sự hướng dẫn của cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương em đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thủy phân protein trong phế liệu tôm bằng enzyme protease”. 2 2. Mục đích của đề tài Xây dựng được chế độ thích hợp nhất cho quá trình thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm bằng enzyme để thu được protein với hàm l ượng cao nhất. 3. Nội dung đề tài  Tổng quan về phế liệu tôm.  Tổng quan về quá trình thủy phân protein dưới tác dụng của enzyme protease.  Xác định được thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ chân trắng.  Nghiên cứu chế độ thủy phân protein từ phế liệu tôm và đánh giá giá trị của sản phẩm thủy phân.  Đề xuất qui trình thủy phân protein từ ph ế liệu tôm bằng enzyme protease. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ PH Ế LIỆU TÔM VÀ CÁC BIỆN PHÁP THU HỒI PROTEIN 1.1.1. Phế liệu tôm Nguồn phế liệu tôm rất quan trọng trong chế biến tôm công nghiệp nhất là thành phần đầu tôm, nó chiếm khoảng 35-45% trọng lượng tôm (Meyers, 1986). Thông thường khối lượng tôm trong công nghiệp ở Trung Quốc khoảng 550000 tấn, và phần phế liệu đầu tôm chiếm khoảng 63% tổng khối lượng tôm trong công nghiệp (Cui, 2006). Và nó có th ể cho khoảng hơn 150000 tấn đầu tôm thải ra từ các nhà máy hàng n ăm (Liu & Ye, 2007). Đầu tôm rất giàu nguồn chitin (11% trọng l ượng khô) và cũng rất giàu nguồn protein [10].Vì vậy việc tận dụng nguồn phế liệu này đang được rất quan tâm trong những năm gần đây. Theo Cavaheiro(2006), ở Brazil phế liệu tôm chiếm khoảng 33% trọng lượng của tôm và được loại bỏ hoàn toàn. Trong n ăm 2000, tổng sản lượng phế liệu đầu tôm khoảng 8.250 tấn được thải ra từ 25000 tấn tôm nguyên liệu. Tương tự, theo Honlanda (2006), có khoả ng 45% nguyên liệu đưa vào chế biến là tôm và phế liệu được thải loại trong quá trình chế biến tôm chiếm từ 50% - 70%, nguồn phế liệu này nếu không được giải quyết sẽ gây ra các vấn đề về môi trường, các phần phế liệu chứa chủ yếu là Protein, Astaxanthin, Chitin… Ở Nigeria trong năm 1990 s ản lượng tôm là 637000 tấn, trong đó phần đầu tôm thường chiếm 35-45% trọng lượng tôm. Ở Việt Nam nguồn nguyên liệu tôm là rất dồi dào, khả năng khai thác từ 25÷30.000 tấn/năm. Toàn vùng biển Nam bộ có trữ lượng và khả năng khai thác lớn nhất nước ta; ước tính khả năng khai thác bằng 50% sản lượng của cả nước. Đặc biệt, nuôi tôm đã phát triển mạnh trong những năm gần đây và trở 4 thành ngành kinh tế mũi nhọn. Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001 và 540.000 ha năm 2003. Từ năm 2001 – 2005, tốc độ tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản tăng bình quân 8,97%/năm, giá trị tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản tăng bình quân 10,5%. Năm 2002, giá trị xuất khẩu thuỷ sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đó xuất khẩu tôm đông lạnh chiếm 47%.Năm 2003 xuất khẩu thủy sản đạt 2,3 tỷ USD bao gồm các sản phẩm chính là tôm đông lạnh, cá đông lạnh, nhuyễn thể chân đầu, mực khô, cá ngừ và một số mặt hàng khác. Năm 2004, xuất khẩu thuỷ sản đạt giá trị 2,4 tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả n ước trong đó tôm đông lạnh chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản. N ăm 2006 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đã qua mốc 3 tỷ đạt 3,31 tỷ USD, tăng gần 600 triệu USD so với năm 2005, trong đó mặt hàng tôm truyền thốn g chiếm vị trí đầu bảng xấp xỉ 1,5 tỷ USD, chiếm 44,3 % tổng kim ngạch xuất khẩu. N ăm 2007, tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 3,75 tỷ USD tăng 12% so với năm 2006 [2]. Mục tiêu xuất khẩu thuỷ sản đến năm 2010, Việt Nam phấn đấu đạt giá trị 4 - 4,5 tỷ USD. Ðịnh hướng đến năm 2020, chế biến xuất khẩu thủy sản tiếp tục là động lực thúc đẩy phát triển nuôi trồng thuỷ sản, khai thác thuỷ sản và mang lại nhiều lợi ích kinh tế ngành, nâng cao thu nhập và đời sống lao động nghề cá.Trong cơ cấu mặt hàng thủy sản xuất khẩu của Việt Nam từ trước đến nay nhất là tôm đông lạnh chiếm tỷ lệ cao. Các sản phẩm chế biến từ tôm chủ yếu là: tôm tươi còn vỏ, đầu (nguyên con) cấp đông IQF hoặc Block; tôm vỏ bỏ đầu cấp đông IQF hoặc Block; tôm bóc vỏ, bỏ chỉ lưng cấp đông IQF; tôm bóc vỏ, còn đốt đuôi cấp đông IQF; tôm dạng sản phẩm định hình, làm chín Năm 2003 khối lượng tôm xuất khẩu là trên123600 tấn đạt trên 1tỷ USD chiếm 49% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cả n ước chiếm gần 10% giá trị xuất khẩu tôm toàn cầu. Việt Nam trở thành nước đứng thứ 5 [...]... thu hồi protein từ 57,5% đến 64,6% và asthaxanthin từ 4,7 đến 5,7 mg asthaxanthin/100g phế liệu khô tại DH 12% Gildberg và Stenberg, 2001 thu đư ợc 68,5% protein từ phế liệu tôm Pandalus borealis sau 2 giờ thủy phân với enzyme Alcalase Wenhong Cao và các cộng sự ,2008 đã nghiên cứu thu hồi protein của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng cách cho đầu tôm tự thủy phân và có sự điều chỉnh nhiệt độ bằng. .. thủy phân diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease và phế liệu tôm cũng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân Để tạo điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt người ta thường xay nhỏ phế liệu tôm Khi diện tích tiếp xúc giữa enzym e protease với protein càng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ng ược lại * Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu càng tăng nồng độ enzyme. .. Phản ứng thủy phân tạm dừng khi không còn nhiều liên kết peptid sẵn có cho enzyme Độ thủy phân tối đa có thể đạt được phụ thuộc vào tính chất tự n hiên của protein và đặc trưng của enzyme 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân[ 2][4] Trong quá trình thủy phân vỏ đầu tôm bằng protease có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới tốc độ thủy phân như: * Ảnh hưởng của nhiệt độ: Bản chất của enzyme là protein. .. gia cầm Ví dụ: Protease được sử dụng để thủy phân phê liệu bột cá, thịt cá trộn vào thức ăn gia súc, sản xuất dịch thủy phân giàu đạm bổ sung thức ăn cho gia súc và gia cầm 27 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm Thành phần phế liệu của tôm thẻ có hàm l ượng protein cao đặc biệt là ở đầu tôm Vì vậy, trong đề tài này chọn đầu tôm thẻ chân trắng... tối ưu cho quá trình thủy phân protein của phế liệu tôm bằng enzyme theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm b Phương pháp phân tích các ch ỉ tiêu - Xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng: + Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Folch + Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Biuret Nguyên lý: Trong môi trường kiềm, liên kết peptid trong phân tử protein kết hợp với Cu... phân protein diễn ra rất chậm ở điều kiện bình thường, ví dụ pH trung tính và nhiệt độ phòng Sử dụng enzyme chắc chắn sẽ thúc đẩy phản ứng thủy phân, dẫn tới việc cắt mạch chuỗi peptid triệt để hơn, hình thành nhiều phân tử nhỏ hơn, ví dụ các amino acid chính Enzyme mà xúc tác cho sự thủy phân protein là protease hay proteinase Qúa trình thủy phân protein diễn ra: enzyme Protein enzyme polypeptide enzyme. .. xúc tác của protease trong phản ứng thủy phân protein: H2 O E+S ES + EP + H - P E + P - OH + H - P+ Hình 1.2 Phản ứng thủy phân protein xúc tác bởi protease Trong đó: E là enzyme, S là cơ ch ất (protein) , ES là phức hợp Michaelis giữa enzyme và cơ chất, P và P+ biểu thị kết quả các peptid có kích th ước khác nhau được tách ra Các đặc tính của protein thủy phân được đánh giá thông qua độ thủy phân và cấu... thu hồi với hiệu suất cao Cho phép thu được hầu hết các protein hoà tan do đó có thể ứng dụng để thu hồi protein trong nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm, chế biến thuỷ sản 1.1.5 Các nghiên cứu về việc thu hồi protein bằng enzyme [2];[10] * Trên Thế giới Việc thu hồi một phần protein từ phế liệu tôm bằng enzyme thủy phân đã được nghiên cứu rộng rãi (Simpson và Haard, 1985; Cano -Lopezandothers,... mùi từ phế liệu tôm 16 Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy, 2006 cũng đã nghiên cứu sử dụng Lactobacillus plantarum lên men đầu tôm sú để thu hồi chitin Lên men đầu tôm có tác dụng bảo quản và cho phép thu hồi một số sản phẩm có giá trị : chitin, protein, lipid, sắc tố Trong quá trình này sự khử protein là do sự hoạt động của hệ protease trong đầu tôm, hệ protease từ các vi khuẩn trong phế liệu ở giai... tính protease yếu của vi khuẩn Lactic Ngoài ra acid lactic sinh ra cũng có tác dụng làm mềm protein, hoạt hóa protein, và thúc đẩy quá trình thủy phân tạo điều kiện cho một số protease hoạt động Sau 24 giờ phần trăm protein còn lại trong phế liệu tôm so với mẫu ch ưa xử lý là 12,99% Đặng Thị Hiền (2008) đã sử dụng enzyme Alcalase để tiến hành thuỷ phân phế liệu tôm và tận thu protein và astaxanthin trong . Nghiên cứu thủy phân protein trong phế liệu tôm bằng enzyme protease . 2 2. Mục đích của đề tài Xây dựng được chế độ thích hợp nhất cho quá trình thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm bằng enzyme. của phế liệu tôm thẻ chân trắng.  Nghiên cứu chế độ thủy phân protein từ phế liệu tôm và đánh giá giá trị của sản phẩm thủy phân.  Đề xuất qui trình thủy phân protein từ ph ế liệu tôm bằng enzyme protease. 3 CHƯƠNG. trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme dự kiến 34 2.4.3. Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng enzyme Alcalase .35 2.4.4 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng