Nghiên cứu thủy phân protein trong phế liệu tôm bằng enzyme protease

Mục đích của đề tàiXây dựng được chế độ thích hợp nhất cho quá trình thủy phânprotein từ phế liệu đầu tôm bằng enzyme để thu được protein với hàm lượngcao nhất.. Các loại phế liệu này nế

LỜI CẢM ƠN

Đề tài này được hoàn thành là nhờ sự g iúp đỡ tận tình của nhiều thầy côgiáo, bạn bè và gia đình.Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhấtđến tất cả tập thể và cá nhân đã giúp đỡ em trong thời gian học tập và thựchiện đề tài:

Em xin chân thành bày t ỏ lòng biết ơn cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương,người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo những kinh nghiệm quý báutrong suốt thời gian em thực hiện đề tài

Em xin chân thành bi ết ơn các thầy cô trong khoa Chế biến đã truyền đạtcho em những kiến thức trong suốt quá trình học tập

Em xin chân thành bi ết ơn Phòng thí nghiệm hoá sinh của bộ môn Côngnghệ Chế biến thuỷ sản, Phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ sinh học vàMôi trường đã tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình thực tập

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thành viên trong gia đình,các bạn đồng môn đã động viên và nhiệt tình giúp đỡ em thực hiện đề tài

Sinh viên NGUYỄN THỊ THẮM

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ PHẾ LIỆU TÔM VÀ CÁC BIỆN PHÁP THU HỒI PROTEIN 3

1.1.1 Phế liệu tôm 3

1.1.2 Thành phần hoá học của phế liệu tôm 7

1.1.3 Hệ enzyme protease của tôm 8

1.1.4 Các hướng tận dụng PLT 10

1.1.4 Các phương pháp thu nh ận protein 11

1.1.5 Các nghiên cứu về việc thu hồi protein bằng enzyme 14

1.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PROTEASE VÀ QUÁ TRÌNH TH ỦY PHÂN 16

1.2.1 Enzyme protease 16

1.2.2 Protein thủy phân 19

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 22

1.2.4 Một số ứng dụng của enzyme 24

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 27

2.1.2 Enzyme Protease 27

2.1.3 Hóa chất 28

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 29

2.2.1 Xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng 29

2.2.2 Xác định chế độ tối ưu cho quá trình thủy phân phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng 2 loại enzyme Alcalse và Flavourzyme 29

2.2.3 Đánh giá giá trị sinh học của sản phẩm thủy phân 29

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 29

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu: 29

2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu 31

2.4 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 32

2.4.1 Xây dựng đường chuẩn BSA theo phương pháp Biuret 32

2.4.2 Quy trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme dự kiến 34

2.4.3 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng enzyme Alcalase 35

2.4.4 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng enzyme Flavourzyme 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN THEO PHƯƠNG PHÁP BIURET 39

3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM 40

3.3 KẾT QUẢ TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM BẰNG ENZYME ALCALASE 40

3.4 KẾT QUẢ TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM BẰNG ENZYME FLAVOURZYME 45

3.5 GIÁ TRỊ SINH HỌC CỦA DỊCH THỦY PHÂN 49

3.5.1 So sánh về giá trị sinh học của dịch thủy phân pr otein từ phế liệu tôm bằng enzyme Alcalase và Flavourzyme 49

3.5.2 So sánh về hiệu quả kinh tế khi thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm bằng enzyme Alcalase và Flavourzyme 51

3.5.3 Quy trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme đề xuất 52

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 53

4.1 KẾT LUẬN 53

4.2 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Khối lượng phế liệu tôm ở Khánh Hòa qua các n ăm 6

Bảng 1.2 Thành phần (%) đầu và vỏ tôm 7

Bảng 2.1: Thể tích của các dung dịch hóa chất cho vào các ống nghiệm 33

Bảng 2.2 Mức thí nghiệm của các yếu tố 36

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm ở giá trị biên 37

Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm ở tâm ph ương án 37

Bảng 2.5 Mức thí nghiệm của các yếu tố 38

Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm ở giá trị biên 38

Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm ở tâm ph ương án 38

Bảng 3.1: Mật độ quang học của các mẫu đường chuẩn 39

Bảng 3.2 Thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng (tính theo vật chất khô) 40

Bảng 3.3 Ma trận quy hoạch thực nghiệm 41

Bảng 3.4 Ma trận quy hoạc h thực nghiệm có biến ảo 41

Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm ở tâm ph ương án 41

Bảng 3.6 Bảng kết quả kiểm tra mức ý nghĩa của các h ệ số hồi quy 42

Bảng 3.7 Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân phế liệu tôm bằng enzyme Alcalase 44

Bảng 3.8 Ma trận quy hoạch thực nghiệm 45

Bảng 3.9 Ma trận quy hoạch thực nghiệm có biến ảo 46

Bảng 3.10 Kết quả thí nghiệm ở tâm ph ương án 46

Bảng 3.11 Bảng kết quả kiểm tra mức ý nghĩa của các hệ số hồi quy 46

Bảng 3.12 Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân phế liệu tôm bằng enzyme Flavourzyme 48

Bảng 3.13 Giá trị sinh học của dịch thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm bằng enzyme 50

Bảng 3.14 So sánh về hiệu quả thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng emzyme Alcalase so với enzyme Flavourzyme (tính cho 1kg nguyên liệu tươi ban đầu) 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân protein 19

Hình 1.2 Phản ứng thủy phân protein xúc tác bởi protease 21

Hình 2.1 Công thức của phức Biuret 30

Hình 2.2 Sự bắt màu của phản ứng Biuret 30

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 32

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme dự kiến 34

Hình 3.1: Đồ thị đường chuẩn BSA 39

Hình 3.2: Sơ đồ quy trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme đề xuất 52

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong công nghiệp chế biến thuỷ sản xuất khẩu, tỷ lệ c ơ cấu các mặthàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70÷ 80% công suất chế biến Hàng năm cácnhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn Cùng với sựtăng sản lượng thì hàng năm ngành thuỷ sản thải ra một lượng phế liệu khổng

lồ mà chủ yếu là phế liệu của n gành chế biến tôm Phế liệu tôm nếu khôngđược thu gom và xử lý thì vừa gây lãng phí vừa gây ô nhiễm môi trường.Hiện nay phế liệu tôm được đưa vào để sản xuất Chitin-chitosan đang làhướng chủ yếu Thông thường, quy trình sản xuất chitin -chitosan từ phế liệutôm có quá trình khử protein, phế liệu tôm được khử protein bằng base mạnh,dịch protein thu được sau quá trình thường thải bỏ do có nồng độ hóa chất caogây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng hoặc mới chỉ thu hồi protein để bổsung vào thức ăn chăn nuôi

Theo một số nghiên cứu khoa học chỉ ra rằng dịch thủy phân protein từphế liệu đầu tôm có chứa các thành phần axit amin khá cao và có giá trị vềmặt sinh học Và hướng nghiên cứu để thu hồi protein từ phế liệu tôm để bổsung vào thực phẩm đang là một hướng mới được nhiều người quan tâm,trong tương lai nó sẽ được phát triển và mở rộng

Dưới sự hướng dẫn của cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương em đã thực hiện

đề tài “Nghiên cứu thủy phân protein trong phế liệu tôm bằng enzymeprotease”

2 Mục đích của đề tài

Xây dựng được chế độ thích hợp nhất cho quá trình thủy phânprotein từ phế liệu đầu tôm bằng enzyme để thu được protein với hàm lượngcao nhất

3 Nội dung đề tài

 Tổng quan về phế liệu tôm

 Tổng quan về quá trình thủy phân protein dưới tác dụng của enzymeprotease

 Xác định được thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ chân trắng

 Nghiên cứu chế độ thủy phân protein từ phế liệu tôm và đánh giá giá trịcủa sản phẩm thủy phân

 Đề xuất qui trình thủy phân protein từ ph ế liệu tôm bằng enzymeprotease

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ PHẾ LIỆU TÔM VÀ CÁC BIỆN PHÁP THU HỒI PROTEIN

1.1.1 Phế liệu tôm

Nguồn phế liệu tôm rất quan trọng trong chế biến tôm công nghiệp nhất

là thành phần đầu tôm, nó chiếm khoảng 35-45% trọng lượng tôm (Meyers,1986) Thông thường khối lượng tôm trong công nghiệp ở Trung Quốckhoảng 550000 tấn, và phần phế liệu đầu tôm chiếm khoảng 63% tổng khốilượng tôm trong công nghiệp (Cui, 2006) Và nó có th ể cho khoảng hơn

150000 tấn đầu tôm thải ra từ các nhà máy hàng n ăm (Liu & Ye, 2007) Đầutôm rất giàu nguồn chitin (11% trọng l ượng khô) và cũng rất giàu nguồnprotein [10].Vì vậy việc tận dụng nguồn phế liệu này đang được rất quan tâmtrong những năm gần đây

Theo Cavaheiro(2006), ở Brazil phế liệu tôm chiếm khoảng 33% trọnglượng của tôm và được loại bỏ hoàn toàn Trong n ăm 2000, tổng sản lượngphế liệu đầu tôm khoảng 8.250 tấn được thải ra từ 25000 tấn tôm nguyên liệu

Tương tự, theo Honlanda (2006), có khoả ng 45% nguyên liệu đưa vàochế biến là tôm và phế liệu được thải loại trong quá trình chế biến tôm chiếm

từ 50% - 70%, nguồn phế liệu này nếu không được giải quyết sẽ gây ra cácvấn đề về môi trường, các phần phế liệu chứa chủ yếu là Protein, Astaxanthin,Chitin…

Ở Nigeria trong năm 1990 s ản lượng tôm là 637000 tấn, trong đó phầnđầu tôm thường chiếm 35-45% trọng lượng tôm

Ở Việt Nam nguồn nguyên liệu tôm là rất dồi dào, khả năng khai thác

từ 25÷30.000 tấn/năm Toàn vùng biển Nam bộ có trữ lượng và khả năng khaithác lớn nhất nước ta; ước tính khả năng khai thác bằng 50% sản lượng của cảnước Đặc biệt, nuôi tôm đã phát triển mạnh trong những năm gần đây và trở

thành ngành kinh tế mũi nhọn Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 ha năm

2000 lên đến 478.000 ha năm 2001 và 540.000 ha năm 2003

Từ năm 2001 – 2005, tốc độ tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản tăngbình quân 8,97%/năm, giá trị tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản tăng bìnhquân 10,5% Năm 2002, giá trị xuất khẩu thuỷ sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đóxuất khẩu tôm đông lạnh chiếm 47%.Năm 2003 xuất khẩu thủy sản đạt 2,3 tỷUSD bao gồm các sản phẩm chính là tôm đông lạnh, cá đông lạnh, nhuyễn thểchân đầu, mực khô, cá ngừ và một số mặt hàng khác Năm 2004, xuất khẩuthuỷ sản đạt giá trị 2,4 tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả n ướctrong đó tôm đông lạnh chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản N ăm 2006kim ngạch xuất khẩu thủy sản đã qua mốc 3 tỷ đạt 3,31 tỷ USD, tăng gần 600triệu USD so với năm 2005, trong đó mặt hàng tôm truyền thốn g chiếm vị tríđầu bảng xấp xỉ 1,5 tỷ USD, chiếm 44,3 % tổng kim ngạch xuất khẩu N ăm

2007, tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 3,75 tỷ USD tăng 12% so vớinăm 2006 [2]

Mục tiêu xuất khẩu thuỷ sản đến năm 2010, Việt Nam phấn đấu đạt giátrị 4 - 4,5 tỷ USD Ðịnh hướng đến năm 2020, chế biến xuất khẩu thủy sảntiếp tục là động lực thúc đẩy phát triển nuôi trồng thuỷ sản, khai thác thuỷ sản

và mang lại nhiều lợi ích kinh tế ngành, nâng cao thu nhập và đời sống laođộng nghề cá.Trong cơ cấu mặt hàng thủy sản xuất khẩu của Việt Nam từtrước đến nay nhất là tôm đông lạnh chiếm tỷ lệ cao Các sản phẩm chế biến

từ tôm chủ yếu là: tôm tươi còn vỏ, đầu (nguyên con) cấp đông IQF hoặcBlock; tôm vỏ bỏ đầu cấp đông IQF hoặc Block; tôm bóc vỏ, bỏ chỉ lưng cấpđông IQF; tôm bóc vỏ, còn đốt đuôi cấp đông IQF; tôm dạng sản phẩm địnhhình, làm chín Năm 2003 khối lượng tôm xuất khẩu là trên123600 tấn đạttrên 1tỷ USD chiếm 49% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cả n ước chiếmgần 10% giá trị xuất khẩu tôm toàn cầu Việt Nam trở thành nước đứng thứ 5

trên Thế giới về xuất khẩu tôm Tôm được dự kiến đạt khoảng 483 nghìn tấnnguyên liệu để phục vụ cho xuất khẩu khoảng 390.000 tấn năm 2010.

Theo thống kê của Trung tâm Nghiên cứu Chế biến Thủy sản, Đại họcThuỷ sản thì lượng phế liệu năm 2004 tại Việt Nam ước tính khoảng 45.000tấn phế liệu, năm 2005 ước tính khoảng 70.000 tấn/n ăm Trần Thị Luyến(2004) cho biết trong vỏ tôm tươi chitosan chi ếm khoảng 5% khối lượng,trong vỏ tôm khô khoảng 20-40% khối lượng Như vậy hàng năm có thể sảnxuất gần 5000 tấn chitosan phục vụ sản xuất trong nước và xuất khẩu, manglại hiệu quả kinh tế cho ngành Thuỷ sản

Phế liệu tôm (PLT) là những thành phần phế thải từ các c ơ sở chế biếntôm bao gồm đầu, vỏ và đuôi tôm Ngoài ra, còn có tôm gãy thân, tôm lột vỏsai quy cách hoặc tôm bị biến màu Tuỳ thuộc vào loài và ph ương pháp xử lý

mà lượng phế liệu có thể vượt quá 60% khối lượng sản phẩm Có thể lấy tôm

càng xanh iMacrobrachium rosenbergi làm ví dụ, đầu tôm chiếm tới 60% trọng lượng tôm Đầu tôm sú Penaeus monodon cũng chiếm tới 40% trọng

lượng tôm Với sản phẩm tôm lột vỏ, rút chỉ lưng, lượng đuôi và vỏ đuôi củatôm chiếm khoảng 25% trọng lượng tôm Đối với tôm thẻ, lượng phế liệu đầutôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9%, như vậy tổng lượng phế liệu vỏ đầu tôm thẻ

là 37% Lượng phế liệu này có thể giảm ít nhiều bằng cách nâng cao hiệu quảlột vỏ nhờ các thiết bị và công nghệ chế biến tốt hơn.Giảm lượng phế liệu từkhâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng chúng đang trở nên phổ biến nhưmột phương cách giúp làm tăng lợi nhuận cho ngành thuỷ sản Nhiều côngtrình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của PLT từ 30 - 70% (Watkin và cộng sự,1982; Evers và Carroll, 1996, trung bình khoảng 50% so với khối lượng tômchưa chế biến Halanda và Netto (2006) cho rằng PLT có t hể chiếm 50 - 70%

so với nguyên liệu [2]

Phần lớn tôm được đưa vào chế biến dưới dạng bóc vỏ, bỏ đầu Phầnđầu thường chiếm khối lượng 34-45%, phần vỏ, đuôi và chân chiếm 10-15%trọng lượng của tôm nguyên liệu Tuy nhiên, tỉ lệ này tuỳ thuộc vào giốn g loài

và giai đoạn sinh trưởng của chúng

Việc tiêu thụ một số lượng lớn tôm nguyên liệu của các nhà máy chếbiến Thủy sản đã thải ra một lượng lớn phế liệu trong đó phế liệu vỏ, đầu tôm

là chủ yếu Các loại phế liệu này nếu thải trực tiếp ra môi tr ường sẽ gây ônhiễm môi trường trầm trọng và nếu đem xử lý chất thải thì chi phí sẽ rất lớn.Ngày nay đã có rất nhiều hướng nghiên cứu sử dụng phế liệu tôm để sản xuấtcác chế phẩm có giá trị trong đó quan trọng nhất là việc sản xuất chitin -chitosan từ vỏ giáp xác

Ở địa bàn tỉnh Khánh Hòa trong những n ăm gần đây mặt hàng tômđông lạnh được đẩy mạnh nhất là ở các xí nghiệp chế biến Thủy sản nh ư: Xínghiệp Đông lạnh Nam Trung Bộ, Xí nghiệp Đông lạnh Việt Long, Xí nghiệpĐông lạnh Việt Thắng, Xí nghiệp Đông lạnh Nha Trang (hay công tyF17)…Đây là nguồn phế liệu dồi dào để sản xuất chitin- chitosan và các sảnphẩm giá trị khác Theo số liệu của Sở Th ủy sản Khánh Hòa khối lượng phếliệu của toàn tỉnh trong các n ăm 1995 – 2002 luôn vượt ngưỡng 1000 tấn/năm và có xu hướng ngày càng tăng[9]

Bảng 1.1: Khối lượng phế liệu tôm ở Khánh Hòa qua các n ăm.

Khối

lượng(tấn)

1127,3 1053,5 1272,95 1232 1373 1706,6 1984,84 2777,3

1.1.2 Thành phần hoá học của phế liệu tôm.

Thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể trong đầu tôm là protein, chitin, canxicacbonate, sắc tố Tỷ lệ các thành phần này không ổn định, chúng thay đổitheo giống, loài, đặc điểm sinh thái, sinh lý,…Thành phần chitin và proteintrong vỏ tôm tươi tương ứng là 4,50% và 8,05% Trong vỏ tôm khô là

11 – 27,50% và 23,25 – 53%

Hàm lượng chitin, protein, khoáng và carotenoid trong phế liệu vỏ tômthay đổi rất rộng phụ thuộc vào điều kiện bóc vỏ trong quá trình chế biếncũng như phụ thuộc vào loài, trạng thái dinh dưỡng, chu kỳ sinh sản Vỏ giápxác chứa chủ yếu là protein (30 – 40%), khoáng (30 – 50%), chitin

 Protein: Protein đầu tôm phần lớn thuộc loại khó tiêu hoá và khó trích

ly, protein đầu tôm thường tồn tại ở 2 dạng chính là dạmg tự do (có trong nộitạng và cơ gắn với phần thân tôm) và dạng liên kết với chitin hoặccanxicacbonat như một phần thống nhất của vỏ tôm

 Hệ enzyme: Hệ enzyme của tôm thường có hoạt độ mạnh hơn đặc biệt

ở cơ quan nội tạng ở đầu tôm nên rất dễ bị hư hỏng Hệ enzyme của tôm gồm:

 Protease: Là enzyme chủ yếu trong đầu tôm, chủ yếu phân giải protein

thành acid amin

 Lipaza: Phân giải lipid thành glyxeryl và acid béo

+ Tyrozinaza: Khi có mặt của oxi không khí thì sẽ biến Tyrozin thành

melanin có màu đen ảnh hưởng đến giá trị cảm quan và chất l ượng của sảnphẩm

- Chitin: Chiếm khối lượng lớn, tồn tại ở dạng liên kết với protein,

canxicacbonat và nhiều hợp chất khác

- Chất ngấm ra ở đầu tôm: Trymethylamin (TMA), Trimethylaminoyt (

TMAO), Betain, bazo purin, các acidamin t ự do, ure…

Ngoài các thành phần trên trong đầu tôm còn có một lượng đáng kể lipid, mộtlượng nhỏ photpho và sắc tố

Như vậy phế liệu đầu tôm là nguồn giàu chitin (11% trọng lượng khô),cũng là một nguồn protein tốt ( 50 - 65% trọng lượng khô), giàu chất dinhdưỡng và nguồn enzyme

1.1.3 Hệ enzyme protease của tôm [3].

Sự tiêu hóa và trao đổi chất protein, các hợp chất nit ơ khác giữa các loàigiáp xác khác nhau rất nhiều Các enzyme tiêu hóa đặc biệt là enzyme tiêuhóa protein ở giáp xác nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme

có trong dạ dày của cá Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạngtrypsin và có khả năng hoạt động rất cao Ngoài ra còn có enzymchymotrysin, astacine Qua một số nghiên cứu của một số tác giả cho thấyenzyme từ tôm nói chung là các protease kiềm tính Các enzyme này có tínhchất chung của enzyme:

- Hòa tan trong nước, dung dịch nước muối và một số dung môi hữu c ơnên dựa vào tính chất này để tách chiết chúng

- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa, ethanol aceton để thuchế phẩm enzyme

- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hay giảm dưới tác dụng của các chấthoạt hóa hoặc chất ức chế

- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ ,

Trypsin: Có trong dịch vị tụy tạng, khả năng tác dụng của trypsin khá

mạnh với các loại protid có phân tử l ượng thấp ở các mối liên kết peptid,amit, ester Trypsin từ ruột tôm có pH thích hợp là 7,8 ở 380C

Peptidase, ereptase và các lo ại khác: Tham gia thủy phân liên kết

peptid trong phân tử protid và các polypeptid K hả năng tác dụng cũng nhưtính đặc hiệu của enzyme này phụ thuộc vào bản chất của các nhóm nằm liền

kề bên mối liên kết peptid

Cacbonhydrase: Enzyme này xúc tác thủy phân các glucid và glucozit.

Dựa vào tính chất của enzyme có trong đầu tôm nên để thuận lợi choquá trình thủy phân protein thì ta nên chọn enzym e protease để xúc tác choquá trình thủy phân

Tính chất và chất lượng của các sản phẩm thủy phân được đánh giáthông qua độ thủy phân và cấu trúc của các peptid tạo thành Điều này phụthuộc vào tính chất tự nhiên của protein và tính đặc hiệu enzyme sử dụng,cũng như việc khảo sát các thông số của quá trình thủy phân nh ư nhiệt độ,pH….nó sẽ làm giảm các phụ phẩm của quá trình thủy phân và cải thiện cáctính chất và chức năng Giá trị dinh dưỡng của protein được giữ nguyên hay

tăng lên khi thủy phân bằng enzyme ở những thông số nhẹ, protein bị bẻ gãythành các thành phần đơn phân tử như peptid hoặc acidamin.

1.1.4 Các hướng tận dụng PLT[9]

Phế liệu từ các khâu chế biến cần được thu hồi và bảo quản thích hợp,cần phải thu gom riêng những loại khác nhau nh ư đầu, vỏ…Do thành phần vàtiềm năng sử dụng, giá trị sử dụng của chúng đáng kể

Phế liệu tôm dễ hỏng một phần vì chứa enzyme phân giải protein, mộtphần do quá trình phân hủy vi si nh Lượng protein ở đầu tôm mất đi vì bị ươnthối có tới trên 10%, đồng thời có thể làm giảm chất l ượng sản phẩm tôm.Ngoài ra, nên tiến hành ngay các công đoạn tiếp theo như cấp đông hay sấykhô để chế biến phế liệu thành bán thành phẩm ổn định sau đó sẽ được sửdụng hay bán

a Sản xuất thức ăn chăn nuôi

Hiện nay ở nước ta đa số sử dụng phế liệu tôm đông lạnh để sản xuấtthức ăn chăn nuôi Rất nhiều thức ăn chăn nuôi bán chạy hiện nay có chứa bộttôm và nó chiếm 30% thành phần thức ăn Bột tôm được chế biến tốt có chứaaxit amin tương tự như amin trong đậu tương hay trong bột cá Phế liệu tôm

có chất lượng càng cao thì bột tôm có chất l ượng càng cao Do vậy việc xử lý

và chế biến phế liệu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc sản xuất bột tôm cóchất lượng cao Nếu công nghệ chế biến không phù hợp thì nó cũng ảnhhưởng đến giá trị dinh dưỡng của sản phẩm do các chất béo và axit béo thiếtyếu sẽ bị ảnh hưởng

Hiện nay có 2 phương pháp được áp dụng phổ biến trong sản xuất bộttôm là phương pháp sấy khô và phương pháp ủ xi lô:

Phương pháp sấy khô bằng nhiệt: Phương pháp có ưu điểm là đơn giản,

có thể chế biến nhanh lượng phế liệu tôm đông lạnh, tính kinh tế cao

Nhược điểm là chất lượng kém, giá trị dinh dưỡng không cao

Phương pháp ủ xilô: ở phương pháp này người ta sử dụng axit hữu c ơ

và vô cơ trong việc ủ nhằm tăng tác động của enzyme khử trùng và hạn chế

sự phát triển của vi sinh vật Sau khi ủ tiến hành trung tính bằng các chấtkiềm, chất ủ được làm thức ăn chăn nuôi Phương pháp này có ưu điểm làchất lượng tốt nhưng giá thành cao và phức tạp

b Sản xuất bột màu Astaxanthin

Thành phần hóa học của tôm rất giàu protein nên tr ước khi sản xuấtchitin chúng ta nên thu hôi protein lại Và trong phần vỏ của phế liệu cũngchứa sắc tố Astaxanthin, tuy nó có hàm lượng nhỏ nhưng giá thành lại caotrên thị trường (2500USD/kg) Hơn nữa astaxanthin còn là một carotenoid cótác dụng kích thích sinh trưởng, kháng một số bệnh Nó là chất tạo màu nênđược sử dụng trong kỹ thuật nuôi trồng thủy sản, thực phẩm, c ông nghiệp

Vì vậy hiện nay vấn đề tận dụng astaxanthin trong công nghiệp chế biến phếliệu tôm là vấn đề đang được nhiều nước quan tâm

c Sản phẩm súp và canh

Có thể sử dụng các mẩu thừa của tôm chất l ượng cao sau khi chế biếnlàm món canh và súp tôm Đầu tôm được sử dụng làm nguyên liêu tạo mùicho món súp tôm đặc biệt Tôm vụn được sử dụng làm món canh tôm

d Làm các sản phẩm định hình

Thịt tôm vụn hoặc không đạt chuẩn có thể được chế biến thành các sảnphẩm định hình Sản phẩm này được định hình lại thành hình con tôm hay cáchình dạng trang trí như bánh tròn, viên, khoanh tôm B ằng cách tạo ra cáchình dạng khác nhau, ướp tẩm gia vị hay bao bột, ta có thể làm ra rất nhiềusản phẩm tôm đẹp mắt Các sản phẩm định hình này được làm chín trong các

là thường hoặc lò vi sóng giống như các sản phẩm được chế biến từ tôm khác

1.1.4 Các phương pháp thu nh ận protein[10]

Để tách protein hiện nay ng ười ta sử dụng các phương pháp sau:

 Phương pháp cơ học:

Nguyên lý: Sử dụng các lực cơ học để tách một phần protein ra khỏinguyên liệu vỏ đầu tôm Quá trình được tiến hành như sau: Đầu tôm còn tươiđem rửa sạch, sau đó ép bằng trục lăn hoặc trục vít, thu protein đem sấy khô

và bảo quản Hiệu quả thu hồi protein của ph ương pháp này không cao Tuynhiên, quá trình này đã loại bỏ một phần protein tự do trong đầu tôm vì vậygiảm thiểu được hóa chất sử dụng cho các công đoạn tiếp theo

 Phương pháp hoá học:

Một số công trình trên thế giới đã nghiên cứu khử protein của phế liệu g iápxác bằng NaOH Phương pháp này mang lại một số ưu điểm như đơn giản,không đòi hỏi thiết bị máy móc phức tạp Do đó, rất dễ áp dụng để sản xuấtlớn Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là dịch thải thường thải bỏ

do nó có chứa kiềm, protein và sản phẩm protein thủy phân Hơn nữa, protein

bị hạn chế sử dụng do các phản ứng không mong muốn xảy ra tr ong môitrường kiềm mạnh

 Phương pháp sinh học:

Nguyên lý của phương pháp này dựa trên việc sử dụng hệ enzyme có sẵntrong đầu tôm hoặc bổ sung enzyme n guồn gốc từ thực vật (papain,bromelain), động vật (đầu tôm, nội tạng cá thu, ngừ, mực ống…), vi sinh vật(protease từ nấm mốc và vi khuẩn) để thuỷ phân protein đầu tôm thành cácphần peptid, acid amin và thu hồi chúng Quá trình được tiến hành như sau:Đầu tôm → Ép→ nghiền → Thuỷ phân → Phân ly→ Protein Có 2 phươngpháp: phương pháp ủ xi lô và phương pháp bổ sung enzyme protease

* Phương pháp ủ xi lô:

Thu hồi protein trên cơ sở dựa vào hoạt tính của protease có sẵn trong phếliệu tôm hoặc bổ sung từ bên ngoài vào Tôm ủ xi lô là thức ăn động vật dạnglỏng, đôi khi còn gọi là protein lỏng Sự hoá lỏng của mô tôm là kết quả của

việc thuỷ phân protein nhờ hoạt động của enzyme ngoài ra còn được sự hỗ trợbằng cách bổ sung các acid hữu c ơ Chất lượng của protein thu được từphương pháp này chủ yếu phụ thuộc vào hàm l ượng các acid amin quan trọngtrong đó.

Thông thường acid formic với hàm l ượng 3% (w/w) được sử dụng làmtác nhân acid hoá để hạ thấp pH xuống 4,0 hay thấp h ơn nữa Acid formicchứa một số thành phần có tác dụng khử trùng, ức chế vi khuẩn và bảo quảnphế liệu Có thể sử dụng hỗn hợp acid hữu c ơ và vô cơ như acid formicvà/hoặc acid sulfuric, acid propionic… với các nồng độ khác nhau Sau khiđược trung hoà bởi một base thích hợp nh ư NaOH, sản phẩm ủ xi lô có thể sửdụng làm thức ăn động vật Phế liệu tôm vốn rất giàu protein rất thích hợp để

ủ xilô

Trong vài giờ đầu tiên của quá trình thuỷ phân, l ượng acid amin thiết yếutăng lên Tuy nhiên, không nên kéo dài giai đo ạn thuỷ phân vì khi đã đạt đếnhiệu suất tối đa, tiếp tục thuỷ phân trong môi tr ường acid sẽ làm giảm hiệusuất của các acid amin thiết yếu Ph ương pháp này có ưu điểm là tận dụngđược enzyme protease sẵn có trong đầu tôm, phương pháp đơn giản, không sửdụng máy móc thiết bị phức tạp nên dễ thực hiện Ng ười ta còn cho rằngphương pháp này còn có khả năng ổn định lượng astaxanthin trong bột tômthu được Do đó nếu có điều kiện nên nghiên cứu thu hồi protein vàastaxanthin theo hướng này

* Phương pháp bổ sung enzyme protease:

Phương pháp này cũng giống như phương pháp ủ xi lô là lợi dụng hoạtđộng thuỷ phân protein của protease để thu hồi protein Tuy nhiên, để giảmthời gian thuỷ phân người ta bổ sung protease với hàm l ượng nhất định để đẩynhanh tốc độ phản ứng thuỷ phân trong hỗn hợp phế liệu tôm

 Phương pháp hóa lý

Áp dụng phương pháp này nhằm thu hồi protein từ dịch thủy phân củacông nghệ sản xuất chitin - chitosan theo phương pháp hóa h ọc và phươngpháp sinh học

Nguyên lý dựa trên việc kết tủa protein bằng cách dùng acid để điềuchỉnh pH dung dịch chứa protein về điểm đẳng điện của protein (pH = 4 –5,5), sau đó dùng các phương pháp l ắng, lọc để thu hồi protein

Phương pháp này có ưu đi ểm là đơn giản, dễ làm, có thể thu hồi vớihiệu suất cao Cho phép thu được hầu hết các protein hoà tan do đó có thể ứngdụng để thu hồi protein trong nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm,chế biến thuỷ sản

1.1.5 Các nghiên cứu về việc thu hồi protein bằng enzyme [2];[10].

* Trên Thế giới

Việc thu hồi một phần protein từ phế liệu tôm bằng enzyme thủy phân đãđược nghiên cứu rộng rãi (Simpson và Haard, 1985; Cano -Lopezandothers,1987; Synowiecki và Al-Khateeb, 2000; Gildberg vàStenberg, 2001; Mizani

và cộng sự, 2005) Các enzyme protease như Alcalase đã được sử dụng đểthủy phân protein từ phế liệu tôm (Chabeaud, Guerard, Laroque & Dufosse2007; Mizani, Aminlari, 2005) và trypsin , papain, pepsin (Synowiecki & Al-Khateeb,2000; Chakrabarty,2002), neutrase và protease

(Rutanapornvareeskul, 2006)

Józef Synowiecki và cộng sự (1999) nghiên cứu ứng dụng Alcalase đểkhử protein của phế liệu vỏ tôm Crangon crangon nhằm thu hồi Chitin vàprotein

Ban đầu vỏ tôm Crangon crangon được khử khoáng sơ bộ bằng DD

HCl 10% ở 200C trong 30 phút và khử protein bởi enzyme thương mạiAlcalase ở 550C và pH 8,5 Độ thủy phân (DH) cao nhất là 30% và dịch thuỷ

phân thu được chứa 63% protein so với vật chất khô (N x 6,25), 6,24% lipid,23,4% NaCl.

Holanda và Netto, 2006 nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phếliệu tôm, protein, chitin, asthaxanthin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và

pancreatin Theo tác gi ả trong phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri có chứa

39,42% protein, 31,98 % tro, và 19,92 % chitin Ti ến hành thủy phân khửprotein bằng enzyme Alcalase tại các điều kiện: tỷ lệ enzyme/ng uyên liệu(E/S) 3%, nhiệt độ 600C, pH=8,5 Kết quả cho thấy khi tăng độ thủy phân(DH) từ 6% tới 12% thì thu được 26% và 28% protein tương ứng Alcalase cóảnh hưởng nhiều hơn pancreatin, có thể thu hồi protein từ 57,5% đến 64,6%

và asthaxanthin từ 4,7 đến 5,7 mg asthaxanthin/100g phế liệu khô tại DH12%

Gildberg và Stenberg, 2001 thu đư ợc 68,5% protein từ phế liệu tôm

Pandalus borealis sau 2 giờ thủy phân với enzyme Alcalase.

Wenhong Cao và các cộng sự ,2008 đã nghiên cứu thu hồi protein củaphế liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng cách cho đầu tôm tự thủy phân và có sựđiều chỉnh nhiệt độ bằng cách nâng nhiệt độ dần lên từ 400C÷700C, cứ sau 30phút thì tăng lên 50C, pH tự nhiên Kết quả cho thấy tại điều kiện nhiệt độ

400C, 500C, 600C thì hàm lượng protein thu hồi được tương ứng là 43,6%,73,6%, 87,4% Và kết quả cũng chỉ ra là khi nhiệt độ tăng từ 450C ÷ 600C lànhiệt độ mà enzyme nội tạng hoạt động mạnh nhất thì độ thủy phân (DH) tăng

từ 0 ÷ 48% sau 180 phút khi nâng nhi ệt dần lên, lượng protein thu hồi caonhất là 87,4% tại 600C

* Ở Việt Nam

Vũ Ngọc Bội đã sử dụng protease ở đầu tôm sú để thủy phân phế liệutôm nhằm thu được dịch chiết và chất mùi từ phế liệu tôm

Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy, 2006 cũng đã nghiên cứu sử dụng

Lactobacillus plantarum lên men đầu tôm sú để thu hồi chitin Lên men đầu

tôm có tác dụng bảo quản và cho phép thu hồi một số sản phẩm có giá trị :chitin, protein, lipid, sắc tố Trong quá trình này sự khử protein là do sự hoạtđộng của hệ protease trong đầu tôm, hệ protease từ các vi khuẩn trong phếliệu ở giai đoạn đầu và hoạt tính protease yếu của vi khuẩn Lactic Ngoài raacid lactic sinh ra cũng có tác dụng làm mềm protein, hoạt hóa protein, vàthúc đẩy quá trình thủy phân tạo điều kiện cho một số protease hoạt động.Sau 24 giờ phần trăm protein còn lại trong phế liệu tôm so với mẫu ch ưa xử

lý là 12,99%

Đặng Thị Hiền (2008) đã sử dụng enzyme Alcalase để tiến hành thuỷphân phế liệu tôm và tận thu protein và astaxanthin trong công ngh ệ sản xuấtchitin - chitosan Tại nhiệt độ 540C, 8 giờ, tỷ lệ enzyme bổ sung là 0, 22%; pH

8, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1 thì thu hồi được 52,7% protein so với ban đầu.Trang Sỹ Trung đã sử dụng enzyme Flavouzyme để tiến hành thuỷ phânphế liệu tôm Tại nhiệt độ 500C, 6 giờ, tỷ lệ enzyme bổ sung là 0, 1; pH 6,5,thì hiệu suất thu hồi protein khoảng 92 ÷ 95%

1.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PROTEASE VÀ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN

và áp suất bình thường, pH môi trường gần như pH sinh lý và có khả năng

xúc tác đặc hiệu cao đối với kiểu phản ứng cũng nh ư cơ chất mà nó tác dụng,sản phẩm tạo ra thuần khiết, ít tạp chất.

Việc phân loại protease có thể căn cứ vào các tiêu chí đó là:

 Căn cứ vào cơ chế phản ứng của enzyme tham gia

 Căn cứ vào pH tối thích cho hoạt động của enzyme như protease acid,protease kiềm, protease trung tính

 Nguồn thu các enzym protease chủ yếu từ 3 nguồn c ơ bản:

 Enzym được tách từ các mô như: tụy tạng, dạ dày, ruột của nộitạng của một số động vật thủy sản (mực, cá…) thường là trypsin,pepsin, chymotrypsin, cathepsin

 Từ thực vật có thể thu được papain (từ đu đủ), bromelain (từ thân,

lá, vỏ dứa)

 Vi sinh vật cũng là một nguồn rất phong phú để thu enzym,

thường từ các loài Aspergillus, Bacillus, Clostridium, Streptomyces

và một số loài nấm men

 Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme gồm: endopeptidase hay (endopeptithydrolase, hay proteinase) và exopeptidase hay ( peptidase), aminopeptidase, cacboxyl peptidase, dipeptidase

Theo phân loại quốc tế các enzyme protease được chia thành 4 nhóm phụ:

 Aminopeptidase: Enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầunito của mạch polypeptit

 Cacboxypeptidase: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacboncủa mạch polypeptit

 Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các dipeptit

 Proteinaza: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit nối mạch

Theo Barett và Donald (1956), protease đư ợc phân ra thành 2 nhóm lớn

là nhóm endopeptidase và nhóm exopeptidase

 Nhóm 1: Endopeptidase hay (endopeptit hydrolase, hay proteinase) là cácenzyme phân giải các liên kết nằm trong mạch polypeptit, các enzymenhóm này gồm có bốn phân nhóm:

 Phân nhóm 1: Proteinase – serin là những protease mà trong trungtâm hoạt động của nó có nhóm (- OH) của acidamin xerin Phânnhóm này gồm các enzyme như : trypsin, chymotrypsin

 Phân nhóm 2: Proteinase – xistein là protease mà trong trung tâmhoạt động của nó có nhóm thiol ( -SH) của acidamin xistein Nhómnày gồm các enzyme cathepxin

 Phân nhóm 3: Proteinase – aspartic là những protease trong trungtâm hoạt động của nó có nhóm cacboxyl ( -COOH) của aspactic nhưenzyme pepsin

 Phân nhóm 4: Protease – kim loại Đây là những protease trongtrung tâm hoạt động của nó có ion kim loại Enzyme này hoạt độngtrong môi trường trung tính Ví dụ như colagenase

• Nhóm 2: Exopeptidase hay (peptidase) Các enzyme thu ộc nhóm này gồm:Cacboxypeptidase, amino peptidase, dipeptidase Các exopeptidase không cókhả năng thủy phân liên kết peptit ngoài cùng của chuỗi polypeptit hoặc đầuamin, hoặc đầu cacboxyl, tuần tự tách từng acidamin ra khỏi chuỗi polypeptit.Trong các nguồn nguyên liệu này thì vi sinh vật là nguồn thích hợp cho việcsản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp vì nó có những ưu điểm sau:

 Có thể chủ động trong quá trình sản xuất

 Chu kỳ phát triển của vi sinh vật ngắn do đó có thể sản xuất enzyme từ

vi sinh vật trong thời gian ngắn từ 36÷60h

 Có thể định hướng việc tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo h ướng sảnxuất chọn lọc enzyme với số l ượng lớn

 Giá thành các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật thấp h ơn so với cácnguồn khác vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật t ương đối đơn giản, rẻ tiền.

Do những ưu điểm này mà ngày nay việc nghiên cứu ứng dụng enzymetrong đời sống mang nhiều ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn

1.2.2 Protein thủy phân[2]; [5]

Protein là một chuỗi polymer dài, mà bao gồm các nhóm amino gắn vớinhau bởi các liên kết peptid Phản ứng liên quan đến việc phá vỡ chuỗi cácnhóm amino này thành các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng nước được gọi là sựthủy phân protein

Protein Nư ớc Axitcacboxylic Amino

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân protein

Trong suốt quá trình phản ứng, liên kết peptid sẽ được tách ra do sự tấn côngneucleophilic bởi phân tử nước, tạo thành acid carboxylic và amin Nhómcarboxyl và nhóm amino t ự do hình thành sau quá trình thủy phân sẽ nhiều

Nucleo philic

hơn hay ít ion hóa hơn, ph ụ thuộc vào pH của phản ứng thủy phân Từ đây sẽhình thành anion RCOO- và cation R-NH3 +.

Theo Alder – Nissen, thêm nước vào trong quá trình thủy phân protein

có liên quan đến sự tấn công nucleophilic, các nhóm amino tự do ( -NH2) cóthể cũng hoạt động như nucleophilic phản ứng trực tiếp với protein để táchcác liên kết peptid Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển cácpeptid sinh ra anion RCOO - và cation R-NH3+ Vì vậy, trong quá trình thủyphân protein, các nhóm amino t ự do hình thành cũng hỗ trợ cho sự phá vỡ, cắtmạch protein Sự thủy phân protein diễn ra rất chậm ở điều kiện bình thường,

ví dụ pH trung tính và nhiệt độ phòng Sử dụng enzyme chắc chắn sẽ thúc đẩyphản ứng thủy phân, dẫn tới việc cắt mạch chuỗi peptid triệt để hơn, hìnhthành nhiều phân tử nhỏ hơn, ví dụ các amino acid chính Enzyme mà xúc táccho sự thủy phân protein là protease hay proteinase

Qúa trình thủy phân protein diễn ra:

Do vậy, tùy mức độ thủy phân, thời gian thủy phân mà n gười ta có thểthu được peptid hay axitamin

Enzyme là chất xúc tác sinh học mang bản chất là protein có tính đặchiệu cao, nó có khả năng tương tác lên các liên kết peptid (-CO- NH-) trongphân tử protein và cơ chất tương tự, làm cho các liên kết này bị suy yếu và dễdàng bị đứt ra khi có yếu tố nước tham gia

Thông thường, enzyme tác dụng và chuyển hoá c ơ chất trải qua ba giaiđoạn :

Giai đoạn I: Enzyme kết hợp với c ơ chất bằng liên kết yếu tạo thànhphức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi

năng lượng thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và c ơ chất trongphức hợp ES là: tương tác tĩnh điện, liên kết Hydrogen, liên kết Vandecvan.

Giai đoạn II: Là giai đoạn tạo phức chất hoạt hoá xảy ra sự biến đổi cơchất, dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động củaenzyme làm cho cơ ch ất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một sốliên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thayđổi

Giai đoạn III: Là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và giải phóngenzyme Đây là giai đo ạn cuối của quá trình phản ứng từ c ơ chất sẽ hìnhthành sản phẩm và enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do như ban đầu.Hình 1.2 dưới đây minh họa cơ chế xúc tác của protease trong phản ứng thủyphân protein:

Hình 1.2 Phản ứng thủy phân protein xúc tác bởi protease

Trong đó: E là enzyme, S là cơ ch ất (protein), ES là phức hợp Michaelisgiữa enzyme và cơ chất, P và P+ biểu thị kết quả các peptid có kích th ướckhác nhau được tách ra Các đặc tính của protein thủy phân được đánh giáthông qua độ thủy phân và cấu trúc của các peptid tạo thành Điều này phụthuộc vào tính chất tự nhiên của protein và tính đặc hiệu của enzyme sử dụng,cũng như việc kiểm soát các thông số của quá trình thủy phân nh ư nhiệt đô,pH, nó sẽ làm giảm các phụ phẩm của quá trình thủy phân và cải thiện cáctính chất và chức năng như: khả năng tạo nhũ, khả năng tạo bọt, độ nhớt, sựtạo gel và khả năng hấp thụ nước, Giá trị dinh dưỡng của protein thườngđược giữ nguyên hay tăng lên bởi enzyme thủy phân, khi mà ti ến hành dướicác điều kiện phản ứng nhẹ nhàng Protein bị cắt mạch thành các đơn vị nhỏhơn như peptid hay acid amin

H 2 O

Cách tác động: Endoprotease tiến hành tách các liên kết peptid ở bêntrong của nhánh polypeptid, trong khi exopeptidase tách rời các amino acid ở

vị trí đầu tiên và cuối cùng của nhánh polypeptid

Tỷ lệ giữa enzyme và cơ chất xác định tốc độ thủy phân, ban đầu tốc

độ thủy phân là cao nhất sau đó giảm dần theo thời gian Phản ứng thủy phântạm dừng khi không còn nhiều liên kết peptid sẵn có cho enzyme Độ thủyphân tối đa có thể đạt được phụ thuộc vào tính chất tự n hiên của protein vàđặc trưng của enzyme

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân [2][4]

Trong quá trình thủy phân vỏ đầu tôm bằng protease có nhiều yếu tốảnh hưởng tới tốc độ thủy phân như:

* Ảnh hưởng của nhiệt độ: Bản chất của enzyme là p rotein nên khi tăng

hay giảm nhiệt độ thường ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme và enzyme chỉthể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định Thông thườngđối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40 ÷ 500C vànhiệt độ lớn hơn 700C đa số enzyme bị mất hoạt tính Do vậy nhiệt độ 700Cgọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme

Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme, nếu nhiệt độtăng 100C thì tốc độ thủy phân của enzyme t ăng từ 1,5 – 2 lần Nhiệt độ thíchhợp đối với một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH và cơ chất

* Ảnh hưởng của pH: Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi của pH.

Mỗi enzyme chỉ hoạt động ở một vùng pH nhất định gọi là pH tối thích pHtối thích của đa số enzyme nằm trong vùng trung tính, axit yếu hoặc kiềmyếu, chỉ rất ít enzyme hoạt động mạnh trong vùng axit hay kiềm Phế liệu tôm

có thể bị thủy phân bởi enzyme protease có sẵn trong đầu tôm vì thế chúng taphải chọn enzyme nào đóng vai trò là enzyme chính xúc tác cho quá trình

thủy phân để tạo môi trường có pH thích hợp cho nó hoạt động và hạn chếảnh hưởng của các enzyme khác.

* Ảnh hưởng của thời gian: Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều

ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân và chất l ượng của sản phẩm.Thời gian tác dụng kéo dài thì enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt để, dẫnđến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất Nhưng nếu kéo dài thời gian thủy phânquá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra nhiều sảnphẩm cấp thấp như: NH3, H2S, indol, scaptol, …đồng thời khi kéo dài hiệuquả kinh tế kém Khi rút ngắn thời gian thủy phân, sự thủy phân protein ch ưatriệt để dẫn tới hiệu suất thủy phân kém, gây lãng phí nguyên liệu và gây khókhăn cho khâu lọc rửa để thu dịch protein

* Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc: Khi thủy phân diện tích tiếp xúc giữa

enzyme protease và phế liệu tôm cũng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủyphân Để tạo điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt người ta thườngxay nhỏ phế liệu tôm Khi diện tích tiếp xúc giữa enzym e protease với proteincàng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ng ược lại

* Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu

càng tăng nồng độ enzyme protease thì quá trình thủy phân xảy ra càng mãnhliệt Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất, dù tăng nồng độenzyme bao nhiêu đi nữa vận tốc của quá trình thủy phân rất ít thay đổi

* Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Khi enzyme protease kết hợp với cơ

chất là phế liệu tôm, sẽ tạo thành phức trung gian enzyme và c ơ chất Phứcchất này sẽ kéo căng liên kết peptid, chuyển hóa thành sản phẩm dịch đạm vàgiải phóng enzyme Qúa trình này cứ tiếp tục xảy ra đến khi cơ chất hết, nếunồng độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phândiễn ra đều đặn, nhanh chóng

* Độ tươi của nguyên liệu: Độ tươi của phế liệu tôm có vai trò quan trọng

quyết định đến chất lượng của sản phẩm protein thu hồi từ quá trình thủyphân và chitin Độ tươi của phế liệu tôm giảm thì làm giảm chất l ượng của bộtprotein do có sự phân hủy protein trong đầu tôm tạo thành những sản phẩmcấp thấp như: indol, scaptol, H2S, NH3…gây ra mùi khó chịu cho sản phẩm

* Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân: Nước là

yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến phản ứng thủy phân Nó có khả n ăng điềuchỉnh phản ứng thủy phân, bởi lẽ n ước là môi trường tăng cường quá trìnhphân cắt các liên kết nhị dương, là môi trường khuyếch tán enzyme và cơ chấttạo điều kiện cho tốc độ phản ứng xảy ra Do vậy quá trình thủy phân nguyênliệu đầu tôm nếu ta bổ sung nước với tỷ lệ thấp sẽ hạn chế được hoạt động của

vi sinh vật nhưng đồng thời ức chế hoạt động của enzyme làm giảm hiệu suấtthủy phân Nhưng nếu bổ sung nước với tỷ lệ quá cao, vi sinh vật hoạt động

và phát triển phân hủy sản phẩm thành các sản phẩm thứ cấp Vì vậy, ta phảixác định tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân

Ví dụ: Dùng penicilinase khi cơ th ể bị dị ứng mạch với penicillin Chữabệnh do vi sinh vật gây nên do bằng cách dùng enzymenuclease để phân giảinuleic axit.

* Ứng dụng trong công nghiệp nhẹ:

 Enzyme protease dùng đ ể bổ sung vào các loại xà phòng để làm tăngkhả năng tẩy rửa công nghiệp

 Trong công nghiệp da: Enzyme protease được dùng để làm mềm da,làm sạch và tẩy long ra khỏi da Sử dụng protease có thể rút ngắn quá trìnhtầy lông, tính đàn hồi của da cũng tăng lên và tránh được sự ô nhiễm môitrường

Ngoài ra có thể sử dụng enzyme cellulose để thủy phân bào mòn màngcellulose có trong tế bào thực vật để làm tăng khả năng trích li các chất keotrong rong biển

*Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm:

 Các enzyme amylase thường được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vựcthực phẩm và đã mang lại chất lượng hiệu quả cao

 Sử dụng enzyme amylase trong sản xuất maltose sử dụng trong côngnghiệp sản xuất bia, nước giải khát, sản xuất bánh kẹo

 Nếu đưa vào bột nhào 0,002 ÷ 0,003% c hế phẩm amylase thì chấtlượng bánh mì tăng cao, bánh xốp hơn, ngọt hơn và màu sắc đẹp hơn

 Sử dụng enzyme amylase để sản xuất glucose từ tinh bột thay chophương pháp dùng axit clohidric kém hi ệu quả

 Sử dụng protease thu nhận từ quả dứa, đu đủ, nội tạng để làm mềm thịt,làm tăng hương vị của sản phẩm sau khi chế biến Thịt sau khi làm mềm cóthể chế biến các sản phẩm có giá trị gia t ăng

 Sử dụng protease để sản xuất bột đạm thủy phân từ các nguyên liệugiàu protein

* Ứng dụng trong nông nghiệp:

Người ta có thể sử dụng enzyme để phân giải sơ bộ protein trong thức

ăn cho động vật, làm tăng hệ số sử dụng thức ăn có thể dùng theo 2 cách sau:

 Thêm trực tiếp enzyme vào trước khi dùng

 Dùng enzyme để xử lý sơ bộ thức ăn

 Hoặc dùng sản xuất các dịch thủy phân già u đạm bổ sung vào thức ăncủa gia súc gia cầm

Ví dụ: Protease được sử dụng để thủy phân phê liệu bột cá, thịt cá trộnvào thức ăn gia súc, sản xuất dịch thủy phân giàu đạm bổ sung thức ăn chogia súc và gia cầm

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm

Thành phần phế liệu của tôm thẻ có hàm l ượng protein cao đặc biệt là ở

đầu tôm Vì vậy, trong đề tài này chọn đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) là đối tượng nghiên cứu.

Nguyên liệu (NL) đầu tôm được thu tại phân xưởng chế biến, Công ty

Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17) Yêu cầu NL phải t ươi, không có mùi lạ,không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất NL sau khi lấy cho ngay vào thùng xốpcách nhiệt có chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm NLđược nhặt sạch tạp chất, cân cho vào túi polyme ( mỗi túi 1kg), bảo quản đông

ở điều kiện nhiệt độ -200C

Khi tiến hành thí nghiệm thì NL được xay nhuyễn (100% là đầu tôm ,tất cả các mẫu thí nghiệm đều được xay bởi cùng một th iết bị và kích thướcmẫu sau khi xay là 0,5 ÷ 0, 8 cm) và tiến hành làm thí nghiệm ngay

2.1.2 Enzyme Protease

* Enzyme Alcalase: được mua tại Công ty Novozyme,TP.HCM

Enzyme Alcalase 2.4 L FG thu đư ợc từ Bacillus licheniformis Đây là enzyme

protease được phân tách và tinh sạch từ nguồn vi sinh vật Sử dụng enzymeAlcalase cho phép điều chỉnh dễ dàng độ thủy phân, tính toán được lượngbase yêu cầu để duy trì pH không đổi trong suốt quá trình thủy phân Chọnenzyme này cũng dựa trên đặc trưng của nó cho khả năng không hút nước củacác amino acid vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có vịđắng (Adler-Nissen, 1986) đồng thời sản phẩm có sự cân bằng tốt các aminoacid thiết yếu (Kristinsson và Rasco, 2000)

Hoạt tính 2,4 AU-A/g Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0 ÷ 100C Điều kiệnhoạt động tối ưu cho enzyme Alcalase AF 2.4 L: pH 8, nhi ệt độ 50 ÷ 600C(122 ÷ 1400F).

Để kiểm soát đặc tính chức năng của sản phẩm thủy phân thì nên dừngphản ứng enzyme gần với DH % xác định Tất cả protease có thể bị bất hoạtbằng cách xử lý nhiệt ở 900C, thời gian 10 phút hoặc protease Alcalase bị bấthoạt tại pH = 4 hay thấp hơn trong khoảng 30 phút Phản ứng có thể dừng tứcthời bằng cách thêm vào các acid thích hợp nh ư: acid hydrochloric,phosphoric, malic, lactic, acetic Tăng nhiệt độ tức thời khó đạt được dưới cácđiều kiện công nghiệp và nó có thể khó để kiểm soát DH % do sự thủy phânvẫn tiếp tục trong suốt giai đoạn bất hoạt

* Enzyme Flavourzyme: được mua tại công ty Novozyme, TP.HCM.

Chế phẩm enzyme flavour zyme 500 MG thu được từ Aspergillus oryzae,

thuộc nhóm endoprotease và exopeptidase Enzyme này hoạt dộng tốt nhất ởmôi trường trung tính hoặc acid nhẹ khi thủy phân protein Chọn enzyme này

để thủy phân thì sản phẩm thủy phân cũng sẽ không có vị đắng với liều lượng

5 – 10 LAPU/g protein Và để kéo dài sự thủy phân thì liều l ượng nên dùng là

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

2.2.1 Xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng.

2.2.2 Xác định chế độ tối ưu cho quá trình thủy phân phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng 2 loại enzyme Alcalse và Flavourzyme.

2.2.3 Đánh giá giá trị sinh học của sản phẩm thủy phân.

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

2.3.1 Phương pháp nghiên c ứu:

b Phương pháp phân tích các ch ỉ tiêu

- Xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng:

+ Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Folch

+ Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Biuret

Nguyên lý: Trong môi trường kiềm, liên kết peptid trong phân tử

protein kết hợp với Cu++ thành một phức chất màu tím (phản ứng biuret) Tất

cả các chất có chứa từ 2 liên kết trở lên đều cho phản ứng này (trừ axit amin

và dipeptid) Màu sắc của phức chất tỷ lệ với số li ên kết peptid (-CO-NH) củaprotein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin vàglobulin

Hình 2.1 Công thức của phức Biuret.

Hình 2.2 Sự bắt màu của phản ứng Biuret.

Phương pháp xử lí mẫu:

Cách 1: Ngâm 3 - 5gam nguyên liệu khô hoặc 3 - 10 gam nguyên liệuướt trong NaOH 4% với tỷ lệ 1:10 tới 1:15w/v Sau đó đem ủ ở 95oC trong 6giờ

Cách 2: Xử lí mẫu giống như trên nhưng không ủ ở 95oC trong 6 giờ

mà ủ ở nhiệt độ phòng 12 giờ,sau đó nâng nhiệt lên 95oC trong 1 giờ

Sau khi ủ: Đối với dịch thủy phân thu được, nếu không đủ 100ml thìthêm nước cất vào cho đủ 100ml Lấy khoảng 10ml dịch thủy phân đem đi lọcchân không bằng giấy lọc Whatman Filter paper

Phần dịch lọc được đem đi phân tích hàm lư ợng protein bằng thiết bị đoUV-Vis mini 1240.

+ Xác định hàm ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050C theoTCVN 3700 - 1990

+ Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung ở 500 - 6000C

 Xác định hàm lượng protein có trong dịch thủy phân protein của phếliệu tôm bằng enzyme theo phương pháp Biuret

 Xác định thành phần axit amin theo ph ương pháp phân tích sắc ký

 Xác định độ thủy phân

Độ thủy phân (Degree of hydrolysis (DH)) sử dụng công thức đã đượcđiều chỉnh Theo Hoyle & Meritt (1994) thì độ thủy phân được xác định theocông thức sau:

Hàm lượng N2 có trong dịch 10% TCA

2.4 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

2.4.1 Xây dựng đường chuẩn BSA theo ph ương pháp Biuret.

Alcalase

Dịch thủy phân

Xác định độthủy phân

Xác định thànhphần axit amin

So sánh 2 quytrình thủy phânbằng enzyme

Quy trình thủy phânprotein đề xuất