Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN THỊT ĐỎ CÁ NGỪ BẰNG BẰNG ENZYME PEPSIN THÔ Người hướng dẫn: TS BÙI XUÂN ĐÔNG Sinh viên thực hiện: HỒ THỊ ANH ĐÀO Số thẻ sinh viên: 107120247 Lớp: 12SH Đà Nẵng, 5/2017 TÓM TẮT Tên đề tài: “Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô.” Sinh viên thực hiện: Hồ Thị Anh Đào Số thẻ sinh viên: 107120247 Lớp: 12SH Tóm tắt – Thịt đỏ cá ngừ phụ phẩm ngành công nghiệp chế biến cá ngừ Nhiều nghiên cứu chứng minh thịt đỏ cá ngừ có hàm lượng protein cao, nhiên chưa quan tâm nghiên cứu để chế biến Mục đích nghiên cứu khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ chế phẩm enzyme pepsin thô Nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết từ nội tạng cá ngừ để giảm chi phí nghiên cứu ứng dụng Kết nghiên cứu xác định hàm lượng protein nguyên liệu 26.95%, điều kiện thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ chế phẩm enzyme pepsin thô (0.0383 U/ml) với điều kiện thích hợp là: tỷ lệ enzyme/cơ chất = 30% (v/w), tỷ lệ phối trộn nguyên liệu/nước = 1/3 (w/v) nhiệt độ 55oC thời gian Từ khóa – Nội tạng; thịt đỏ cá ngừ; pepsin; protein; thủy phân; hoạt độ enzyme Abstract – Tuna red meat is a by-product of the tuna processing industry Many studies have shown that tuna red meat is high in protein; however, tuna red meat has not been studied for processing yet The purpose of this study was to investigate some of the factors affecting tuna red meat protein hydrolization by crude pepsin enzyme preparation Research on the use of crude pepsin enzyme preparation extracted from tuna viscera to reduce research and application costs The results of the study determined the protein content of the raw material were 26.95%, the tuna red meat protein hydrolysis conditions by crude pepsin enzyme preparation (0.0383 U/ml) under appropriate conditions were: enzyme/substrate ratio = 30%(v/w), substrate/water ratio = 1/3, at 55 degree Celsius for hours Keywords – viscera; tuna red meat; pepsin; protein; hydrolysis; activity of enzyme ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: HỒ THỊ ANH ĐÀO Lớp: Khoa: 12SH Số thẻ sinh viên: HĨA 107120247 Ngành: Cơng nghệ Sinh học Tên đề tài đồ án: “Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô.” Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Nội dung phần thuyết minh tính tốn: Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án Lời nói đầu Cam đoan Mục lục Danh mục bảng biểu hình ảnh Danh sách ký hiệu chữ viết tắt Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu phương pháp Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục Giáo viên hướng dẫn: TS Bùi Xuân Đông Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 10/02/2017 Ngày hồn thành đồ án: 20/05/2017 Trưởng Bộ mơn Cơng nghệ sinh học Đà Nẵng, ngày 25 tháng 05 năm 2017 Người hướng dẫn TS Lê Lý Thùy Trâm TS Bùi Xn Đơng LỜI NĨI ĐẦU Đầu tiên em xin gửi lời cám ơn chân thành đến TS Bùi Xn Đơng, người tận tình hướng dẫn cho em suốt thời gian vừa qua Chính nhờ giúp đỡ dẫn thầy giúp em hồn thành đề tài cách tốt qua thời gian làm việc thầy giúp em học hỏi thêm kiến thức kinh nghiệm quý báu nghiên cứu khoa học Em xin gửi lời cám ơn đến thầy cô cán phịng thí nghiệm ThS Võ Cơng Tuấn ThS Phạm Thị Kim Thảo giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho chúng em khoảng thời gian thí nghiệm phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ Sinh học Bên cạnh em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô môn Công nghệ Sinh học, khoa Hóa, trường Đại học Bách Khoa-Đại học Đà Nẵng dạy dỗ, truyền đạt cho em kiến thức bổ ích giúp đỡ em suốt quãng thời gian học tập trường Cuối xin gửi lời cám ơn chân thành đến gia đình,người thân bạn bè động viên giúp đỡ khoảng thời gian học tập thực đề tài tốt nghiệp trường Bước đầu tham gia vào công việc nghiên cứu không tránh khỏi bỡ ngỡ sai sót, em kính mong nhận góp ý q thầy để đề tài em hồn thiện Đà Nẵng, ngày 20 tháng năm 2017 Sinh viên thực Hồ Thị Anh Đào i MỤC LỤC TÓM TẮT NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI NÓI ĐẦU i CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ .v DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu thịt đỏ cá ngừ 1.1.1 Đặc điểm thịt đỏ cá ngừ 1.1.2 Thành phần thịt đỏ cá ngừ 1.2 Tổng quan pepsinogen enzyme pepsin .4 1.2.1 Pepsinogen 1.2.2 Pepsin 1.2.3 Ứng dụng công nghiệp enzyme pepsin .9 1.3 Tổng quan protein trình thủy phân protein 1.3.1 Protein 1.3.2 Quá trình thủy phân protein 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein enzyme 1.4 Tình hình nghiên cứu thủy phân protein từ cá 11 1.4.1 Nghiên cứu nước .11 1.4.2 Nghiên cứu nước .13 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16 2.1 Nguyên liệu thiết bị sử dụng 16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Các phương pháp phân tích 17 2.2.2 Xác định mức độ thủy phân protein dịch đạm 18 2.2.3 Thực nghiệm thu nhận CP enzyme pepsin thô từ nội tạng cá ngừ xác định hoạt độ enzyme pepsin 19 ii 2.2.4 Thực nghiệm nghiên cứu trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ sử dụng CP enzyme pepsin thô 20 2.2.5 Thực nghiệm thu nhận dịch thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ điều kiện tối ưu 25 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 26 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết xác định thành phần thịt đỏ cá ngừ 27 3.2 Kết tách chiết xác định hoạt độ CP enzyme pepsin thô 28 3.3 Kết xác định thơng số tối ưu cho q trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ 29 3.3.1 Kết xác định ảnh hưởng nồng độ enzyme .29 3.3.2 Kết xác định ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn nguyên liệu/nước 30 3.3.3 Kết xác định ảnh hưởng thời gian thủy phân 32 3.3.4 Kết xác định ảnh hưởng nhiệt độ môi trường phản ứng .33 3.4 Kết thu hồi dịch thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ điều kiện đề tài xác định 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO .38 PHỤ LỤC SỐ LIỆU CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU HÓA SINH PHỤ LỤC CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU iii DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng 1.1 Hàm lượng chất lượng 100g thịt đỏ cá ngừ 1.2 Hàm lượng số acid amin có thịt đỏ cá ngừ 1.3 Hàm lượng chất khoáng có thịt đỏ cá ngừ .4 3.1 Tính chất hoạt độ enzyme pepsin tách chiết từ ruột cá .28 3.2 Các đặc tính cảm quan thành phần dịch thủy phân .35 Hình 1.1.Cấu trúc phân tử pepsinogen tách chiết từ golden mandarin fish (Siniperca scherzeri) .5 Hình 1.2 Cấu trúc pepsin tách chiết từ Atlantic cod (Gadus morhua) Hình 2.1 Mẫu thịt đỏ cá ngừ cung cấp Công ty TNHH MTV đồ hộp Hạ Long – Đà Nẵng trước sau rã đông .16 Hình 2.2 Mẫu nội tạng cá ngừ thu mua từ chợ Hòa Khánh, Tp Đà Nẵng 17 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tách chiết CP enzyme pepsin thơ từ nội tạng cá ngừ 19 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định tỷ lệ enzyme/thịt đỏ thích hợp cho q trình thủy phân 21 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định thời gian thích hợp cho q trình thủy phân 22 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định tỷ lệ nước nguyên liệu thích hợp cho trình thủy phân 23 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định nhiệt độ thích hợp cho q trình thủy phân 24 Hình 2.8 Sơ đồ thí nghiệm thu nhận dịch thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ điều kiện tối ưu 25 Hình 3.1 Thành phần hóa học thịt đỏ cá ngừ 27 Hình 3.2 Ảnh hưởng hàm lượng enzyme so với nguyên liệu đến hàm lượng ni-tơ amin dịch thủy phân 29 Hình 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng enzyme so với nguyên liệu đến mức độ thủy phân thịt đỏ cá ngừ 29 Hình 3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/nước đến hàm lượng ni-tơ amin dịch thủy phân 31 Hình 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/nước đến mức độ thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ 31 Hình 3.6 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng ni-tơ amin dịch thủy phân 32 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian mức độ thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ 32 Hình 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng ni-tơ amin dịch thủy phân 33 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến mức độ thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ 34 Hình 3.10 Dịch thủy phân điều kiện tối ưu 35 iv DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT − CP: chế phẩm − Da: đơn vị khối lượng phân tử − kDa: kilo Dalton − OD: Optical density – mật độ quang − U: Unit – Đơn vị hoạt độ protease − UV-Vis: Ultraviolet–visible spectroscopy – quang phổ tử ngoại khả kiến − v/w: volume/weigh – thể tích/khối lượng − w/v weigh/volume – khối lượng/thể tích v Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thơ MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cá ngừ loại thủy sản có giá trị kinh tế cao kim ngạch xuất lớn Việt Nam: theo Tổng cục thủy sản Việt Nam, sản lượng khai thác cá ngừ tháng đầu năm 2016 ước đạt 9,605 [53] Trong đó, theo Hiệp hội chế biến xuất cá ngừ Việt Nam, giá trị xuất cá ngừ tháng 2/2017 đạt 36.6 triệu USD, tăng 53% so với kỳ năm 2016 [51] Các sản phẩm cá ngừ xuất nước ta bao gồm: đóng hộp, tươi sống, đơng lạnh khơ Phần thịt sử dụng sản xuất chủ yếu phần thịt trắng, phần thịt đỏ khơng sử dụng chiếm đến 11% tổng khối lượng cá [21] Trong thịt đỏ cá ngừ có chứa 18.28% protein lượng lớn acid amin thiết yếu như: Isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, tryptophan,…[28] Hiện nhà máy sản xuất sản phẩm từ cá ngừ số tỉnh, thành phố Đà Nẵng, Cà Mau chưa có biện pháp tối ưu để xử lý phần thịt đỏ này, mà sử dụng làm thức ăn chăn nuôi bán đầu mối bán lẻ chợ với giá thành rẻ từ 4.000 - 5.000 đ/kg Thịt đỏ cá ngừ có màu sắc đặc trưng chúng chứa hợp chất mang màu mà chủ yếu myoglobin (Mb) hemoglobin (Hb) Thịt đỏ dễ bị biến đổi thành màu tối oxi hóa nguyên tử sắt (Fe) nhóm hem protein tiếp xúc với oxy để hình thành dạng metMb (Mb-Fe3+) có màu nâu khơng mong muốn [20] Ở nước ta chưa có nhiều nghiên cứu [6] tập trung vào việc tận dụng thịt đỏ cá ngừ để sản xuất sản phẩm có giá trị gia tăng Đề tài nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết từ nội tạng cá như: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, tỷ lệ nguyên liệu/nước, thời gian phản ứng, pH nhiệt độ mơi trường phản ứng để tạo dịch đạm có hàm lượng dinh dưỡng cao chất lượng đảm bảo với giá thành rẻ Mục tiêu đề tài Mục tiêu đề tài − Xác định thành phần thịt đỏ cá ngừ − Tách chiết chế phẩm enzyme pepsin thô từ nội tạng cá ngừ − Nghiên cứu điều kiện tối ưu để thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết từ nội tạng cá ngừ gồm có: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, tỷ lệ nguyên liệu/nước, thời gian thủy phân nhiệt độ thủy phân Hướng đến sử dụng dịch đạm thủy phân làm thức ăn dinh dưỡng cho người SVTH: Hồ Thị Anh Đào GVHD: TS Bùi Xuân Đông Trang Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô Đối tượng phương pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu − Thịt đỏ cá ngừ - sản phẩm phụ ngành công nghiệp chế biến cá ngừ, đưcọ cung cấp Công ty TNHH MTV đồ hộp Hạ Long – Đà Nẵng − Nội tạng cá ngừ thu mua chợ Hòa Khánh 3.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp vật lý: xác định nhiệt độ nhiệt kế Phương pháp hóa lý: xác định pH mơi trường dịch đạm sau thủy phân Phương pháp hóa sinh: thực phản ứng để thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ chế phẩm enzyme pepsin thô điều kiện thay đổi; xác định thành phần hóa học thịt đỏ cá ngừ protein, độ ẩm, lipid, tro, ni-tơ tổng số, ni-tơ amin Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Ý nghĩa khoa học: Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu thủy phân thịt đỏ cá ngừ để tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao cho người sử dụng Nghiên cứu giúp xác định điều kiện tối ưu để thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết từ nội tạng cá Nghiên cứu tìm thêm hướng việc sản xuất dịch đạm có dinh dưỡng cao, ngồi việc tận dụng nội tạng cá ngừ để đưa vào nghiên cứu góp phần vào việc bảo vệ mơi trường sống Ý nghĩa thực tiễn: Việt Nam giới có sản phẩm sản xuất từ dịch đạm thủy phân có hàm lượng dinh dưỡng cao giá thành sản phẩm cao Đề tài sử dụng nguyên liệu phụ phẩm phế phẩm ngành công nghiệp thủy sản hạ giá thành sản phẩm Vì đề tài có tính thực tiễn cao, sản phẩm có tính thân thiện với mơi trường an toàn cho người sử dụng Kết cấu đồ án tốt nghiệp Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án Lời nói đầu Cam đoan Mục lục Danh mục bảng biểu hình ảnh Danh sách ký hiệu chữ viết tắt Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu phương pháp SVTH: Hồ Thị Anh Đào GVHD: TS Bùi Xuân Đông Trang (%) Trung bình 0.529 0.532 0.614 0.574 0.552 0.518 0.52 Mức độ thủy phân (%) Lần 4.24 4.12 7.35 5.25 4.04 3.81 Lần 5.08 6.77 6.14 5.28 4.04 4.39 Lần 4.24 4.7 5.88 5.56 4.62 4.7 Trung bình 4.52 4.61 6.67 5.65 5.09 4.23 4.3 Bảng Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân Thời gian (giờ) Hàm lượng ni-tơ amin (%) Mức độ thủy phân (%) Mẫu Lần 0.328 0.525 0.551 0.569 0.582 0.591 Lần 0.368 0.516 0.529 0.551 0.569 0.564 Lần 0.333 0.529 0.543 0.551 0.573 0.578 Trung bình 0.343 0.523 0.541 0.557 0.575 0.578 Lần 4.42 5.08 5.53 5.86 6.09 Lần 4.19 4.52 5.08 5.53 5.4 Lần 4.52 4.87 5.08 5.63 5.76 Trung bình 4.38 4.82 5.23 5.67 5.75 Bảng Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân Nhiệt độ (oC) Hàm lượng ni-tơ amin (%) Phụ lục Mẫu 35 40 45 50 55 60 Lần 0.507 0.501 0.487 0.527 0.548 0.523 Lần 0.49 0.527 0.511 0.519 0.531 0.506 Lần 0.49 0.518 0.479 0.519 0.54 0.506 Mức độ thủy phân (%) Trung bình 0.496 0.515 0.492 0.522 0.54 0.512 Lần 3.96 3.81 3.46 4.47 4.37 Lần 3.54 4.47 4.07 4.27 4.57 3.94 Lần 3.54 4.24 3.26 4.27 4.8 3.94 Trung bình 3.68 4.17 3.6 4.34 4.79 4.08 1.3 Hàm lượng ni-tơ amin mức độ thủy phân dịch thủy phân điều kiện tối ưu Hàm lượng ni-tơ amin (%) Lần Lần Lần Trung bình 0.544 0.509 0.527 0.527 Mức độ thủy phân (%) Lần Lần Lần Trung bình 4.91 4.01 4.46 4.46 Phụ lục PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU HĨA SINH 2.1 Phương pháp xác định hàm lượng ni-tơ tổng số protein thô theo phương pháp Kjeldahl 2.1.1 Nguyên tắc Tất dạng ni-tơ có thể hay mơ gọi ni-tơ tổng số Ni-tơ có thành phần amino acid protein ni-tơ protein Ni-tơ thành phần protein muối vơ cơ, acid nitric, amino acid tự do, pepit, ure dẫn xuất ure, alkaloid, purin pyrimidin ni-tơ phi protein Ni-tơ tổng số = ni-tơ protein + ni-tơ phi protein Trước tiên mẫu vơ hóa H2SO4 đặc nhiệt độ cao có chất xúc tác Các phản ứng q trình vơ hóa xảy sau: H2SO4 → 2H2O + 2SO2 +O2 Oxi tạo thành phản ứng lại oxi hóa nguyên tố khác Các phân tử chứa ni-tơ tác dụng H2SO4 tạo thành NH3 Ví dụ protein bị thủy phân thành amino acid , C H amino acid tạo thành CO2 H2O, cịn ni-tơ giải phóng dạng NH3 kết hợp với H2 SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan dung dịch 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 Các nguyên tố P, K, Ca, Mg….chuyển thành dạng oxit: P2O5, MgO, CaO, K2O Đuổi amoniac khỏi dung dịch NaOH: (NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + H2O + 2NH3 NH3 bay với nước sang bình hứng, bình hứng chứa H3BO3 NH4OH + H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 7H2O 2.1.2 Dụng cụ − Máy cất đạm − Bình Kjeldahl, dung tích 100, 250ml − Bình định mức dung tích 100ml − Ống đong dung tích 10, 100ml − Buret 25ml − Pipet 10, 20, 50ml − Bình nón, dung tích 250ml − Chén cân − Phễu thủy tinh − Thìa nhựa − Bếp điện − Giấy lọc không tro − Giấy đo pH − Cân phân tích, độ xác 0.001 g Phụ lục 2.1.3 Hóa chất − Axit sunfuric (H2SO4) đậm đặc dung dịch 0.1N − Natri hydroxyt (NaOH), dung dịch 33% dung dịch 0.1N − Hỗn hợp xúc tác: đồng sunfat (CuSO4) + Kali sunfat (K2SO4), tỷ lệ 1/10 (theo khối lượng) − Chỉ thị hỗn hợp: 200mg đỏ metyl 100mg xanh metylen hòa tan 200ml etanol (C2H5OH) 96% − Phenolphtalein, dung dịch 1% etanol 60% 2.1.4 Cách tiến hành Cân xác 0.3 – 0.5g mẫu thử vào mẩu giấy lọc khơng tro, cuộn lại, cho vào bình Kjeldahl cho mẫu thử khơng dính vào cổ bình, cho tiếp 1g hỗn hợp xúc tác 10ml axit sunfuric đậm đặc − Nếu mẫu thử loại mắm đặc: cho mẫu thử vào chén cân với thìa nhựa lấy khoảng 0.5g mẫu thử vào mẩu giấy lọc khơng tro, cuộn lại, cho vào bình Kjeldahl để vơ hóa Thìa nhựa lại đặt vào bình cân, cân khối lượng lại M2 Hiệu số hai lần cân khối lượng mẫu thử lấy để phân tích − Nếu mẫu thử nước mắm: Dùng pipet lấy xác 10ml nước mắm lọc cho vào bình định mức dung tích 200ml, thêm nước cất đến vạch mức, lắc Hút xác 20ml dịch pha lỗng, cho vào bình Kjeldahl, thêm chất xúc tác – 5ml axit sunfuric đặc vào để vơ hóa Dùng phễu nhỏ đậy bình Kjeldahl, đặt bình nghiêng 40 độ bếp điện tủ hốt Đun 15-20 phút cho chất lỏng bình khơng sủi phồng, khơng bắn lên cổ bình (có thể để qua đêm đun) Sau đặt bình thấp gần bếp dịch vô hóa bình suốt xanh (khơng có màu vàng nhạt) mặt bình hồn tồn Ngừng đun, để nguội Trong trình đun, thấy mẫu không trắng, ngừng đun, để nguội, cho thêm khoảng 0.5g chất xúc tác vào tiếp tục đun Nếu thấy mẫu cịn đen mà cạn, lấy để nguội, cho thêm khoảng 3ml axit sunfuric đậm đặc vào tiếp tục đun dung dịch đạt yêu cầu Lấy xác lượng axit sunfuric 0.1N không lớn 25ml (tùy theo loại mẫu thử) giọt thị hỗn hợp vào bình nón dung tích 250ml, đặt bình vào ống sinh hàn máy cất đạm cho đầu ống sinh hàn ngập hẳn vào dung dịch Cho cẩn thận dịch vơ hóa vào bình cất, tráng bình Kjeldahl nhiều lần nước cất nước tráng hết phản ứng axit (thử giấy đo pH) Cho tiếp vào bình cất giọt phenolphtalein 1% dung dịch natrihydroxyt 33% dung dịch bình chuyển thành màu hồng, cho tiếp vào dung dịch kiềm, tráng nước cất cho kiềm phễu khóa máy lại Cuối cho lớp nước cất cao 1.5 – 2cm phễu để kiểm tra Phụ lục độ kín máy (Ghi toàn lượng nước cất dùng để biết lượng nước cất cho vào chuẩn độ mẫu trắng) Cho nước lạnh chảy qua ống sinh hàn bắt đầu chưng cất liên tục 40 phút kể từ dung dịch bình bắt đầu sơi Hạ bình hứng để ống sinh hàn lên khỏi mặt nước, dùng bình tia rửa đầu ống sinh hàn, tiếp tục chưng cất vài phút Sau hứng nước chưng chảy đầu ống sinh hàn, thử giấy đo pH thấy khơng có phản ứng kiềm Dùng natri hydroxyt 0.1N chuẩn độ lượng axit dư bình hứng dung dịch bình chuyển từ màu tím sang xanh mạ Tiến hành xác định mẫu trắng với tất lượng hóa chất nước cất bước thí nghiệm trên, khơng có mẫu thử 2.1.5 Tính kết Hàm lượng nitơ tổng số (X7) tính phần trăm theo cơng thức: X7 = (V1 − V2 ) * 0.0014 * 100 m Trong đó: V1 – Thể tích dung dịch natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính ml; V2 – Thể tích dung dịch natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính ml; m – khối lượng mẫu thử, tính g; 0,0014 – Số g nitơ tương ứng với 1ml dung dịch natri – hydroxyt 0,1N; 100 – Hệ số tính phần trăm Chú thích: Đối với nước mắm, mẫu thử pha loãng 20 lần, lấy 20ml dịch pha loãng để xác định Hàm lượng nitơ tổng số (X7) tính g/l theo cơng thức: X7 = (V1 − V2 ) * 0.0014 * 20 * 1000 = 2.8(V1 − V2 ) 10 Trong đó: 20 – Độ pha lỗng nước mắm; 10 – Thể tích nước mắm pha lỗng lấy để xác định, tính ml; 1000 – Hệ số tính g/l; Các ký hiệu khác ghi Phương pháp tính hàm lượng prơtein thơ Hàm lượng nitơ trung bình phân tử protein sản phẩm thủy sản 16% Vì hàm lượng protein thơ mẫu thử hàm lượng nitơ tổng số nhân với hệ số 6.25 Hàm lượng protein thơ (X8) tính phần trăm theo cơng thức: X8 = X7 6.25 Trong đó: Phụ lục X7 – Hàm lượng nitơ tổng số, tính phần trăm; 6.25 – Hệ số chuyển nitơ tổng số protein thô (100:16 = 6.25) 2.2 Phương pháp xác định hàm lượng chất béo có nguyên liệu 2.2.1 Nguyên tắc Chất béo nguyên liệu trích ly ete etylic thiết bị chiết Soxhlet Dung mơi làm bay lượng chất béo cịn lại xác định cách cân 2.2.2 Dụng cụ − Thiết bị chưng cất Soxhlet − Cối chày − Nồi cách thủy − Cân phân tích − Bình hút ẩm − Giấy lọc − Bông thấm nước 2.2.3 Hóa chất − Natri sulfat (Na2SO4) khan canxi sulfat (CaSO4) khan − Ete etylic (C2H5OC2H5), tinh khiết phân tích 2.2.4 Cách tiến hành Cân từ 5g đến 10g mẫu thử chuẩn bị, xác đến 0.001 g, cho vào cối sứ nghiền với khoảng 20g đến 30g natri sulfat khan canxi sulfat khan để thu hỗn hợp bột khô Chuyển hết hỗn hợp thu vào gói giấy lọc kín đầu, dùng bơng thấm ete lau cối chày sứ cho vào ống giấy, sau gói kín đầu lại (gói giấy phải bỏ lọt vào bình chiết thiết bị phải thấp chiều cao ống xiphơng) Gói tiếp lần giấy lọc nữa, ý không để hai mép giấy hai lần gói trùng vào Đặt gói mẫu vào bình chiết thiết bị nối với bình cầu (đã biết trước khối lượng) Cho ete vào bình chiết cho vừa ngập ống gói mẫu Ngâm mẫu ete khoảng đến ngâm qua đêm Sau thời gian ngâm mẫu, nâng ống sinh hàn lên, cho thêm ete vào bình chiết vừa đủ để chảy xuống bình cầu Chờ cho ete chảy hết, cho tiếp ete vào đến khoảng nửa chiều cao ống xiphông Lắp ống sinh hàn vào cho nước lạnh chảy qua Chưng cất nồi cách thủy khoảng 10 đến 12 Chú ý điều chỉnh nồi cách thủy cho ete tuần hồn từ bình chiết xuống bình cầu ngược lại khoảng lần đến lần giờ, tránh đun nhiệt độ cao (trên 60oC) làm hao hụt dung môi Sau thời gian chưng cất, chờ cho dung mơi chảy hết xuống bình cầu ngừng đun, để nguội tháo ống sinh hàn lấy gói mẫu khỏi bình chiết Lắp lại ống sinh hàn vào chưng cất tiếp cho dung mơi ngưng hết lên bình chiết máy cất Ngừng đun lấy bình cầu ra, cho vào tủ sấy sấy nhiệt độ 50oC đến 60oC 30 phút đến 40 phút Đem để nguội bình hút ẩm 30 phút cân, xác đến 0.001 Phụ lục g Lại sấy tiếp 15 để nguội cân Lặp lại thao tác đến thu khối lượng không đổi Khối lượng chất béo tính lấy khối lượng bình cầu chứa chất béo sấy khô trừ khối lượng bình cầu 2.2.5 Tính kết Hàm lượng chất béo, X, biểu thị phần trăm khối lượng (%), theo công thức: X= m * 100 m Trong đó: m1 – khối lượng chất béo thu được, tính gam (g) m – khối lượng mẫu thử, tính gam (g) 2.3 Phương pháp xác định hàm lượng tro tổng số 2.3.1 Nguyên tắc Mẫu nung nhiệt độ khoảng từ 500oC đến 550oC để đốt cháy hết hợp chất hữu cân phần tro lại 2.3.2 Dụng cụ − Chén nung − Lị nung, điều chỉnh nhiệt độ, xác đến ± 10oC − Tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ, xác đến ± 2oC − Cân phân tích, cân xác đến 0.001 g − Bình hút ẩm − Cốc thủy tinh, dung tích 250ml − Phễu thủy tinh − Đũa thủy tinh − Giấy lọc không tro 2.3.3 Hóa chất Hydro peroxit (H2O2) axit nitric (HNO3) đậm đặc 2.3.4 Cách tiến hành Cân 10g đến 15g mẫu thử, xác đến 0.001 g, cho vào chén nung biết trước khối lượng Mẫu thử đốt từ từ bếp điện có lót lưới amiăng cháy hồn tồn thành than đen (khi đốt khơng để mẫu thử cháy thành lửa) Cho chén chứa mẫu thử vào lò nung, nâng nhiệt độ từ từ đến khoảng từ 500oC đến 550oC giữ nhiệt độ khoảng đến đến mẫu thử thành tro trắng Nếu sau thời gian trên, tro cịn đen lấy chén nung ra, để nguội cho thêm vài giọt hydro peroxit axit nitric đậm đặc tiếp tục nung mẫu đến thành tro trắng Tắt điện lò nung, chờ cho nhiệt độ hạ bớt lấy chén tro ra, cho vào bình hút ẩm, để nguội 30 phút cân, xác đến 0.001 g Tiếp tục nung nhiệt độ 30 phút, để nguội cân Tiến hành nung cân thu khối lượng không đổi Phụ lục 2.3.5 Tính kết Hàm lượng tro tổng số, X1, biểu thị phần trăm khối lượng, tính theo cơng thức: X1 = (G1 − G)  100 m đó: G – khối lượng chén nung, tính gam (g) G1 – khối lượng chén nung tro tổng số, tính gam (g) M – khối lượng mẫu thử, tính gam (g) 2.4 Phương pháp xác định hàm lượng ẩm 2.4.1 Nguyên tắc Dùng nhiệt để loại bỏ nước khỏi mẫu thử Hiệu số khối lượng mẫu thử trước sau sấy khô lượng nước có mẫu thử 2.4.2 Dụng cụ − Chén cân có nắp mài, dung tích 30ml − Bình hút ẩm − Cân phân tích, độ xác 0.001g − Tủ sấy, độ xác ±2oC − Đũa thủy tinh nhỏ, dẹt đầu 2.4.3 Cách tiến hành Cân xác - 5g mẫu thử cho vào chén cân, dùng đũa thủy tinh trộn mẫu thử, dàn thành lớp mỏng Cho tất vào tủ sấy sấy 60-80oC giờ, sau nâng nhiệt độ lên 100-150oC giữ nhiệt độ Chú ý sấy, sau lại dùng đũa thủy tinh nghiền nhỏ cục ra, đảo đều, dàn mỏng sấy Sau sấy giờ, đậy nắp chén cân lại, cho vào bình hút ẩm, để nguội 30 phút, đem cân (cả đũa thủy tinh) Lại sấy tiếp 30 phút nữa, để nguội đem cân Tiến hành sấy cân khối lượng hai lần cân liên tiếp chênh lệch không 0.001g 2.4.4 Tính kết Hàm lượng nước (X1) tính phần trăm theo cơng thức: X1 = (G1 − G2 ) 100 , với m = G1 - G m Trong đó: G – Khối lượng chén cân + nắp chén + đũa thủy tinh, tính g; G1 – k hối lượng chén cân + nắp chén + đũa thủy tinh + mẫu thử trước sấy mẫu, tính g; G2 – khối lượng chén cân + nắp chén + đũa thủy tinh + mẫu thử sau sấy mẫu, tính g; m – khối lượng mẫu thử, tính g; 100 – Hệ số tính phần trăm Phụ lục 10 2.5 Xác định hàm lượng ni-tơ amin phương pháp chuẩn độ formol 2.5.1 Nguyên tắc Trong phân tử acid amin, peptide… có chứa nhóm –NH2 nhóm –COOH nên dung dịch khơng thể tính bazơ hay acid Nếu acid amin tác dụng với formoldehyt tạo thành nhóm –N=CH2 ( metylic) làm cho tính bazơ yếu thể tính acid Do chuẩn chất chuẩn kiềm chất thị acid-bazơ để kết thúc phản ứng 2.5.2 Dụng cụ − Bình định mức dung tích 100, 250, 1000ml − Bình nón, nút mài dung tích 100, 250ml − Cốc thủy tinh dung tích 100, 250ml − Buret 25ml − Pipet 1, 10, 25ml − Phễu thủy tinh − Cân phân tích có độ xác 0.001g − Đũa thủy tinh − Giấy lọc 2.5.3 Hóa chất − Natri hydroxyt (NaOH), dung dịch 0.1N − Bromothimol xanh, dung dịch 0.05% etanol 60% − Phenolphtalein, dung dịch 0.5% etanol 60% − Thimolphtalein, dung dịch 1% etanol 60% − Foocmon tinh khiết, dung dịch trung tính 30%, chuẩn bị sau: 50 thể tích dung dịch foocmon 30% hịa tan với thể tích dung dịch thimolphtalein 1%, thêm dung dịch natri hydroxyt 0.1N dung dịch vừa có màu xanh nhạt − Chỉ thị hỗn hợp: Trộn lẫn thể tích dung dịch bromo-thimol xanh 0.05% với thể tích dung dịch phenolphtalein 0.5% − Natri hydrophotphat, dung dịch M/15(A): cân xác 2.59g Na2HPO4.12H2O (hoặc 1.1876g Na2HPO4.2H2O) hịa tan bình định mức dung tích 100ml, thêm nước cất đến vạch mức − Kali dihydrophophat, dung dịch M/15(B): cân xác 0.707 KH2PO4, hịa tan bình định mức dung tích 100ml, thêm nước cất đến vạch mức − Dung dịch đệm pH = 7.0: Hòa lẫn 61.2ml dung dịch (A) 38.8ml dung dịch (B) − Dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 7.0: Cho vào bình nón dung tích 100ml : 20 ml dung dịch đệm pH = 7.0 0,1ml dung dịch thị hỗn hợp, dung dịch có màu xanh mạ − Dung dịch đệm pH = 9.2: Cân xác 1.9018g natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O) hịa tan bình định mức dung tích 100ml, thêm nước cất đến vạch mức Phụ lục 11 − Dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 9.2: Cho vào bình nón dung tích 100ml: 20ml dung dịch đệm pH = 9.2, 1ml dung dịch thị hỗn hợp Dung dịch có màu tím 2.5.4 Cách tiến hành Cân xác 10 – 15g mẫu thử cho vào cốc thủy tinh dung tích 100ml Dùng nước cất hịa tan mẫu chuyển tồn (cả nước tráng cốc) vào bình định mức dung tích 250ml, thêm nước cất đến khoảng 200ml Sau đó, lắc phút, để yên phút, lặp lại lần Thêm nước cất đến vạch mức, lắc lọc Dùng pipet lấy xác 20ml dịch lọc vào bình nóng dung tích 250ml, thêm 1ml dung dịch thị hỗn hợp, trung hịa dịch lọc dung dịch có màu giống dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 7.0 Sau dùng buret cho thêm 20ml dung dịch foocmon trung tính 30% vào đậy nút bình lại, lắc đều, để yên phút Chuẩn độ dung dịch natri hydroxyt 0.1N dung dịch có màu giống dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 9.2 Tiến hành xác định mẫu trắng với tất lượng hóa chất bước thử nghiệm trên, thay dịch mẫu thử 20ml nước cất 2.5.5 Tính kết Hàm lượng nitơ-amoniac (X10) tính phần trăm theo cơng thức: X10 = (V1 − V2 )  0.0014  250  100 20  m Trong đó: V1 – Thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính ml V2 – Thể tích dung dịch NaOH 0.1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính ml m – Khối lượng mẫu thử, tính g 0.0014 – Số g nitơ tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0.1N 250 – Thể tích tồn dịch lọc, tính ml 20 – Thể tích dịch lọc để xác định, tính ml 100 – Hệ số tính phần trăm 2.6 Xác định hoạt độ enzyme pepsin phương pháp Anson cải tiến 2.6.1 Nguyên tắc Pepsin enzyme thuộc họ protease Dưới tác dụng pepsin, casein bị phân giải thành đoạn peptide ngắn acid amin có tyrosine Xác định lượng tyrosine tạo thành thuốc thử Folin, phản ứng tyrosine làm Folin chuyển thành màu xanh hấp thu quang mạnh bước sóng 660nm Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân tác dụng enzyme 2.6.2 Dụng cụ − Ống nghiệm − Giấy lọc − Bể ổn nhiệt Phụ lục 12 − Tủ ấm − Cối sứ − Máy đo quang phổ UV-Vis − Máy đo pH − Bình định mức 50 ml, 100 ml, 1000 ml − Pipet ml, ml, 10 ml, 25 ml 2.6.3 Hóa chất − HCl 0.1M − Na2CO3 0.4M − Dung dịch Trichloracetic 0.4M − Tyrosin tinh khiết − NaOH 0.1M − Thuốc thử Folin − H3PO4 1/30M − Dung dịch Casein 1%: Cân 0.5g casein từ sữa Thêm 12.5 ml dung dịch NaOH 0.1 M, đun nóng bồn nước nhiệt độ 90 – 95oC 10 phút (tuyệt đối không để nước sôi) Sau làm lạnh, điều chỉnh pH đến 2.0 dung dịch acid phosphoric 1/30 M Thêm nước cất vừa đủ 50ml 2.6.4 Cách tiến hành 1.6.4.1 Dựng đường chuẩn Tyrosin Pha dung dịch Tyrosin 1mM: Cân xác 90.595mg Tyrosin thêm dung dịch HCl 0.1M cho vừa đủ 500ml Từ dung dịch pha tiếp dung dịch Tyrosin nồng độ khác nhau: 0; 0.1; 0.2; 0.4; 0.8 mM Cách pha theo bảng sau: [Tyrosine](mM) 0.1 0.2 0.4 0.8 HCl 0,1M (ml) 0.9 0.8 0.6 0.2 Tyrosine 1mM (ml) 0.1 0.2 0.4 0.8 Thêm ml dung dịch Na2CO3 0.4 M vào ml dung dịch Tyrosin (các nồng độ khác trên) thêm ml thuốc thử Folin pha loãng lần vào dung dịch hỗn hợp Sau trộn đều, để ổn định dung dịch 15 phút Đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 660 nm (ghi nhận kết A0; A1; A2; A3; A4; A5) Dựng đường chuẩn theo hàm lượng g Tyrosin độ hấp thụ 1.6.4.2 Xác định hoạt tính enzyme protease Cho ml dung dịch chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ nhiệt độ 50  0.5oC 10 -15 phút Sau thời gian ủ, cho ml dung dịch enzyme vào lắc Đem ủ hỗn hợp nhiệt độ 37  0.5oC 60 phút Sau đó, cho vào hỗn hợp ml dung dịch acid Trichloracetic 0.4M Để ổn định dung dịch 15 phút, sau lọc dung dịch qua giấy lọc để loại tủa Cho ml dung dịch Na2CO3 0.4M vào ml dịch lọc, thêm ml thuốc thử Phụ lục 13 Folin pha loãng lần vào dung dịch hỗn hợp Trộn đều, để yên 15 phút Khi dung dịch xuất màu xanh, đem đo độ hấp thụ bước sóng 660 nm (Am) Mẫu đối chứng: lấy ml enzyme, ml dung dịch acid Trichloracetic 0.4M cho vào ống nghiệm lắc Thêm ml dung dịch chất casein 1% tiến hành bước tương tự mẫu thí nghiệm với điều kiện Ghi nhận kết độ hấp thụ bước sóng 660 nm (At) 2.6.5 Tính kết Một đơn vị hoạt tính (Unit) enzyme protease xác định lượng enzyme để tạo lượng amino acid tương đương với 1mol Tyrosin phút điều kiện thí nghiệm Hoạt tính enzyme protease: N= ( Am − At ) − b  a (11) (10)  (1)  (2) Trong đó: N – Hoạt độ enzyme pepsin (U/ml) Am – Độ hấp thụ mẫu At – Độ hấp thụ mẫu đối chứng a,b – Là hệ số lấy từ phương trình đường chuẩn tyrosin ( y= ax+b) (11) – Tổng thể tích thực phản ứng (ml) (10) – Thời gian phản ứng (phút) (1) – Tổng thể tích enzyme sử dụng (ml) (2) – Thể tích sử dụng phép đo độ hấp thụ quang (ml) Phụ lục 14 PHỤ LỤC CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 3.1 Cân phân tích 3.2 Cân kỹ thuật 3.3 Máy đo pH 3.4 Máy xay sinh tố Phụ lục 15 3.5 Máy lắc khô 3.6 Máy ly tâm lạnh 3.7 Tủ lạnh 4oC Phụ lục 16 3.8 Tủ lạnh âm 20oC 3.9 Bếp điện Phụ lục 17 ... Bùi Xuân Đông Trang Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu thịt đỏ cá ngừ 1.1.1 Đặc điểm thịt đỏ cá ngừ Cá ngừ loại thủy sản có giá trị... Trang Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme pepsin thô Đối tượng phương pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu − Thịt đỏ cá ngừ - sản phẩm phụ ngành công nghiệp chế biến cá ngừ, ... định thành phần thịt đỏ cá ngừ − Tách chiết chế phẩm enzyme pepsin thô từ nội tạng cá ngừ − Nghiên cứu điều kiện tối ưu để thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết