Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme bromelain thô

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN THỊT ĐỎ CÁ NGỪ BẰNG ENZYME BROMELAIN THÔ Người hướng dẫn: TS BÙI XUÂN ĐÔNG Sinh viên thực hiện: LÊ TRẦN TƯỜNG VY Số thẻ sinh viên: 107120286 Lớp: 12SH Đà Nẵng, 5/2017 TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme bromelain thô Sinh viên thực hiện: Lê Trần Tường Vy Số thẻ SV: 107120286 Lớp: 12SH Nội dung: Thịt đỏ cá ngừ nguồn phụ phẩm của ngành công nghiệp chế biến cá ngừ Trong nghiên cứu này, theo khảo sát thành phần hóa học thịt đỏ cá ngừ cho thấy hàm lượng protein chiếm 26,95% Mục đích của đề tài nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme bromelain thô để tiến tới sản xuất dịch thủy phân từ thịt đỏ nhằm tạo sản phẩm có giá trị gia tăng Kết quả nghiên cứu cho thấy, đã tách chiết chế phẩm enzyme bromelain thô có hoạt độ 0,033±0,001 U/ml (theo phương pháp Anson, với chất casein, pH 6,5, nhiệt độ t=37°C, thời gian phản ứng giờ) Xác định điều kiện thích hợp để thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng CP enzyme bromelain thô: tỷ lệ phối trộn nước: nguyên liệu 4:1 (w/w); thể tích (ml) CP enzyme bromelain thô bổ sung theo khối lượng thịt đỏ cá ngừ (g) 3/10; thời gian phản ứng giờ; nhiệt độ thủy phân 50ºC pH môi trường phản ứng pH 6,5 (được điều chỉnh bằng NaOH) Từ khóa: Thủy phân; thịt đỏ cá ngừ; dịch đạm; bromelain thô; chồi ngọn dứa; tách chiết Abstract: Tuna red meat is a by-product of the tuna processing industry In this study, the tuna red meat showed that the protein content was 26.95% The purpose of this study is to study the hydrolysis of tuna red meat protein by crude bromelain enzyme to proceed to produce hydrolysis from red meat to produce value added products Results of the study showed that the crude bromelain enzyme extracts were active at 0,033±0,001 U/ml (Anson method, casein substrate, pH 6,5, t=37ºC at response time is hour) Determine appropriate conditions for hydrolysis of tuna red meat by crude bromelain: water: material is 4:1 (w/w); volume (ml) crude bromelain enzyme supplemented by tuna red meat weight (g) is 3/10; response time is hours; hydrolysis temperature is 50°C and reaction pH is pH 6,5 (adjusted with NaOH) Key word: Hydrolysis; tuna red meat; hydrolysed products; crude bromelain; pineapple bud; extraction LỜI CẢM ƠN Sau tháng thực đồ án tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme bromelain thô”, đến em đã bản hồn thành đề tài của so với mục tiêu đã đề Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn chân thành sâu sắc đến thầy Bùi Xuân Đông, người đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ em suốt q trình nghiên cứu hồn thành đồ án Em xin chân thành cảm ơn ban Giám hiệu Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đồ án tốt nghiệp Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Võ Công Tuấn ThS Phạm Thị Kim Thảo nhân viên phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, những người đã giúp đỡ em rất nhiều suốt thời gian nghiên cứu phòng thí nghiệm Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm Khoa Hóa, thầy cô bạn sinh viên Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện, giúp đỡ em suốt thời gian học tập trường Bên cạnh đó, xin cám ơn những người thân gia đình đã tạo điều kiện động viên về tinh thần, giúp đỡ về vật chất suốt trình học tập trường hoàn thành bản luận văn Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn tất cả giúp đỡ quý báu đó! Đà Nẵng, tháng năm 2017 i MỤC LỤC Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục i ii iii Danh sách bảng Danh sách hình vẽ v vi Danh sách cụm từ viết tắt vii Trang MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của đề tài Mục tiêu nghiên cứu .1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.2 Phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu 4.1 Phương pháp vật lý 4.2 Phương pháp hóa lý 4.3 Phương pháp hóa sinh Ý nghĩa khoa học thực tiễn của đề tài Kết cấu đồ án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu thủy phân protein thủy sản 1.1.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nước ngồi 1.2 Tổng quan về cá ngừ thịt đỏ cá ngừ 1.2.1 Giới thiệu về cá ngừ 1.2.2 Thịt đỏ cá ngừ ứng dụng 10 1.3 Tổng quan về enzyme protease 11 1.3.1 Khái niệm chung về enzyme .11 1.3.2 Enzyme protease 12 1.4 Tổng quan về trình thủy phân protein 13 1.4.1 Qúa trình thủy phân 13 ii 1.4.2 Yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein bằng enzyme 13 1.4.3 Các phương pháp thủy phân protein .15 1.4.4 Ứng dụng của trình thủy phân .16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .17 2.1 Vật liệu thiết bị phục vụ nghiên cứu 17 2.1.1 Vật liệu 17 2.1.2 Thiết bị 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Xác định hoạt độ đánh giá cảm quan CP enzyme bromelain thô 19 2.2.2 Xác định thành phần hóa học của thịt đỏ cá ngừ 20 2.2.3 Xác định hàm lượng nitơ amin, mức độ thủy phân của dịch đạm thủy phân 22 2.2.4 Quy trình nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng CP enzyme bromelain thô 22 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .25 3.1 Kết quả xác định thành phần hóa học của thịt đỏ cá ngừ 25 3.2 Kết quả xác định hoạt độ chỉ tiêu khác của CP enzyme bromelain thô 25 3.3 Kết quả xác định thơng số thích hợp cho q trình thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng CP enzyme bromelain thô 26 3.3.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của nồng độ CP enzyme 26 3.3.2 Kết quả xác định ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn nước: nguyên liệu 28 3.3.3 Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian thủy phân 30 3.3.4 Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .34 Kết luận 34 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC iii DANH SÁCH CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: Cá ngừ chấm [41]……………………………………………………………9 Hình 1.2: Cá ngừ chù [42]…………………………………………………………… Hình 1.3: Cá ngừ [43]……………………………………………………………… Hình 1.4: Cá ngừ sọc dưa [44]……………………………………………………… Hình 1.5: Cá ngừ bị [45]………………………………………………………………9 Hình 1.6: Thịt đỏ cá ngừ………………………………………………………………10 Hình 2.1: Thịt đỏ cá ngừ………………………………………………………………17 Hình 2.2: Chồi dứa CP enzyme bromelain thơ…………………………………….19 Hình 3.1: Sơ đồ mơ tả tiến trình thu nhận CP enzyme bromelain thơ từ chồi ngọn dứa…………………………………………………………………………………… 25 Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ CP enzyme đến pH độ tích tụ nitơ amin dịch đạm………………………………………………………………………………26 Hình 3.3: Mức độ thủy phân của dịch cá nồng độ CP enzyme thay đởi………….27 Hình 3.4: Ảnh hưởng của tỉ lệ nước: nguyên liệu đến pH độ tích tụ nitơ amin dịch đạm………………………………………………………………………………28 Hình 3.5: Mức độ thủy phân dịch đạm thay đổi tỉ lệ nước: nguyên liệu…………………………………………………………………………………….29 Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến pH độ tích tụ nitơ amin dịch đạm………………………………………………………………………………30 Hình 3.7: Mức độ thủy phân của dịch cá thời gian thủy phân thay đổi………… 31 Hình 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến pH độ tích tụ nitơ amin dịch đạm……………………………………………………………………………………32 Hình 3.9: Mức độ thủy phân của dịch cá nhiệt độ thủy phân thay đổi………… 33 iv Tên đề tài: Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme bromelain thơ MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cá ngừ sản phẩm chế biến từ cá ngừ có giá trị dinh dưỡng kinh tế cao Nguyên liệu cá sau sản xuất mặt hàng đồ hộp, đông lạnh, xông khói,… thường loại phần thịt đỏ có thể lên đến 20% (Irineu Batista, 1999) [39] Lượng thịt đỏ thường sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi, bán thị trường với giá từ 4000 – 5000 đồng/kg [5] Tuy nhiên, việc sản xuất thức ăn chăn nuôi từ thịt đỏ đạt hiệu quả khơng cao, giá thành bán cịn rất thấp việc thủy phân từ thịt đỏ cá ngừ rất cần thiết Dịch đạm thủy phân nói chung từ thịt đỏ cá ngừ nói riêng sản phẩm chứa acid amin tự do, có giá trị dinh dưỡng dễ hấp thu có giá trị kinh tế cao so với việc bán nguyên liệu thô thị trường Trong nước có nghiên cứu về việc tách chiết protein từ thịt đỏ cá ngừ của Phạm Thị Hiền 2012 [5],… chưa tồn diện Việc bở sung enzyme để tăng vận tốc trình thủy phân nâng cao hiệu suất thủy phân tạo dịch đạm với tính chất mong muốn Trên giới đã có nghiên cứu về sản xuất dịch đạm thủy phân từ cá bằng enzyme (Ling Lin Liu CS, 1979; Guerard F., 2002) enzyme sử dụng enzyme thương mại có tính ổn định giá thành cao [29; 32] Xuất phát từ tình hình thực tế trên, tơi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme bromelain thô” để xác định số điều kiện (tỉ lệ nước: nguyên liệu, tỉ lệ enzyme, thời gian thủy phân, nhiệt độ) ảnh hưởng đến trình thủy phân tác động trực tiếp của CP enzyme bromelain thơ nhằm tìm kiếm giải pháp chế biến thịt đỏ cá ngừ với giá thành rẻ Mục tiêu nghiên cứu - Xác định thành phần hóa học thịt đỏ cá ngừ - Tách chiết CP enzyme bromelain thô từ chồi ngọn dứa, dựa quy trình cơng nghệ tách chiết đã nghiên cứu trước - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng CP enzyme bromelain thô sở khảo sát đơn biến độc lập tỉ lệ phối trộn nước: nguyên liệu, tỉ lệ bổ sung CP enzyme, nhiệt độ môi trường phản ứng thời gian thủy phân SVTH: Lê Trần Tường Vy GVHD: TS Bùi Xuân Đông Trang Tên đề tài: Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme bromelain thô Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu - Nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ lấy mẫu từ Công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long, Đà Nẵng - Phụ phẩm chồi ngọn dứa lấy mẫu từ chợ Cẩm Kim, Hội An 3.2 Phạm vi nghiên cứu - Sử dụng chồi ngọn dứa chợ để tách chiết enzyme bromelain thơ sử dụng cho q trình thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ - Thịt đỏ cá ngừ sau vận chủn về phịng thí nghiệm phân vào túi PE, bảo quản tủ đông -22°C - Thịt đỏ cá ngừ sau rã đông tiến hành đem xay bở sung enzyme bromelain thô vào để thủy phân Sau đó xác định điều kiện ảnh hưởng đến q trình thủy phân thơng qua hiệu suất thủy phân thay đổi pH Phương pháp nghiên cứu 4.1 Phương pháp vật lý Xác định nhiệt độ: Dùng nhiệt kế để xác định nhiệt độ trình thủy phân protein từ thịt đỏ ngừ 4.2 Phương pháp hóa lý Xác định pH: Dùng máy đo pH để xác định pH mơi trường phản ứng enzyme 4.3 Phương pháp hóa sinh - Xác định hàm lượng protein theo tiêu chuẩn NMKL No.6, 4th 2003 - Xác định hàm lượng chất béo (lipit) theo tiêu chuẩn NMKL số 131, 1989 - Xác định hàm lượng nước (độ ẩm) theo TCVN 3706 - 1990 - Xác định hàm lượng tro theo tiêu chuẩn NMKL No.173, 2nd Ed, 2005 - Xác định hàm lượng Histamin theo tiêu chuẩn Thủy sản, nước mắm: 3.5/CL2.PP.3.9 (HPLC) - Xác định hàm lượng nitơ acid amin nguyên liệu ban đầu theo TCVN 3708-1990 - Xác định hàm lượng nitơ tổng số theo NMKL No.6, 4th 2003 - Xác định hoạt lực protease theo phương pháp Anson cải tiến - Xác định hàm lượng nitơ amin dịch đạm theo TCVN 3707 –1990 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Làm sở khoa học cho việc định hướng sử dụng hiệu quả nguồn thịt đỏ cá ngừ để sản xuất sản phẩm có giá trị gia tăng, đồng thời hạn chế việc ô nhiễm môi trường SVTH: Lê Trần Tường Vy GVHD: TS Bùi Xuân Đông Trang Tên đề tài: Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme bromelain thô - Lựa chọn phương pháp điều kiện tối ưu để thu nhận dịch thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme papain thô đạt hiệu suất cao nhất Kết cấu đồ án Đồ án gồm phần sau: Tóm tắt Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục bảng biểu, hình vẽ Danh mục ký hiệu, từ viết tắt Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả thảo luận Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục SVTH: Lê Trần Tường Vy GVHD: TS Bùi Xuân Đông Trang Tên đề tài: Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme bromelain thô CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu thủy phân protein thủy sản 1.1.1 Tình hình nghiên cứu nước Một số nghiên cứu liên quan tới vấn đề đặt của nghiên cứu thực điều kiện nước sau: Theo Nguyễn Trọng Cẩn có thể sản xuất dịch đạm thủy phân từ nguyên liệu cá bằng cách sử dụng Aspergillus orizae vi khuẩn Khi sử dụng mốc Aspergillus orizae để thủy phân thịt cá mốc có chứa hệ enzyme protease innulase, imetase, asparaginase, glutaminase, proteolytic Những enzyme có tác dụng thủy phân điều kiện thích hợp là: - Nhiệt độ 37-40ºC - pH = 6-8 - Tỉ lệ nấm mốc thường sử dụng 3-4% so với nguyên liệu Thời gian thủy phân tùy thuộc vào mức độ hoạt động của nấm mốc yêu cầu hàm lượng đạm của sản phẩm Đối với sản xuất nước mắm, thời gian thủy phân từ 1015 ngày thu chượp chín Lượng muối bở sung vào q trình thủy phân thường từ 4-6% để tránh thối rữa Nếu bổ sung lượng muối cao protease của mốc bị ức chế, không hoạt động Dịch thủy phân xong đem lọc Dịch lọc để riêng Bã lọc dùng nước rửa từ 23 lần, nước rửa có thể cho chung vào dịch lọc, hỗn hợp đem đun sôi, vớt bọt thu dịch đạm thủy phân Sản xuất dịch đạm thủy phân từ nấm mốc có thể có những nhược điểm sau: - Dịch đạm không có hương thơm, dễ bị đắng, có thể xác vi sinh vật tồn tại, loại muối canxi, ma-giê có muối ăn - Dịch đạm dễ bị chua, có nhiều nguyên nhân: có thể lượng tinh bột mà mốc sử dụng không hết trình chế biến lên men lactic, có thể acid bay hình thành cá bị ươn [8] Năm 1997, Vũ Xuân Dũng đã thực nghiên cứu “Phân lập, lựa chọn chủng vi khuẩn chịu kiềm, chịu mặn, chịu nhiệt có hoạt tính protease cao thăm dị khả ứng dụng vào q trình sản xuất nước mắm ngắn ngày” Kết quả đã tuyển chọn chủng vi khuẩn có đầy đủ những đặc tính xác định đó chính Bacillus kí hiệu Bacillus D15 Sử dụng chủng Bacillus D15 vào sản xuất nước mắm với nồng SVTH: Lê Trần Tường Vy GVHD: TS Bùi Xuân Đông Trang Tên đề tài: Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme bromelain thô [32] F Guerard, L Guimas, A Binet (2002) "Production of tuna waste hydrolysates by a commercial neutral protease preparation" Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 19, 489-498 [33] Sofiane Ghorbel, Nabil Souissi, Yosra Triki-Ellouz, Laurent Dufossé, Fabienne Guérard, Moncef Nasri (2005) "Preparation and testing of Sardinella protein hydrolysates as nitrogen source for extracellular lipase production by Rhizopus oryzae" World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21 (1), 33-38 [34] Raynald Jacques LeBlanc (2005) Fish hydrolysates as salt replacement Google Patents [35] Anusha GP Samaranayaka, Eunice CY Li-Chan (2008) "Autolysis-assisted production of fish protein hydrolysates with antioxidant properties from Pacific hake (Merluccius productus)" Food Chemistry, 107 (2), 768-776 [36] SY Yu, LK Tan (1990) "Acceptability of crackers (‘Keropok’) with fish protein hydrolysate" International Journal of Food Science & Technology, 25 (2), 204-208 [37] Mahmoudreza Ovissipour, Abdolmohammad Abedian Kenari, Ali Motamedzadegan, Rajab Mohammad Nazari (2012) "Optimization of enzymatic hydrolysis of visceral waste proteins of yellowfin tuna (Thunnus albacares)" Food and bioprocess technology, (2), 696-705 [38] Faouzi Ben Rebah, Nabil Miled (2013) "Fish processing wastes for microbial enzyme production: a review" Biotech, 1-11 [39] Batista I., 1999 Recaery of proeins from fish waste products by alkaline exraction, Eur Food Res Technol, 210, 84–89 [40] Livingston J.D and Brown D.W (1981) The chemistry of myoglobin and its reactions Food Technology Tài liệu web [41] http://wrec.igfa.org/WRecordsList.aspx?lc=AllTackle&cn=Kawakawa [42]https://cookwithkathy.wordpress.com/2014/04/18/hira-frigate-mackerelnigiri-sushi/ [43] http://www.sortenoscia.com/2014/07/riconoscere-i-tunnidi.html [44] http://www.vietseafood.vn/2011/11/tuna-longtail-thunnus-tonggol.html [45]https://www.slideshare.net/CngAnhB3/bi-ging-bo-qun-sn-phm-sau-thuhoch-nguyen-hong-ngan [46]http://www.sigmaaldrich.com/life-science/learning-center/life-sciencevideo/universal-protease.html SVTH: Lê Trần Tường Vy GVHD: TS Bùi Xuân Đông Trang 37 PHỤ LỤC Phương pháp phân tích tiêu lý hóa sinh 1.1 Xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Anson cải tiến 1.1.1 Nguyên tắc Bromelain enzyme thuộc họ protease Dưới tác dụng của Bromelain, casein bị phân giải thành đoạn peptide ngắn acid amin đó có tyrosine Xác định lượng tyrosine tạo thành thuốc thử Folin, phản ứng của tyrosine làm Follin chuyển thành màu xanh hấp thu quang mạnh nhất bước sóng 660nm Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân tác dụng của enzyme 1.1.2 Hóa chất cần phân tích HCl 0,1M Na2CO3 0,4M Dung dịch Trichloracetic 0,4M Tyrosin tinh khiết NaOH 0,1M Thuốc thử Folin H3PO4 1/30M Đệm Phosphate 0,1M, pH =7,0: Cân 0,5836g NaH2PO4.H2O (Monosodium phosphate monohydrate) 1,5466 Na2HPO4.7H2O (Disodium phosphate, heptahydrate) Hòa tan muối với nước cất để vừa đủ 100ml Dung dịch Casein 1%: Cân 0,5g casein từ sữa Thêm 12,5 ml dung dịch NaOH 0,1 M, đun nóng bồn nước nhiệt độ 90 – 95oC 10 phút (Tuyệt đối không để nước sôi) Sau làm lạnh, điều chỉnh pH đến 6,5 bằng dung dịch acid phosphoric 1/30 M Thêm vào dung dịch 10 ml dung dịch đệm Phosphate (pH 7,0) 0,1M Thêm nước cất vào dung dịch để đạt thể tích 50 ml 1.1.3 Cách tiến hành - Dựng đường chuẩn Tyrosin Pha dung dịch Tyrosin 1mM: Cân chính xác 90,595mg Tyrosin thêm dung dịch HCl 0,1M cho vừa đủ 500ml Từ dung dịch pha tiếp dung dịch Tyrosin nồng độ khác nhau: 0; 0.1; 0.2; 0.4; 0.8 mM Cách pha theo bảng sau: [Tyrosine] (mM) 0,1 0,2 0,4 0,8 HCl 0,1M (ml) 0,9 0,8 0,6 0,2 Tyrosine 1mM (ml) 0,1 0,2 0,4 0,8 Thêm ml dung dịch Na2CO3 0,4 M vào ml dung dịch Tyrosin (các nồng độ khác trên) thêm ml thuốc thử Folin đã pha loãng lần vào dung dịch hỗn hợp Sau trộn đều, để ổn định dung dịch 15 phút Đo độ hấp thụ của dung dịch bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả A0; A1; A2; A3; A4; A5) Phụ lục Dựng đường chuẩn theo hàm lượng µg Tyrosin độ hấp thụ - Xác định hoạt tính enzyme protease: Cho ml dung dịch chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ nhiệt độ 37 ± 0,5oC 10 - 15 phút Sau thời gian ủ, cho ml dung dịch enzyme vào lắc đều Đem ủ hỗn hợp nhiệt độ 37 ± 0,5°C 60 phút Sau đó, cho vào hỗn hợp ml dung dịch acid Trichloracetic 0,4M Để ổn định dung dịch 15 phút, sau đó lọc dung dịch qua giấy lọc để loại tủa Cho ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào ml dịch lọc, thêm ml thuốc thử Folin đã pha loãng lần vào dung dịch hỗn hợp Trộn đều, để yên 15 phút Khi dung dịch xuất màu xanh, đem đo độ hấp thụ bước sóng 660 nm (Am) Mẫu đối chứng: lấy ml enzyme, ml dung dịch acid Trichloracetic 0,4M cho vào ống nghiệm lắc đều Thêm ml dung dịch chất casein 1% tiến hành bước tương tự mẫu thí nghiệm với điều kiện Ghi nhận kết quả độ hấp thụ bước sóng 660 nm (At) 1.1.4 Kết Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease xác định lượng enzyme để tạo lượng amino acid tương đương với 1µM Tyrosin phút điều kiện thí nghiệm Hoạt tính enzyme protease: N= ( Am − At ) − b  a (11) (10)  (1)  (2) Trong đó: Am: Độ hấp thụ của mẫu; At: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng; a,b: Là hệ số lấy từ phương trình đường chuẩn tyrosin ( y= ax+b); (11): Tởng thể tích thực phản ứng (ml); (10): Thời gian phản ứng (phút); (1): Tổng thể tích enzyme sử dụng (ml); (2): Thể tích sử dụng phép đo độ hấp thụ quang (ml); N: Hoạt tính enzyme protease 1.2 Xác định độ ẩm theo TCVN 3706 – 90 1.2.1 Nguyên tắc Dùng kiềm nhẹ đẩy amoniac khỏi mẫu thử, chưng cất vào dung dịch axit sunfuric Dựa vào lượng axit dư chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyt 0,1N để tính hàm lượng amoniac 1.2.2 Hóa chất cần phân tích - Máy cất đạm; - Bình định mức, dung tích 250, 1000 ml; - Bình nón, dung tích 250ml; - Cốc thủy tinh, dung tích 100ml; - Buret 25ml; Phụ lục - Pipet 10, 20, 50ml; - Giấy lọc; - Giấy đo pH; - Axit sunfuric (H2SO4), dung dịch 0,1N; - Natri hydroxyt (NaOH), dung dịch 0,1N; - Magie oxyt (MgO), dung dịch 5% (có dạng đục sữa) - Chỉ thị hỗn hợp: 200 mg đỏ metyl 100mg xanh metyl hòa tan 200ml etanol (C2H5OH) 96%; - Phenolphtalein, dung dịch 1% etanol 60% 1.2.3 Cách tiến hành Cân chính xác 10 – 15g mẫu thử vào cốc thủy tinh dung tích 100ml Dùng nước cất hịa tan mẫu chủn tồn (cả nước tráng cốc) vào bình định mức dung tích 250ml Thêm nước cất đến khoảng 200ml lắc phút, để yên phút, lặp lại lần Thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều sau đó lọc Lấy chính xác 200ml dung dịch axit sunfuric 0,1N vào bình nón dung tích 250ml giọt chỉ thị hỗn hợp Đặt bình vào đầu ống sinh hàn của máy cất đạm cho đầu ống sinh hàn ngập hẳn vào dung dịch Dùng pipet lấy chính xác 50ml dịch lọc mẫu thử cho vào bình cất của máy cất đạm Thêm tiếp 20ml nước cất, giọt phenolphlatein 1% cho dung dịch magie oxyt 5% vào dung dịch bình xuất màu hồng Tráng bằng nước cất cho dung dịch magie oxyt phễu khóa máy lại (để tránh bị mất amoniac cần khóa máy phễu ít nước cất) Cuối giữ phễu lớp nước cất cao 1,5 - cm để kiểm tra độ kín của máy (ghi toàn lượng nước cất đã cho vào bình cất để biết lượng nước cất cần thiết chuẩn độ mẫu trắng) Cho nước lạnh chảy qua ống sinh hàn cất liên tục 30 phút kể từ dung dịch bình bắt đầu sơi Hạ bình hứng để ống sinh hàn lên khỏi mặt nước Sau đó hứng nước ngưng chảy đầu ống sinh hàn, thử bằng giấy pH, không có phản ứng kiềm Dùng natri hydroxyt 0,1N chuẩn độ lượng axit dư bình hứng dung dịch chuyển từ màu tím sang xanh mạ Tiến hành xác định mẫu trắng với lượng hóa chất, nước cất với bước thí nghiệm trên, không có mẫu thử 1.2.4 Kết Hàm lượng nitơ amoniac (X9) tính bằng phần trăm, theo công thức: X9 = (V1 − V2 )  0,0014  20  1000 = 0,56(V1 − V2 ) 50 Trong đó: V1 – Thể tích dung dịch natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính bằng ml; Phụ lục V2 – Thể tích dung dịch natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính bằng ml; m – Khối lượng mẫu thử, tính bằng g; 250 - Thể tích dịch pha loãng mẫu thử, tính bằng ml; 50 – Thể tích dịch lọc đã pha loãng lấy xác định, tính bằng ml; 100 – Hệ số tính phần trăm Chú thích: Đối với nước mắm, mẫu thử pha loãng 20 lần, lấy 50ml dịch pha loãng xác định Hàm lượng nitơ amoniac (X9) tính bằng phần trăm theo công thức: X9 = (V1 − V2 )  0,0014  20  1000 = 0,56(V1 − V2 ) 50 Trong đó: 20 – Độ pha loãng của nước mắm; 1000 – Hệ số tính g/l; 1.3 Xác định hàm lượng histamine 1.3.1 Nguyên tắc Histamin có mẫu thủy sản sản phẩm thủy sản tách chiết bằng metanol Dịch chiết làm cột trao đổi anion, sau đó tạo dẫn xuất huỳnh quang với o-phthal aldehyt (OPT) Hàm lượng dẫn xuất histamin xác định bằng hệ thống HPLC với detector huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn 1.3.2 Hóa chất cần phân tích - Dung dịch HCl 2,5M; 1M; 0,1M; - Dung dịch NaOH 0,1M; - Dung dịch OPT: Hòa tan 0,100 mg o-phthal aldehyt (OPT 99%, bảo quản lạnh) 100 ml methanol Dung dịch OPT bền tuần bảo quản lạnh chai sẫm màu - Dung dịch H3PO4, 1,19 M; - Các dung dịch chuẩn histamine: + Dung dịch chuẩn gốc histamin, 1000 mg/l: Hoà tan 0,1656 g histamin dihydroclorua (C5H11Cl2N3, M = 184,07 g/mol) axit HCl 0,1 M định mức đến 100 ml Dung dịch chuẩn gốc histamin bền tuần bảo quản lạnh + Dung dịch chuẩn trung gian histamin, 10 mg/l: Pha loãng ml dung dịch chuẩn gốc histamin 1000 mg/l với dung dịch axit HCl 0,1 M định mức đến 100 ml Dung dịch chuẩn trung gian histamin bền tuần bảo quản lạnh + Các dung dịch chuẩn làm việc histamine: Pha loãng lần lượt 1; ml dung dịch chuẩn histamin 10 mg/l dung dịch axit HCl 0,1 M định mức đến 100 ml để dung dịch chuẩn 0,1; 0,2 0,3 mg/l Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc phân tích - Dung dịch pha động Phụ lục Hòa tan 1,089 g kali dihydro phosphat rắn (KH2PO4) gần 600 ml nước Thêm 100 ml axetonitril 0,10 ml trietylamin (TEA), chỉnh pH đến 7,30 ± 0,05 máy đo pH Sau đó, chuyển dung dịch vào bình định mức 1000 ml (4.3) định mức tới vạch bằng nước Trong trình chuẩn bị pha động, dung dịch phải lọc qua giấy lọc 0,45 mm đuổi khí bằng bể siêu trước sử dụng - Nhựa trao đổi anion, Dowex loại x 8, kích thước hạt 50 mesh đến 100 mesh loại tương đương Nhựa trao đổi anion đổ vào dung dịch NaOH 1M với tỉ lệ tương ứng 15 ml NaOH/1g nhựa Tiến hành khuấy đều dung dịch, để yên ít nhất 30 gạn bỏ phần dung dịch Lặp lại thao tác Cuối rửa nhựa với nước Sau đó, đổ nhựa lên giấy lọc rửa nhiều lần với nước hết NaOH Nhựa bảo quản tuần nước 1.3.3 Cách tiến hành 1.3.3.1 Chuẩn bị mẫu thử Nghiền ít nhất 200 g mẫu bằng máy nghiền Cân 10 g mẫu đã nghiền, chính xác đến 0,1 mg cho vào bình nón 150 ml Thêm 50 ml methanol, đồng hóa mẫu bằng máy nghiền Đặt bình chứa dung dịch mẫu bể điều nhiệt nhiệt độ 60ºC 15 phút Sau đó, chuyển tồn sang bình định mức 100 ml; tráng bình nón bằng metanol Để nguội dung dịch tới nhiệt độ phòng định mức đến vạch bằng metanol để có 100 ml (kí hiệu V1) Lắc đều dung dịch lọc qua giấy lọc Dịch chiết thu bền vài tuần bảo quản lạnh Đối với mẫu nước mắm, mẫu thử chuẩn bị bằng cách pha loãng trực tiếp 0,1 ml nước mắm với 0,9 ml metanol ống ly tâm dung tích 1,5 ml, ly tâm lấy 0,1 ml dịch ly tâm đem làm 1.3.3.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu thuỷ sản đã xác định không chứa histamin Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng chuẩn bị với mẫu thử theo 1.3.3.1 1.3.3.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100 ppm Thêm chính xác ml dung dịch chuẩn histamin 1000 mg/l vào 10g mẫu trắng đã nghiền Tiến hành chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi chuẩn bị với mẫu thử theo 1.3.3.1 1.3.3.4 Làm mẫu Chuẩn bị cột làm sạch: Nhồi nhựa trao đổi anion đã chuẩn bị vào cột thủy tinh đến chiều cao khoảng cm giữ không để khô cột Trước sử dụng phải rửa cột thủy tinh với 10 ml nước Làm mẫu: Lần lượt cho ml dịch chiết thu theo 1.3.3.1, 1.3.3.2 1.3.3.3 0,1 ml nước mắm pha loãng theo 1.3.3.1 (kí hiệu V2) qua cột, rửa cột bằng ml đến ml nước Thu dịch chảy vào bình định mức 50 ml đã chứa ml dung dịch axit HCl M Khi lớp dung dịch cách mặt lớp nhựa khoảng mm phải cho tiếp nước vào cột Phụ lục thu khoảng 35 ml dịch giải hấp Khóa cột định mức phần dịch giải hấp thu bằng nước để có 50 ml (kí hiệu V3) 1.3.3.5 Tạo dẫn xuất huỳnh quang - Dung dịch xác định đường chuẩn Hút chính xác ml dung dịch chuẩn histamin làm việc vào bình định mức 50 ml, thêm ml dung dịch NaOH 1M vào bình lắc đều Sau khoảng phút, thêm ml dung dịch OPT vào bình Sau phút, tiếp tục thêm ml dung dịch H3PO4 1,19 M vào bình, định mức đến vạch bằng dung dịch HCl 0,1 M lắc đều bình Chú ý cần lắc đều dung dịch sau lần thêm thuốc thử, ít nhất lần trình tạo phản ứng với dung dịch OPT - Mẫu trắng Hút chính xác ml dịch chiết mẫu trắng đã làm vào bình định mức 50 ml Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất dung dịch xác định đường chuẩn - Mẫu xác định độ thu hồi: Hút chính xác ml dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi đã làm vào bình định mức 50 ml Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất dung dịch xác định đường chuẩn - Mẫu thử: Hút chính xác ml dịch chiết mẫu thử đã làm vào bình định mức 50 ml Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất dung dịch xác định đường chuẩn 1.3.3.6 Tiến hành phân tích HPLC - Điều kiện phân tích + Cột sắc ký: cột C18; + Nhiệt độ cột: 400C; + Pha động: hỗn hợp gồm: KH2PO4 , axetonitril TEA; + Tốc độ dòng : ml/min; + Bước sóng kích thích: 350 nm; + Bước sóng phát xạ: 444 nm; + Thể tích tiêm: 20 ml - Ổn định cột sắc ký 30 chế độ làm việc - Tiêm dung dịch chuẩn đã tạo dẫn xuất huỳnh quang Dựng đường chuẩn theo mối quan hệ tuyến tính của diện tích píc sắc ký nồng độ Đường chuẩn phải có hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) lớn bằng 0,99 - Tiêm dịch chiết mẫu trắng, dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi dịch chiết mẫu thử đã tạo dẫn xuất huỳnh quang vào hệ thống HPLC Mỗi dịch thực lần Tính diện tích trung bình xác định nồng độ histamin dịch chiết từ đường chuẩn 1.3.4 Kết Hàm lượng histamin có mẫu thử, C, biểu thị bằng miligam kilogam (mg/kg) tính theo công thức sau: Phụ lục C= C0 × V1 × V3 m × V2 Trong đó: Co nồng độ histamin có dịch chiết mẫu, tính bằng microgam mililit (mg/ml); V1 thể tích dịch mẫu thử (100 ml) đã định mức; V2 thể tích dịch chiết làm (1 ml dịch chiết thủy sản 0,1 ml dịch nước mắm pha loãng); V3 thể tích dịch đã làm chứa bình định mức (V3 = 50 ml); m khối lượng (10 g) của mẫu thử đã nghiền 1.4 Xác định hàm lượng nitơ acid amin theo TCVN 3708 – 90 1.4.1 Nguyên tắc Tạo điều kiện thích hợp để đồng phốt phát phản ứng với axit amin tạo thành muối của axit amin (1 ion đồng phản ứng với gốc axit amin) Lọc để loại đồng phốt phát thừa Thêm axit axetic kali iodua dịch lọc Ion I- môi trường axit khử ion Cu+, tạo I2 tự Chuẩn độ lượng iot tạo thành bằng dung dịch natri thiosunfat 0,01M 1.4.2 Hóa chất cần phân tích - Bình định mức dung tích 25, 1000ml; - Bình nón dung tích 100ml; - Buret 25, 50ml; - Pipet 1, 5, 10ml; - Phễu thủy tinh; - Giấy lọc cứng (giấy Whatman số 1, số 3); - Dung dịch đồng clorua (A): 27,3g CuCl2 (hoặc 35,4 g CuCl2 12H2O) lít dung dịch; - Dung dịch natri photphat (B): 68,5g Na3PO4 12H2O lít dung dịch (hoặc 64,5g Na2HPO4 hòa tan 500ml nước cất đun sôi để nguội, thêm 7,2g NaOH, sau đó tiếp tục thêm nước cất đun sôi để nguội vào lít); - Dung dịch đệm borat pH 8,8 (C): 28g natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O) hòa tan 750ml nước cất Thêm 50ml dung dịch axit clohydric (HCl) 0,1N thêm nước cất đến lít; - Hỗn hợp đồng phốt phát: Trộn lẫn thể tích dung dịch (A) thể tích dung dịch (B) thể tích dung dịch (C) Cho dung dịch (A) trộn với dung dịch (B), lắc đều cho thêm dung dịch (C); - Thimolphtalein, dung dịch 0,25% etanol (C2H5OH) 50%; Phụ lục - Natri thiosunfat, dung dịch 0,1M : 24,8g Na2S2O3.5H2O hịa tan bằng nước cất bình định mức dung tích 1000ml, lắc đều, thêm nước cất đến vạch mức Đựng lọ nâu, trước dùng, pha loãng 10 lần để có dung dịch 0,01M; - Natri hydroxyt (NaOH), dung dịch 0,1N; - Axit axetic (CH3COOH) đậm đặc; - Kali iodua (KI) tinh thể; - Tinh bột, dung dịch 1% NaCl bão hòa 1.4.3 Cách tiến hành Dùng pipet lấy chính xác 5ml nước mắm đã pha loãng 20 lần vào bình định mức dung tích 25ml, thêm giọt thimolphtalein 0,25% nhỏ giọt dung dịch natri hydroxyt 0,1N vào dung dịch có màu xanh nhạt da nhạt da trời (pH 10) Sau đó cho thêm 10 – 15 ml hỗn hợp đồng phốt phát, thêm nước cất đến vạch mức Lắc đều, li tâm lọc qua giấy lọc cứng dày cho nhận dịch suốt Lấy 10ml dịch lọc cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm giọt axit axetic đậm đặc khoảng 0,2 – 0,5g kaliiodua tinh thể, lắc đều, dung dịch có màu vàng của iot Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosunfat 0,01M dung dịch có màu vàng nhạt Thêm - giọt dung dịch tinh bột 1%, dung dịch có màu xanh Chuẩn độ tiếp dung dịch vừa mất màu Ghi lượng dung dịch natri thiosun-fat 0,01M dùng để chuẩn độ Tiến hành xác định mẫu trắng với tất cả lượng hóa chất bước thí nghiệm trên, thay dịch mẫu thử bằng nước cất 1.4.4 Kết Hàm lượng nitơ axit amin (X11) tính bằng g/l, theo công thức: X11 = (V1 − V2 )  0,00028  25  20  1000 = 2,8  (V1 − V2 )  10 Trong đó: V1 – Thể tích dung dịch Na2S2O3 0,01M tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính bằng ml; V2 – Thể tích dung dịch Na2S2O3 0,01M tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính bằng ml; – Thể tích mẫu thử đã pha loãng 20 lần, tính bằng ml 25 - Thể tích toàn hỗn hợp dịch trước lọc, tính bằng ml; 10 – Thể tích dung dịch lọc lấy xác định, tính bằng ml; 0,00028 – Số g nitơ axit amin tương ứng với 1ml dung dịch Na2S2O3 0,01M; 1000 – Hệ số tính g/l; Chú thích: Để nhận kết quả chính xác, cần loại bỏ hoàn toàn đồng phốtphat thừa, bằng cách lọc thật cẩn thận hỗn hợp dịch mẫu thử cho nhận dịch suốt 1.5 Xác định hàm lượng nitơ amin theo phương pháp chuẩn độ foocmon TCVN 3707 - 1990 1.5.1 Nguyên tắc Phụ lục Cho foocmon tác dụng với nhóm amin (của axit amin, peptit…) với muối amon có mẫu thử Chuẩn độ nhóm COOH giải phóng phản ứng bằng dung dịch natri hydroxyt 0,1N dung dịch đạt pH=9,2 Dựa vào lượng kiềm tiêu tốn chuẩn độ để tính hàm lượng nitơ amin-amoniac 1.5.2 Hóa chất cần phân tích - Bình định mức, dung tích 100, 250, 1000ml; - Bình nón, nút mài, dung tích 100, 250ml; - Cốc thủy tinh, dung tích 100, 250ml; - Buret 25ml; - Pipet 1, 10, 25ml; - Phễu thủy tinh; - Cân phân tích, độ chính xác 0,001g; - Đũa thủy tinh; - Giấy lọc; - Axit clohydric (HCl), dung dịch 0,1N; - Natri hydroxyt (NaOH), dung dịch 0,1N; - Bromothimol xanh, dung dịch 0,05% etanol 60%; - Phenolphtalein, dung dịch 0,5% etanol 60%; - Thimolphtalein, dung dịch 1% etanol 60%; - Foocmon tinh khiết, dung dịch trung tính 30%, chuẩn bị sau: 50 thể tích dung dịch foocmon 30% hòa tan với thể tích dung dịch thimolphtalein 1%, thêm dung dịch natri hydroxyt 0,1N dung dịch vừa có màu xanh nhạt - Chỉ thị hỗn hợp: Trộn lẫn thể tích dung dịch bromo-thimol xanh 0,05% với thể tích dung dịch phenolphtalein 0,5% - Natri hydrophotphat, dung dịch M/15(A): cân chính xác 2,59g Na2HPO4.12H2O (hoặc 1,1876g Na2HPO4.2H2O) hịa tan bình định mức dung tích 100ml, thêm nước cất đến vạch mức - Kali dihydrophophat, dung dịch M/15(B): cân chính xác 0,707 KH2PO4, hòa tan bình định mức dung tích 100ml, thêm nước cất đến vạch mức; - Dung dịch đệm pH 7,0: Hòa lẫn 61,2ml dung dịch (A) 38,8ml dung dịch (B); - Dung dịch màu tiêu chuẩn pH 7,0: Cho vào bình nón dung tích 100ml : 20 ml dung dịch đệm pH = 7,0 0,1ml dung dịch chỉ thị hỗn hợp, dung dịch có màu xanh mạ; - Dung dịch đệm pH 9,2: Cân chính xác 1,9018g natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O) hịa tan bình định mức dung tích 100ml, thêm nước cất đến vạch mức; - Dung dịch màu tiêu chuẩn pH 9,2: Cho vào bình nón dung tích 100ml : 20ml dung dịch đệm pH 9,2; 1ml dung dịch chỉ thị hỗn hợp Dung dịch có màu tím 1.5.3 Cách tiến hành Phụ lục Cân chính xác 10 – 15g mẫu thử cho vào cốc thủy tinh dung tích 100ml Dùng nước cất hòa tan mẫu chủn tồn (cả nước tráng cốc) vào bình định mức dung tích 250ml, thêm nước cất đến khoảng 200ml Sau đó, lắc phút, để yên phút, lặp lại lần Thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều lọc Dùng pipet lấy chính xác 20ml dịch lọc vào bình nóng dung tích 250ml, thêm 1ml dung dịch chỉ thị hỗn hợp, trung hòa dịch lọc dung dịch có màu giống dung dịch màu tiêu chuẩn pH 7,0 Sau đó dùng buret cho thêm 20ml dung dịch foocmon trung tính 30% vào đậy nút bình lại, lắc đều, để yên phút Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyt 0,1N dung dịch có màu giống dung dịch màu tiêu chuẩn pH 9,2 Tiến hành xác định mẫu trắng với tất cả lượng hóa chất bước thử nghiệm trên, thay dịch mẫu thử bằng 20ml nước cất 1.5.4 Kết Hàm lượng nitơ-amoniac (X10) tính bằng phần trăm theo công thức: X10 = (V1 − V2 )  0,0014  20  1000 = 1,4(V1 − V2 ) 20 Trong đó: V1 – Thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính bằng ml; V2 – Thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính bằng ml; m – Khối lượng mẫu thử, tính bằng g; 0,0014 – Số g nitơ tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0,1N; 250 - Thể tích toàn dịch lọc, tính bằng ml; 20 – Thể tích dịch lọc để xác định, tính bằng ml; 100 – Hệ số tính phần trăm Chú thích: Đối với nước mắm, mẫu thử pha loãng 20 lần, lấy 20ml dịch pha loãng để xác định Hàm lượng nitơ amin-amoniac (X10) tính bằng g/l theo công thức: X10 = (V1 − V2 )  0,0014  20  1000 = 1,4(V1 − V2 ) 20 Trong đó: 20 – Độ pha loãng của nước mắm; 20 – Thể tích dịch pha loãng để xác định, tính bằng ml; 1000 – Hệ số tính g/l; Phụ lục 10 PHỤ LỤC Số liệu kết phân tích Bảng Kết đo OD660 để xác định hoạt độ enzyme Mẫu Số lần đo Lần Lần Lần Trung bình Siêu âm, trích ly 24h (U/ml) 0,032 0,032 0,033 0,032±0,001 Chỉ trích ly 24h (U/ml) 0,024 0,023 0,024 0,0024±0,001 Bảng Khảo sát ảnh hưởng nồng độ CP enzyme đến trình thủy phân Chỉ tiêu Tỉ lệ enzyme 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45% Hàm lượng nitơ amin (%) 0,49 0,56 0,49 0,48 0,52 0,65 0,69 0,43 0,43 0,40 pH 6,3 6,23 6,19 6,16 6,15 6,13 6,12 6,04 6,01 6,01 Mức độ thủy phân (%) 2,50 4,53 2,55 2,24 3,43 6,97 7,96 0,94 1,04 0,31 Bảng Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn nước: nguyên liệu đến trình thủy phân Chỉ tiêu Nước:nl 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 Phụ lục Hàm lượng nitơ amin (%) 0,59 0,61 0,62 0,67 0,57 0,59 pH 5,95 5,97 5,98 5,97 6,01 6,02 Mức độ thủy phân (%) 5,25 5,80 6,19 7,52 4,71 5,25 11 Bảng Khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân đến trình thủy phân Chỉ tiêu Thời gian 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h Hàm lượng nitơ amin (%) 0,40 0,50 0,43 0,46 0,53 0,67 0,50 pH 6,26 6,18 6,15 6,10 6,07 6,00 6,02 Mức độ thủy phân (%) 0,26 2,81 0,88 1,77 3,80 7,49 2,91 Bảng Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân Chỉ tiêu Nhiệt độ 45°C 50°C 50°C 55°C Phụ lục Hàm lượng nitơ amin (%) 0,62 0,68 0,55 0,56 pH 6,22 6,03 6,07 6,27 Mức độ thủy phân (%) 6,14 7,60 4,27 4,47 12 PHỤ LỤC Các hình ảnh nghiên cứu OD 660nm Hình Sơ đồ trình tách chiết CP enzyme bromelain thô 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 y = 1.3525x - 0.012 R² = 0.9982 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 [Tyrosine] mM Hình Đường chuẩn Tyrosine Phụ lục 13 Hình Xác định hoạt độ đo mật độ quang Hình Dịch sau thủy phân Phụ lục Hình Dịch cá sau ly tâm 14 ... Trang Tên đề tài: Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme bromelain thô 1.2 Tổng quan cá ngừ thịt đỏ cá ngừ 1.2.1 Giới thiệu cá ngừ Cá ngừ tên gọi chung chỉ họ cá có tên khoa học... Đông Trang Tên đề tài: Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme bromelain thô Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu - Nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ lấy mẫu từ Công ty... Hình 1.6: Thịt đỏ cá ngừ SVTH: Lê Trần Tường Vy GVHD: TS Bùi Xuân Đông Trang 10 Tên đề tài: Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ enzyme bromelain thô Tuy nhiên, phần thịt đỏ loại chiếm