2.3.1 Phương pháp nghiên c ứu:
a. Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học của phế liệu tôm theo phương pháp cổ điển.
- Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Biuret theo phương pháp cổ điển.
- Bố trí thí nghiệm xác định chế độ tối ưu cho quá trình thủy phân protein của phế liệu tôm bằng enzym e theo phương pháp quy ho ạch thực nghiệm.
b. Phương pháp phân tích các ch ỉ tiêu
- Xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng: + Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Folch.
+ Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Biuret.
Nguyên lý: Trong môi trường kiềm, liên kết peptid trong phân tử protein kết hợp với Cu++ thành một phức chất màu tím (phản ứng biuret). Tất cả các chất có chứa từ 2 liên kết trở lên đều cho phản ứng này (trừ axit amin và dipeptid). Màu sắc của phức chất tỷ lệ với số li ên kết peptid (-CO-NH) của protein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin.
Hình 2.1. Công thức của phức Biuret.
Hình 2.2 Sự bắt màu của phản ứng Biuret. Phương pháp xử lí mẫu:
Cách 1: Ngâm 3 - 5gam nguyên liệu khô hoặc 3 - 10 gam nguyên liệu ướt trong NaOH 4% với tỷ lệ 1:10 tới 1:15w/v. Sau đó đem ủ ở 95oC trong 6 giờ.
Cách 2: Xử lí mẫu giống như trên nhưng không ủ ở 95oC trong 6 giờ mà ủ ở nhiệt độ phòng 12 giờ,sau đó nâng nhiệt lên 95oC trong 1 giờ.
Sau khi ủ: Đối với dịch thủy phân thu được, nếu không đủ 100ml thì thêm nước cất vào cho đủ 100ml. Lấy khoảng 10ml dịch thủy phân đem đi lọc chân không bằng giấy lọc Whatman Filter paper.
Phần dịch lọc được đem đi phân tích hàm lư ợng protein bằng thiết bị đo UV-Vis mini 1240.
+ Xác định hàm ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050C theo TCVN 3700 - 1990.
+ Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung ở 500 - 6000C.
Xác định hàm lượng protein có trong dịch thủy phân protein của phế liệu tôm bằng enzyme theo phương pháp Biuret.
Xác định thành phần axit amin theo ph ương pháp phân tích sắc ký.
Xác định độ thủy phân.
Độ thủy phân (Degree of hydrolysis (DH)) sử dụng công thức đã được điều chỉnh. Theo Hoyle & Meritt (1994) thì độ thủy phân được xác định theo công thức sau:
Hàm lượng N2 có trong dịch 10% TCA % DH =
Hàm lượng N2 tổng trong mẫu ban đầu (1)
2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý để tính toán trên phần mềm Excel. Tất cả các số liệu được lấy từ kết quả trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm song song.
2.4 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
2.4.1Xây dựng đường chuẩn BSA theo ph ương pháp Biuret.
a. Dụng cụ
1. Dụng cụ thủy tinh (ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, bình tam giác, pipette)
2. Micropipette (100 - 1000l) b. Hóa chất Flavourzyme Phế liệu tôm Xác định thành phần hóa học Xây dựng đường
chuẩn cho pp biuret
Thủy phân bằng enzyme Alcalase Dịch thủy phân Xác định độ thủy phân Xác định thành phần axit amin So sánh 2 quy trình thủy phân bằng enzyme
Quy trình thủy phân protein đề xuất
1. NaOH 2. CuSO4.5H20 3. C4H4NaKO6.4H2O
4. BSA (Bovine serum albumin) c. Tiến hành
1. Pha thuốc thử biuret
Hòa tan 2,34375g CuSO4.5H20 và 8,0571g C4H4NaKO6.4H2O
trong 500ml nước cất, khuấy đều và cho thêm 300ml NaOH 10%. Dung dịch trên được khuấy trộn đều rồi làm đầy đến 1000ml bằng nước cất.
2. Pha dung dịch chuẩn BSA.
Hòa tan 1g BSA vào trong 50ml n ước cất rồi khuấy đều đến khi BSA tan hết rồi định mức lên 100ml bằng nước cất (hàm lượng BSA: 10mg/ml).
3. Xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 0 - 5 sau đó cho các dung dịch hóa chất vào các ống nghiệm với thể tích và thứ tự nh ư sau:
Bảng 2.1: Thể tích của các dung dịch hóa chất cho vào các ống nghiệm
Ống nghiệm Dung dịch hóa chất 0 1 2 3 4 5 BSA chuẩn(ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Nước cất(ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Thuốc thử biuret(ml) 4 4 4 4 4 4 Hàm lượng BSA(mg/ml) 0 2 4 6 8 10
Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất ủ các ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút.
Sau khi ủ, dung dịch trong các ống nghiệm trên được đo mật độ quang học ở bước sóng 570nm để đọc giá trị OD570 (sử dụng ống 0 làm mẫu blank).
2.4.2 Quy trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme dự kiến.
`
Hình 2.4 Sơ đồ quy trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme dự kiến.
Phế liệu tôm
Xay nhỏ
Thủy phân bằng enzyme
Vô hoạt enzyme
Lọc Ly tâm Tách dịch thủy phân Xác định độ thủy phân bã Dịch thủy phân Xác định thành phần axit amin Nhiệt độ; Thời gian; Tỉ lệ nước/NL Tỉ lệ E/S; pH;
Mô tả quy trình
Phế liệu đầu tôm được lấy ra rồi xay nhỏ với đường kính từ 0,5 ÷ 0,8 cm. Cân 100g vào bình tam giác 500ml, cho enzyme v ới tỷ lệ thích hợp hòa tan vào với nước 100ml rồi cho vào bình tam giác mẫu rồi lắc đều. Qúa trình thủy phân được thực hiện ở nhiệt độ và thời gian, pH thích hợp. Nhiệt độ hỗn hợp được duy trì ổn định bằng bể ồn nhiệt.
Sau khi kết thúc quá trình thủy phân lấy bình tam giác ra khỏi bể ổn nhiệt rồi cho tricloroaceticacid (TCA) 20% vào để kết thúc quá trình thủy phân ngay lập tức.
Dùng phễu có vải lọc để thu dịch thủy phân và loại bỏ phần bã. Phần dịch một phần đem đi xác định thành phần các axit amin. Và phần còn lại đem đi ly tâm bằng máy ly tâm. Các thông số của máy ly tâm được cài đặt như sau: nhiệt độ phòng 300C, tốc độ quay là 5000 vòng/phút, thời gian ly tâm là 30 phút. Sau khi ly tâm thu đư ợc 2 phần: dịch thủy phân ở trên và cặn thủy phân ở lớp dưới.
Dịch thủy phân được tách ra và được đem đi xác định hàm lượng protein theo phương pháp Biuret r ồi xác định độ thuỷ phân theo công thức(1).
2.4.3. Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng enzymeAlcalase Alcalase
Có nhiều phương pháp tối ưu hóa quá trình thủy phân protein đầu tôm. Ở đây tôi chọn phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhiều yếu tố ( phương pháp mô hình toán học), một trong những phương pháp hiện đại, có hiệu quả cao, đang được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu các q uá trình hóa học và hóa sinh học.
Để xác định bài toán tối ưu hóa thực nghiệm, cần phân tích các yếu tố đầu vào, các thông số của quá trình thủy phân và hàm mục tiêu.
Theo các tài liệu khoa học mà em tham khảo được em đã chọn các thông số để tối ưu cho quá trình thủy phân protein đối với từng loại enzyme như sau:
a. Yếu tố cố định
- pH = 8 (dùng NaOH 1N để điều chỉnh pH) - Tỉ lệ nước/ nguyên liệu : 1/1
b. Các yếu tố cần tối ưu
Các thông số cần tối ưu trong quá trình thủy phân protein đầu tôm là:
Tỉ lệ enzyme so với nguyên liệu (%): X1[ 0,1; 0,5]
Nhiệt độ thủy phân (0C) : X2[40 ; 60]
Thời gian thủy phân (giờ) : X3[ 4; 10]
c. Hàm mục tiêu (Y)
Qúa trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme thực chất là quá trình thủy phân cắt protein trong phế liệu tôm thành các peptit dần dần đến các axitamin. Do vậy hàm mục tiêu là mức độ cắt protein (độ thủy phân protein) của phế liệu tôm khi bổ sung enzyme).
Độ thủy phân protein của phế liệu tôm trong dịch thủy phân ph ải đạt tối đa: Y max.
Từ các điều kiện biên của các yếu tố quy hoạch thực nghiệm, ta lập bảng về mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thực nghiệm:
Bảng 2.2 Mức thí nghiệm của các yếu tố
Yếu tố X1
Tỉ lệ enzyme so với cơ chất (E/S) (%)
X2
Nhiệt độ thủy phân (0C)
X3 Thời gian thủy
phân (giờ)
Mức trên 0,5 60 10
Mức dưới 0,1 40 4
Khoảng biến thiên 0,2 10 2
Với 3 yếu tố tối ưu (k = 3) số thí nghiệm phải thực hiện là N = 23 = 8 thí nghiệm (TN). Và số thí nghiệm bổ sung ở tâm phương án là N0 = 3.
Như vậy có tất cả 8 + 3 = 11 thí nghiệm.
Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm ở giá trị biên
Số thí nghiệm
Yếu tố thí nghiệm
Yếu tố thí nghiệm trong hệ tọa độ không thứ nguyên X1 X2 X3 X1 X2 X3 1 0,1 40 4 -1 -1 -1 2 0,5 40 4 1 -1 -1 3 0,1 60 4 -1 1 -1 4 0,5 60 4 1 1 -1 5 0,1 40 10 -1 -1 1 6 0,5 40 10 1 -1 1 7 0,1 60 10 -1 1 1 8 0,5 60 10 1 1 1
Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm ở tâm ph ương án
N0 U1(%) U2(0C) U3 (giờ)
1 0,3 50 7
2 0,3 50 7
3 0,3 50 7
2.4.4 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng enzymeFlavourzyme Flavourzyme
a. Yếu tố cố định
- pH = 6,5 (dùng HCl 1N để điều chỉnh giá trị pH) - Tỉ lệ nước/ nguyên liệu : 1/1
b. Các yếu tố cần tối ưu
Các thông số cần tối ưu trong quá trình thủy phân protein đầu tôm là:
Nhiệt độ thủy phân (0C) : X2 [30 ; 70]
Thời gian thủy phân (giờ) : X3 [ 4; 12]
Từ các điều kiện biên của các yếu tố quy h oạch thực nghiệm, ta lập bảng về mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thực nghiệm:
Bảng 2.5 Mức thí nghiệm của các yếu tố
Yếu tố X1
Tỉ lệ enzyme so với cơ chất (E/S) (%)
X2
Nhiệt độ thủy phân (0C)
X3 Thời gian thủy
phân (giờ)
Mức trên 0,2 70 12
Mức dưới 0,03 30 4
Khoảng biến thiên 0,085 20 4
Mức cơ sở Xi 0,115 50 8
Với 3 yếu tố tối ưu (k = 3) số thí nghiệm phải thực hiện là N = 23 = 8 thí nghiệm (TN). Và số thí nghiệm bổ sung ở tâm ph ương án là N0 = 3.
Như vậy có tất cả 8 + 3 = 11 thí nghiệm.
Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm ở giá trị biên
Số thí nghiệm
Yếu tố thí nghiệm
Yếu tố thí nghiệm trong hệ tọa độ không thứ nguyên X1 X2 X3 X1 X2 X3 1 0,03 30 4 -1 -1 -1 2 0,2 70 4 1 -1 -1 3 0,03 30 4 -1 1 -1 4 0,2 70 4 1 1 -1 5 0,03 30 12 -1 -1 1 6 0,2 70 12 1 -1 1 7 0,03 30 12 -1 1 1 8 0,2 70 12 1 1 1
Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm ở tâm ph ương án
N0 U1(%) U2(0C) U3 (giờ)
1 0,115 50 8
2 0,115 50 8
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN THEO PH ƯƠNG PHÁPBIURET BIURET
Kết quả đường chuẩn như sau:
Bảng 3.1: Mật độ quang học của các mẫu đường chuẩn
Ống nghiệm Hàm lượng BSA(mg/ml) OD570
1 2 0,101
2 4 0,201
3 6 0,305
4 8 0,409
5 10 0,506
Hình 3.1: Đồ thị đường chuẩn BSA
Phương trình đường chuẩn y = 0,0509x – 0,001 trong đó x : hàm lượng (mg/ml) y : OD570 R2 = 0,9999 y = 0.0509x - 0.001 R2 = 0.9999 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 2 4 6 8 10 12 Hàm lượng (m g/m l) 0 D 5 7 0
3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA PHẾ LIỆUĐẦU TÔM. ĐẦU TÔM.
Bảng 3.2 Thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng (tính theo vật chất khô)
Độ ẩm (%) Protein (%) Lipit (%) Tro (%)
78,85 49,01 5,1 25,23
Từ kết quả thí nghiệm trên ta thấy phế liệu đầu tôm tươi có chứa hàm lượng protein cao. Do đó cần nghiên cứu biện pháp thu hồi hàm l ượng protein để sản xuất thành các sản phẩm có giá trị, mở ra thêm nhiều h ướng ứng dụng mới.
3.3 KẾT QUẢ TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PHẾ LIỆUĐẦU TÔM BẰNG ENZYME ALCALASE. ĐẦU TÔM BẰNG ENZYME ALCALASE.
Các bước và kết quả giải bài toán quy hoạch thực nghiệm. a.Lập ma trận thí nghiệm
Chuẩn bị 8 mẫu phế liệu đầu tôm đã được nghiền nhỏ và đồng nhất, bổ sung nước, enzyme theo tỷ lệ xác định và tiến hành thủy phân theo các điều kiện như đã nêu trên ở bảng. Khi kết thúc quá trình thủy phân cho tricloroaceticacid (TCA) 20% vào để kết thúc quá trình thủy phân ngay lập tức. Tiến hành lọc lấy dịch thủy phân rồi đem một phần đi xác định thành phần axit amin và một phần đem đi ly tâm: nhiệt độ phòng 300C, tốc độ quay là 5000 vòng/phút, thời gian ly tâm là 30 phút. Sau khi ly tâm thu được 2 phần: dịch thủy phân ở trên và cặn thủy phân ở lớp d ưới.
Dịch thủy phân được tách ra và được đem đi xác định hàm lượng protein theo phương pháp Biuret và tính độ thuỷ phân theo công thức (1). Kết quả phân tích được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.3 Ma trận quy hoạch thực nghiệm
Số thí nghiệm
Yếu tố thí nghiệm
Yếu tố thí nghiệm trong hệ tọa độ không thứ nguyên
Chỉ tiêu tối ưu (Y) (%) X1 X2 X3 X1 X2 X3 1 0,1 40 4 -1 -1 -1 58,24 2 0,5 40 4 1 -1 -1 61,26 3 0,1 60 4 -1 1 -1 63,58 4 0,5 60 4 1 1 -1 69,24 5 0,1 40 10 -1 -1 1 63,12 6 0,5 40 10 1 -1 1 68,14 7 0,1 60 10 -1 1 1 67,23 8 0,5 60 10 1 1 1 72,12
Đưa thêm vào ma trận trên cột biến ảo X0 = +1 ta có ma trận với biến ảo.
Bảng 3.4 Ma trận quy hoạch thực nghiệm có biến ảo
Số TN X0 X1 X2 X3 Y(%) 1 +1 -1 -1 -1 58,24 2 +1 1 -1 -1 61,26 3 +1 -1 1 -1 63,58 4 +1 1 1 -1 69,24 5 +1 -1 -1 1 63,12 6 +1 1 -1 1 68,14 7 +1 -1 1 1 67,23 8 +1 1 1 1 72,12
Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm ở tâm p hương án.
N0 U1(%) U2 (0C) U3 (giờ) Y(%)
1 0,3 50 7 64,49
2 0,3 50 7 63
Trước hết ta tính các hệ số của ph ương trình hồi quy tuyến tính Y= b0 + b1X1 +b2X2 + b3X3
Sau khi tính hệ số hồi quy và kiểm tra tính có ý nghĩa của chúng theo tiêu chuẩn Student (chi tiết trình bày ở phụ lục), kết quả thể hiện trên bảng 3.6.
Bảng 3.6 Bảng kết quả kiểm tra mức ý nghĩa của các hệ số hồi quy
Hệ số hồi quy (b) Hệ số t So sánh với tp (f) = 4.3
b0 = 65,3663 t0 = 228,6118 Lớn hơn
b1 = 2,3238 t1 = 8,1271 Lớn hơn
b2 = 2,6763 t2 = 9,3599 Lớn hơn
b3 = 2,2863 t3 = 7,9959 Lớn hơn
Từ kết quả bảng 3.6 cho thấy các hệ số b1, b2, b3 có ý nghĩa. Vậy phương trình hồi quy có dạng:
Y1= 65,8763 + 2,3238X1+ 2,6763X2+ 2,2863X3(*)
Phương trình hồi quy (*) tương thích với thực nghiệm theo tiêu c huẩn Fisher (chi tiết phụ lục).
Theo phương trình hồi quy (*) nhận thấy:
Hệ số b1 = 2,3238 > 0: Khi tăng tỷ lệ enzyme Alcalase so với phế liệu tôm thì phản ứng thủy phân cắt đứt liên kết trong phân tử protein xảy ra càng mạnh, tốc độ thủy phân nhanh hơn, độ thủy phân cao hơn. Các phân tử protein bị thủy phân thành các thành phần nh ư polypeptid, peptid, amino acid…hòa tan vào dung d ịch và lượng protein thu hồi cũn g sẽ cao hơn. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết. Tuy nhiên, tỷ lệ enzyme Alcalase so với phế liệu tôm không nên t ăng quá 0,5% vì khi tăng tỷ lệ enzyme lên trên mức 0,5% thì độ thủy phân cũng chênh lệch không nhiều, xét về mặt kinh tế thì hiệu quả không cao.
Hệ số b2 = 2,6763 > 0: Khi tăng nhiệt độ, độ thủy phân cũng tăng so với ban đầu. Điều này phù hợp vì khi nhiệt độ tăng thì hoạt tính enzyme tăng dẫn
đến tốc độ thủy phân phế liệu tôm t ăng. Tuy nhiên, không nên tăng nhi ệt độ lên trên 600C vì nhiệt độ cao trên 600C dễ làm biến tính enzyme dẫn đến hoạt tính protease giảm mạnh.
Hệ số b3 = 2,2863 > 0: Khi kéo dài thời gian thủy phân, mức độ thủy phân phế liệu tôm triệt để hơn, lượng protein thu hồi được cũng sẽ cao hơn. Tuy nhiên thời gian thủy phân không nên kéo dài quá 10 giờ vì khi kéo dài