Nghiên cứu thủy phân phế liệu ruột điệp bằng enzyme protease vi sinh vật

i LỜI CẢM ƠN Đề tài này được hoàn thành là nhờ sự giúp đỡ tận tình của nhiều thầy cô giáo, bạn bè và người thân. Qua đây em xin b ày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến tất cả tập thể và cá nhân đã giúp đỡ em trong thời gian học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành biết ơn các thầy cô giáo trong Nhà trường và đặc biệt là các thầy cô trong khoa Chế biến đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường. Em xin chân thành bày t ỏ lòng biết ơn cô GS.TS Trần Thị Luyến, người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em thực hiện đề tài. Em xin chân thành bi ết ơn các thầy cô quản lý các phòng thí nghiệm: Phòng thí nghiệm hoá sinh, phòng thí nghiệm CNSH của khoa Chế biến, ph òng thí nghiệm Viện Công nghệ sinh học v à Môi trường đã tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình thực tập. Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thành viên trong gia đình, các bạn đồng môn đã động viên và nhiệt tình giúp đỡ em thực hiện đề t ài. Sinh viên Hồ Thị Thu Minh ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v KÍ HIỆU VÀ CHỮ VẾT TẮT vi LỜI MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về enzyme protease 3 1.1.1. Phân loại dựa trên vị trí phân cắt 3 1.1.2. Phân loại dựa vào trung tâm hoạt động của enzyme 4 1.1.3. Phân loại theo pH tối ưu 5 1.1.4. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật 5 1.1.5. Tính ưu việt của protease vi sinh vật 6 1.1.6. Các ứng dụng của protease 8 1.2. QUÁ TRÌNH TH ỦY PHÂN VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG 9 1.2.1. Thuỷ phân hoá học 9 1.2.2. Thuỷ phân bằng enzyme 9 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân 10 1.3. GIỚI THIỆU VỀ ĐIỆP VÀ PHẾ LIỆU CỦA ĐIỆP 12 1.3.1. Sơ lược về điệp 12 1.3.2. Sản lượng và tình hình xuất, nhập khẩu điệp trên thế giới 14 1.3.3. Nguồn lợi điệp ở Bình Thuận 16 1.3.4. Điệp quạt Bình Thuận 17 1.3.5. Phế liêụ ruột Điệp 19 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 22 2.1. Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.1. Điệp và phế liệu ruột điệp 22 2.1.2. Enzyme protease Bacillus subtilis 22 2.2. Phương pháp nghiên c ứu 23 2.2.1. Phương pháp phân tích 23 iii 2.2.2. Phương pháp b ố trí thí nghiệm 24 2.2.2.1. Xác định thành phần khối lượng của điệp quạt 24 2.2.2.2. Xác định thành phần hoá học của ruột điệp 24 2.2.2.3. Xác định chế độ thủy phân thích hợp 25 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1. Thành phần khối lượng và hoá học cơ bản của điệp 30 3.2. Xác định các điều kiện thích hợp cho quá tr ình thủy phân 30 3.2.1. Xác định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá tr ình thủy phân 30 3.2.2. Xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá tr ình thủy phân 36 3.2.3. Xác định pH thích hợp cho quá tr ình thủy phân 42 3.2.4. Xác định tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá tr ình thủy phân 45 3.3. Đề xuất quy trình sản xuất và đánh giá chất lượng sản phẩm 49 3.3.1. Quy trình sản xuất 49 3.3.2. Đánh giá chất lượng sản phẩm 51 3.3.2.1. Hình ảnh sản phẩm 51 3.3.2.2. Khối lượng dầu, bột protein không ho à tan và dịch đạm hoà tan cô đặc thu được sau thủy phân 51 3.3.2.3. Thành phần hoá học của bột protein không ho à tan và dịch đạm hoà tan cô đặc 52 3.3.2.4. Thành phần và hàm lượng acide amin trong dịch đạm hoà tan cô đặc 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 PHỤ LỤC 3 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tỉ lệ các lo ài nhuyễn thể nuôi trên thế giới 13 Bảng 1.2. Sản lượng điệp nuôi trên thế giới 13 Bảng 1.3. Các giá trị các th ành phần sinh học trong bộ phận thân mềm của điệp quạt Chlamys nobilis. 18 Bảng 1.4. Khối lượng (W/g) các cơ quan của điệp 19 Bảng 1.5. Thành phần hóa học của điệp so với các nhuyễn thể hai vỏ v à thủy sản khác 21 Bảng 3.1. Thành phần khối lượng của điệp 30 Bảng 3.2. Thành phần hoá học của ruột điệp 30 Bảng 3.3. Kết quả đánh giá chỉ ti êu cảm quan các mẫu thủy phân ở nhiệt độ thủy phân khác nhau theo thời gian 31 Bảng 3.4. Kết quả đánh giá chỉ ti êu cảm quan các mẫu thủy phân có tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau 37 Bảng 3.5. Kết quả đánh giá chỉ ti êu cảm quan các mẫu thủy phân có pH môi tr ường khác nhau 42 Bảng 3.6. Kết quả đánh giá chỉ ti êu cảm quan các mẫu thủy phân có h àm lượng nước bổ sung khác nhau 45 Bảng 3.7: Khối lượng các chất thu đ ược sau khi thủy phân 51 Bảng 3.8: Thành phần dinh dưỡng cơ bản của các sản phẩm từ quá tr ình thủy phân ruột điệp 52 Bảng 3.9. Thành phần và hàm lượng các acide amin trong dịch đạm cô đặc h òa tan 53 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Điệp quạt 17 Hình 2.1. Điệp và phế liệu ruột điệp 22 Hình 2.2. Xác đình thành phần khối lượng điệp quạt 24 Hình 2.3. Xác định thành phần hoá học của ruột Điệp 25 Hình 2.4. Xác định nhiệt độ và thời gian thủy phân thích hợp 26 Hình 2.5. Xác định nồng độ bổ sung enzyme thích hợp 27 Hình 2.6. Xác định pH thủy phân thích hợp 28 Hình 2.7. Xác định lượng nước bổ sung thích hợp 29 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn hàm lượng N aa ở các mẫu thủy phân ở nhiệt độ thủy phân khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau 33 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn hàm lượng N NH3 ở các mẫu thủy phân ở nhiệt đô thủy phân khác nhau 34 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn hàm lượng N TS ở các mẫu thủy phân ở nhiệt đô thủy phân khác nhau 35 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn hàm lượng N aa ở các mẫu thủy phân có tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau 38 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn hàm lượng N NH3 ở các mẫu thủy phân có tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau 39 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hàm lượng N TS ở các mẫu thủy phân có tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau 41 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn hàm lượng N aa, N TS, N NH3 ở các mẫu thủy phân có pH môi trường thuỷ phân khác nhau trong thời gian thủy phân 6h 44 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn hàm lượng N aa, N TS, N NH3 ở các mẫu thủy phân có tỷ lệ n ước bổ sung khác nhau trong th ời gian thủy phân 6 h 47 Hình 3.9. Quy trình sản xuất đạm từ phế liệu ruột Điệp 50 Hình 3.10. Ảnh sản phẩm dịch đạm ho à tan cô đặc và bột đạm không hoà tan 51 vi KÍ HIỆU VÀ CHỮ VẾT TẮT ĐVTM Động vật thân mềm E Enzyme E/S Enzyme trên cơ chất N NH3 Đạm thối hay đạm amoniac N TS Đạm tổng số hay nitơ tổng số N aa Đạm acide amine W Khối lượng W/g Khối lượng trên gam h Giờ gN/l Gam nitơ trên lít 1 LỜI MỞ ĐẦU Bình Thuận có chiều dài bờ biển 192 km, ngoài khơi có đ ảo Phú Quý cách Phan Thiết 120 km, diện tích vùng lãnh hải 52.000 km 2 là một trong ba ngư trường lớn nhất Việt nam, n ơi hội tụ nhiều yếu tố tự nhi ên, đặc biệt là nơi gặp nhau giữa hai dòng hải lưu nóng và lạnh đóng vai trò quan trọng đối với sự phát triển v à làm giàu nguồn lợi hải sản, nơi thu hút nhiều loại cá, tôm, mực, sò, điệp….với mật độ cao đến cư trú và sinh sản. Tổng trữ lượng cá vùng biển ven bờ của Bình Thuận 220 ÷ 240 nghìn tấn, khả năng khai thác 100 ÷ 120 nghìn tấn/năm, trong đó 60 % cá nổi tập trung ở 3 ngư trường Phan Thiết, H àm Tân và đảo Phú Quý ; sản lượng mực 10.000 ÷ 20.000 tấn; sò, điệp trữ lượng 50.000 tấn, khả năng khai thác h àng năm 25.000 ÷ 30.000 tấn, tập trung ở các b ãi Lai Khế, Hòn Rơm, Cù Lao Câu, Phan Rí Cửa. Trong đó, Điệp là đối tượng có giá trị kinh tế, thịt th ơm ngon chứa nhiều chất dinh dưỡng, dễ tiêu hoá. Hiện nay, chúng là loài đặc sản được tiêu thụ rộng rãi ở thị trường trong nước và xuất khẩu. Các sản phẩm chủ yếu l à điệp tươi sống (cả vỏ), điệp tươi (thịt), đông lạnh (thịt, cấp đông cả vỏ hoặc bỏ vỏ), các sản phẩm kh ác (thịt xông khói, rắc bánh mì, nước sốt với thịt)…Với sản l ượng khai thác hàng năm ở Bình Thuận 20.000 ÷ 30.000 tấn/năm thì lượng ruột điệp, sò thải ra lớn với cách chế biến thô là luộc chín và phơi dưới ánh nắng mặt trời cho chất l ượng và giá trị không cao. Do đó để nâng cao chất lượng và giá trị của phế liệu ruột điệp , ta có thể dùng protease thủy phân sản xuất dịch đạm bổ sung v ào nước mắm nhằm nâng cao độ đạm hay sản xuất bột đạm phối trộn với các nguồn khác l àm thức ăn gia súc. Vì vậy, được sự chấp nhận của Nhà trường em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thủy phân phế liệu ruột điệp bằng enzyme protease vi sinh vật”. Với nội dung nghiên cứu: 2 - Xác định thành phần khối lượng của điệp và thành phần hóa học của ruột điệp. - Xác định chế độ thủy phân (tỷ lệ e nzyme, pH, nhiệt độ, tỷ lệ nước) - Xây dựng quy trình và đánh giá chất lượng sản phẩm 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về enzyme protease Protease là nhóm enzyme th ủy phân các liên kết peptide trong phân tử protein hoặc các polypeptide th ành các peptide có phân t ử lượng nhỏ (pepton và polypeptide). Tiếp theo đó là sự phân hủy các peptide tr ên thành các amino acid t ự do dưới tác dụng của peptidase. Protease là enzyme đư ợc thu nhận từ thực vật (papain, bromelin) từ động vật (pepsin, chymosin, trypsin, chemotrysin ) và vi sinh vật, có tác dụng thủy phân li ên kết peptide của protein th ành các đoạn peptide và acid amin. Phần lớn protease thương mại được sản xuất từ vi sinh vật, với doanh thu 256,4 triệu USD vào năm 1987; trong đó 75 % được sản xuất trong tẩy rửa, khoảng 10 % dùng trong sản xuất phomai, c òn lại sử dụng trong công nghiệp thuộc da v à thực phẩm. Protease vi sinh vật đ ược sử dụng cùng với amylase trong chế biến thức ăn gia súc. Protease được sản xuất bởi một số lớn các chủng vi sinh vật, nh ưng lại có một vài chủng được sử dụng để sản xuất enzyme protease với hiệu suất cao. Enzyme protease t ừ vi sinh vật được phân loại dựa v ào cấu trúc hay đặc tính trung tâm hoạt động gồm: serine protease, metalloprotease, cacboxylprotease. Các sản phẩm protease thương mại được phân loại dựa vào pH tối ưu cho protease hoạt động, gồm protease acid, protease trung tính v à protease kiềm. 1.1.1. Phân loại dựa trên vị trí phân cắt Các enzyme protease đư ợc chia thành 2 nhóm: protease và peptidase + Protease phân hu ỷ phân tử protein th ành polypeptide, pepton. Chúng có tính đặc hiệu tương đối rộng, là những enzyme hoạt động không đ òi hỏi phải có nhóm carboxyl hay nhóm amin t ận cùng ở gần kề liên kết peptide. Chúng tác dụng 4 vào những liên kết peptide ở bên trong phân tử protein. Vì vậy những enzyme này còn gọi là endo-peptidase (peptidase phân c ắt nội mạch). + Pepidase phân hu ỷ các phân tử peptide có phân tử nhỏ (pepton, polypeptid) thành các acid amin t ự do. Những enzyme mà đòi hỏi phải có nhóm -COOH và - NH 2 tự do tận cùng ở gần kề liên kết peptide. Peptidase có tính đ ặc hiệu tương đối hẹp, chủ yếu phân hủy các li ên kết ở hai đầu của phân tử protein n ên gọi là exo-peptidase (hay peptidase phân c ắt đầu mạch). Nếu phân cắt ở đầu có gốc amin tự do th ì được gọi là enzyme amino-peptidase. Nếu phân cắt ở đầu có gốc carboxyl tự do th ì được gọi là enzyme carboxyl -peptidase. Cả hai enzyme endo -peptidase và exo-peptidase kết hợp với nhau một cách có hiệu quả trong việc phân huỷ phân tử protein, có thể nói rằng chức năng chính của endo-peptidase là tạo một lượng lớn những đầu tận cùng có nhóm carboxyl t ự do và nhóm amin tự do để tạo đủ cho các exo -peptidase hoạt động. 1.1.2. Phân loại dựa vào trung tâm hoạt động của enzyme Herhey (1960) đ ã phân loại các protease vi sinh vật th ành bốn nhóm: protease-serine, protease-tiol, protease-acid, protease-kim loại. Trong bốn nhóm kể trên, các protease-serine và protease-tiol có khả năng phân giải các liên kết ester và các liên kết amid của các dẫn xuất acid của các acid amin vì các protease này th ể hiện tính đặc hiệu đối với các gốc acid amin chứa nhóm –CO của liên kết. Ngược lại protease-kim loại và protease-acid thường không có hoạt tính esterase và aminase đối với các dẫn xuất của acid amin. Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngo ài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Ví dụ: histidine th ường tham gia trong các protease -serine, protease-tiol, và tyrosin trong trung tâm ho ạt động của các protease -kim loại. [...]... khác Protease thương mại thu nhận từ vi sinh vật ước tính chiếm 40 % doanh thu trong các sản phẩm enzyme trên thế giới Phần lớn protease vi khuẩn đ ược sản xuất từ giống Bacillus Thu nhận nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều điểm ưu vi c hơn so với thu nhận nguồn enzyme từ động vật v à thực vật bởi những lí do sau: + Hoạt tính enzyme vi sinh vật cao + Vi sinh vật sinh sản, phát triển và tổng hợp enzyme. .. bổ sung enzyme thủy phân thích hợp nh ư sau: Ruột điệp xay nhỏ Thủy phân bằng enzyme ở điều kiện nhiệt độ và thời gian đã chọn với tỷ lệ E/S khác nhau 0% 0,1 % 0,2 % 0,3 % 0,4 % Phân tích cảm quan và hoá học Chọn tỉ lệ enzyme thích hợp Hình 2.5 Xác định nồng độ bổ sung enzyme thích hợp 3 Xác định pH thủy phân thích hợp Tiến hành thủy phân ruột điệp bằng enzyme protease ở nhiệt độ và tỷ lệ enzyme bổ... Tôm Với hàm lượng đạm tương đối cao thì vi c nghiên cứu sử dụng lượng phế liệu này sao cho tương xứng với giá trị của nó là một điều đáng được quan tâm Hơn nữa, thành phần chiếm tỉ lệ cao trong t òan bộ nguyên liệu đó là phần vỏ chứa hàm lượng canxi tương đối cao… 22 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Điệp và phế liệu ruột điệp Tên tiếng Anh: Noble Scallop Tên khoa... nghiệm 2.6 xác định pH thủy phân thích hợp như sau: Ruột điệp xay nhỏ Thủy phân bằng enzyme ở điều kiện nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ enzyme thích hợp đã chọn với pH khác nhau 5,5 6,0 pH tự nhiên 7,0 Phân tích cảm quan và hoá học Chọn tỉ lệ pH thích hợp Hình 2.6 Xác định pH thủy phân thích hợp 7,5 29 4 Xác định lượng nước bổ sung thích hợp Tiến hành thủy phân ruột điệp bằng enzyme protease ở nhiệt độ, tỷ... Thuỷ phân bằng enzyme Thủy phân bằng enzyme có nhiều thuận lợi do đ ược kiểm soát dễ dàng hơn thủy phân hoá học, cho phép giữ giá trị dinh d ưỡng của nguyên liệu và không cần thiết xử lí hoá học để loại bỏ rác nhân thủy phân sau khi xử lí (enzyme dễ d àng bị vô hoạt ở nhiệt độ cao) 10 * Quá trình thuỷ phân bằng enzyme là quá trình biến đổi protein để tạo ra các acid amin dưới tác động của enzyme protease. .. học của ruột Điệp Cách tiến hành: ruột điệp thu được từ quá trình tách vỏ, tách cồi trên đem đi rửa và sau đó xay nhỏ Cân lấy mẫu để đem đi phân tích các chỉ ti êu protein, lipid, nước, khoáng 2.2.2.3 Xác định chế độ thủy phân thích hợp 1 Xác định nhiệt độ và thời gian thủy phân thích hợp Tiến hành thủy phân ruột điệp bằng enzyme protease với 4 mẫu, mỗi mẫu 50 g với tỷ lệ nước bổ sung là 20 %, enzyme. .. à protease bổ sung từ bên ngoài Protein > polypeptid > peptid -> acid amin Có 2 loại thủy phân chính theo nguồn gốc thủy phân protein: quá tr ình tự thủy phân và quá trình thủy phân + Qúa trình tự thủy phân được thực hiện bởi hoạt động của enzyme thủy phân protein nội sinh, có trong hệ thống ti êu hoá (trypsine, chymotrypsine et pepsine) cũng như trong mô cơ (cathepsine) Qúa tr ình tự thủy. .. càng tăng 1.2 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG Có hai phương pháp thủy phân: hoặc là thủy phân hoá học hoặc là thủy phân bằng enzyme, mỗi phương pháp sẽ cho chất lượng sản phẩm khác nhau 1.2.1 Thuỷ phân hoá học Là phương pháp được áp dụng từ lâu Quá tr ình thủy phân có thể thực hiện trong môi trường acid (H 2SO4 hoặc HCl), hoặc môi trường bazơ (NaOH) Điều kiện thủy phân khá mạnh mẽ: nhiệt... Dice (1974), t ốc độ phân giải protein trong tế b ào tăng lên khi vi sinh vật bị “đói” C, N sự phân giải protein cũn g tăng lên nhanh chóng trong quá tr ình sinh trưởng + Các protease nội bào có thể tham gia quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme Điều này có ý nghĩa đối với vi c hình thành và nảy mầm các bào tử vi sinh vật + Các protease nội bào cũng có thể tham gia vào vi c hoàn thiện chuỗi... đối với hoạt động sống của vi sinh vật 6 Các protease ngoại bào phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ d àng hấp thu Một số dữ liệu cho thấy các đột biến vi sinh vật mất khả năng tiết protease ngoại bào nên không thể sử dụng protein làm nguồn đạm dinh dưỡng Mặt khác quá trình tiết protease ngoại bào cũng như quá . đề tài: Nghiên cứu thủy phân phế liệu ruột điệp bằng enzyme protease vi sinh vật . Với nội dung nghiên cứu: 2 - Xác định thành phần khối lượng của điệp và thành phần hóa học của ruột điệp. -. nhận nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều điểm ưu vi c hơn so với thu nhận nguồn enzyme từ động vật v à thực vật bởi những lí do sau: + Hoạt tính enzyme vi sinh vật cao. + Vi sinh vật sinh sản,. năng sinh học của protease vi sinh vật 5 1.1.5. Tính ưu vi t của protease vi sinh vật 6 1.1.6. Các ứng dụng của protease 8 1.2. QUÁ TRÌNH TH ỦY PHÂN VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG 9 1.2.1. Thuỷ phân