NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN DẦU HẠT BỤP GIẤM BẰNG ENZYME LIPASE

LUẬN VĂN THẠC SỸ ĐƯỢC THỰC HIỆN TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dầu:đệm đến quá trình thủy phân của enzyme lipase Khảo sát ảnh hưởng của đơn vị hoạt độ lipase:gam cơ chất đến quá trình thủy phân của enzyme lipase Khảo sát ảnh hưởng pH đến quá trình thủy phân enzyme lipase Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân của enzyme lipase Khảo sát thời gian thủy phân dầu hạt Bụp Giấm của enzyme lipase Thủy phân dầu hạt Bụp Giấm với những điệu kiện tối ưu đã chọn Tách phân đoạn sản phẩm thủy phân Xác định khả năng kháng oxi hóa của sản phẩm thủy phân

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG……… ……… X DANH MỤC HÌNH……… ………XI

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 BỤP GIẤM 4

1.1.1 Giới thiệu chung về cây Bụp Giấm 4

1.1.2 Hạt và thành phần của hạt Bụp Giấm 5

1.1.3 Các phương pháp tách dầu hạt Bụp Giấm 8

1.2 Enzyme lipase 10

1.2.1 Định nghĩa 10

1.2.2 Nguồn thu nhận 10

1.2.3 Cấu trúc hóa học của enzyme lipase 12

1.2.4 Tính chất của enzyme lipase 12

1.2.5 Cơ chế hoạt động của enzyme lipase 13

1.2.6 Ứng dụng của enzyme lipase 14

1.3 Enzyme porcine pancreas lipase 15

1.3.1 Định nghĩa 15

1.3.2 Cấu trúc của porcine pancreas lipase 15

1.3.3 Ứng dụng của enzym porcine pancreas lipase 23

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 27

2.1.1 Hạt Bụp Giấm 27

2.1.2 Chế phẩm enzyme Porcine Pancreas lipase (PPL) 27

2.1.3 Hóa chất khác 27

2.1.4 Hexane (www.binhtri.com) 28

2.2 Dụng cụ và thiết bị 29

2.2.1 Dụng cụ 29

2.2.2 Thiết bị 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Xác định giá trị vận tốc ban đầu của enzyme PPL 29

2.3.2 Xác định mức độ thủy phân của enzyme porcine pancreas lipase 30

2.3.3 Xác định acid béo bằng phương pháp sắc ký khí (GC/FID)(Phạm Hùng Việt, 2003) 31

2.4 Bố trí thí nghiệm 33

2.4.1 Khảo sát tính chất của enzyme porcine pancreas lipase 33

2.4.2 Trích ly dầu hạt Bụp Giấm: 34

2.4.3 Khảo sát điều kiện thủy phân tối ưu dầu hạt Bụp Giấm bằng enzyme porcine pancreas lipase 35

2.4.4 Khảo sát tính chất sản phẩm thủy phân 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 Kết quả phân tích chỉ tiêu trong hạt Bụp Giấm 41

3.2 Kết quả khảo sát tính chất của enzyme porcine pancreas lipase 42

3.3 Khảo sát tìm điều kiện thủy phân dầu hạt Bụp Giấm bằng enzyme PPL 42

3.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu:đệm 42

3.3.2 Ảnh hưởng của đơn vị hoạt độ enzyme/gam cơ chất 43

3.3.3 Ảnh hưởng của pH 44

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 46

3.3.5 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân của enzyme porcine pancreas lipase 47

3.4 Khảo sát tính chất của sản phẩm thủy phân 48

3.4.1 Kết quả tách phân đoạn 48

3.4.2 Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa của dầu hạt Bụp Giấm 49

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Kiến nghị 51

LỜI MỞ ĐẦU



Cây Bụp Giấm (Hibiscus sabdariffa L) là một loại cây dễ trồng, có thể chịu hạn

Theo báo Nông nghiệp Việt Nam thì từ đầu thập niên 90 đến nay, Bụp Giấm (giống lấy từ Đức) được Công ty Dược liệu Trung ương II trồng nhiều ở Bà Rịa, Đồng Nai, Sông Bé, Bình Thuận (với diện tích khoảng 400ha để xuất khẩu) Năng suất đài khô khoảng 400 – 800kg/ha và năng suất hạt 500 – 600kg/ha 1ha cây Bụp Giấm thu được tối đa 600kg hạt, như vậy với diện tích 400ha thì thu được 240.000kg Đối với các tỉnh Nam Trung bộ thì được canh tác 2 vụ/năm, nên hạt Bụp Giấm thụ được là 480.000kg (gần 500 tấn) Ngoài ra, số liệu từ trạm Khuyến Nông Cư Jut, tỉnh Đắc Nông cho thấy Công ty Gấc Tây Nguyên trồng cây Bụp Giấm tại huyện Cư Jut, diện tích trồng năm 2014 là 4.5ha Năng suất đạt từ 30 – 40 tấn quả tươi/ha, năng suất hạt là 5 đến 6 tấn/ha (ẩm độ khoảng 10%) Bộ phận có giá trị kinh tế cao của cây là đài hoa Đài hoa được xuất khẩu như dược liệu thô Phần hạt (gần 510 tấn) thường bị thải bỏ như một loại rác thải Trong khi đó hạt Bụp Giấm là một nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng và năng lượng, khoảng 18.8 – 22.3% protein, 39.5 – 42.6% chất xơ, 19.1 – 22.8% chất béo, đặc biệt hàm lượng acid béo không bão hòa chiếm đến 70%, trong đó acid linoleic chiếm tỷ lệ 44% Ngoài ra, hạt còn chứa khoảng 7% chất khoáng gồm Mg, Ca, K, Zn,… (Gummadi S.N và cs, 2009) Việc thải bỏ hạt Bụp Giấm với số lượng lớn hàng năm như thế đã gây lãng phí nguồn dinh dưỡng và làm cho môi trường ngày càng bị ô nhiễm trầm trọng Chính vì vậy,

để tận dụng nguồn dinh dưỡng quý của hạt Bụp Giấm và giúp người dân hiểu được

lợi ích quan trọng của loại hạt này chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thủy phân dầu hạt Bụp Giấm bằng enzyme lipase để thu nhận sản phẩm có hoạt tính kháng oxi hóa”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 BỤP GIẤM

1.1.1 Giới thiệu chung về cây Bụp Giấm

Cây Bụp Giấm có tên khoa học là Hibiscus sabdariffa L, còn gọi là cây Giấm

hay Bụp Giấm, thuộc họ bông Malvaceae, cùng họ với cây bông bụp Tên tiếng anh phổ biến của loại cây này là Roselle, ngoài ra một số tên địa phương khác cũng được sử dụng như: Karkade, Mesta, Sorrel,… Bụp Giấm là một loại cây đa dụng, được xem là nguồn nguyên liệu sử dụng trong thực phẩm, thức ăn gia súc cũng như trong dược phẩm Cây Bụp Giấm là loại cây thân thảo hóa gỗ họ Cẩm quỳ Cây là một loại thảo dược ưa chuộng tại Việt Nam và nhiều nước trên thế giới Cây sống một năm, cao 1.5 - 2m, phân nhánh gần gốc, màu tím nhạt Lá hình trứng, mép có răng Hoa đơn độc, mọc ở nách, gần như không có cuống Tràng hoa màu vàng hồng hay tía, có khi trắng Quả nang hình trứng, có lông thô, mang đài mầu đỏ sáng tồn tại bao quanh quả Cây ra hoa từ tháng 9 đến tháng 10

Cây Bụp Giấm được trồng khá rộng rãi ở nước ta và được đánh giá như là cây thuốc của Châu Á, hầu như các thành phần của cây được tận dụng khá triệt để

Lá ngoài của quả (hay còn gọi là đài hoa) có màu đỏ rực rỡ và hương vị độc đáo đã trở thành một sản phẩm thực phẩm có giá trị (Tsai và Ou, 1996) Chúng được sử dụng trong sản xuất thạch, mứt, nước trái cây, rượu, xi-rô, gelatin, bánh pudding và hương liệu (Ageless và cs, 1999) Trên thế giới, các sản phẩm sản xuất từ nguyên liệu Bụp Giấm đã được biết đến và thương mại hóa rộng rãi Ngoài giá trị dinh dưỡng, Bụp Giấm là loại thuốc quý trong dân gian, có giá trị dược liệu cao Bụp Giấm có giá trị lợi tiểu, giảm huyết áp, lợi mật, kháng khuẩn, nhuận tràng, làm giảm

mỡ máu, bảo vệ tế bào gan… Trong nghiên cứu, cây Bụp Giấm là một nguồn quan trọng cung cấp vitamin như C; E; khoáng chất và các hợp chất có hoạt tính sinh học như acid hữu cơ, phytosterol và polyphenol Hàm lượng phenolic bao gồm chủ yếu

là anthocyanins, flavonoid, acid protocatechuic, eugenol và sterol (Azza và cs, 2011; Trần Thị Ngọc Yên và cs, 2012) Tuy nhiên hạt Bụp Giấm chứa dầu béo với hàm lượng khá cao vẫn chưa được chú trọng nhiều Nguồn dầu béo này chứa nhiều

hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có tính kháng khuẩn, là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho thực phẩm (Juana Sanchez M và cs, 2008)

Hình 1.1 Cây và hạt Bụp Giấm

1.1.2 Hạt và thành phần của hạt Bụp Giấm

Hạt Bụp Giấm là phế phẩm sau khi thu hoạch đài hoa Nó là một nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng và năng lượng, bao gồm các thành phần protein, chất béo, carbohydrate và chất xơ

Theo nghiên cứu ở Ấn Độ, hạt Bụp Giấm có độ ẩm từ 6 – 8%, có chứa 18 – 22% protein, 19 – 22% chất béo, tổng chất xơ là 39 – 42% và một số thành phần khoáng như: K, Ca, Zn, Cu, Mg … (Rao và cs, 1996) Một nghiên cứu gần đây hơn của Hainida và cs (2008) cho biết thành phần hóa học của hạt như sau: protein 35.5%, lipid 22.1%, carbohydrate 13%, chất xơ 18.3% và khoáng 7.5% Dựa vào kết quả phân tích thành phần hạt Bụp Giấm cho thấy hạt giàu chất dinh dưỡng, đặc biệt là protein, lipid và chất xơ Trong đó, thành phần protein bao gồm các acid amin không thay thế như: lysine, leusine, isoleusine và tryptophan, dầu bao gồm chủ yếu là các acid béo không no và có chứa các chất chống oxi hóa với hàm lượng cao

1.1.2.1 Đặc điểm dầu hạt Bụp Giấm

Acid béo không bão hòa của dầu hạt Bụp Giấm chiếm tỷ lệ cao, hơn 70% trong đó chủ yếu là acid béo linoleic chiếm tới 45.9%, acid oleic chiếm 29.2%

(Amin và cs, 2008) Gần đây, Rashmi Gadwal và cs (2015) cũng cho biết về thành phần acid béo của hạt Bụp Giấm như sau: linoleic acid là 44.72%, oleic acid là 25.15% và stearic acid 4.31%, palmitic acid 18.52% Dầu hạt Bụp Giấm còn có các chất chống oxy tan trong lipid, đặc biệt là -tocopherol Tổng tocopherol trung bình

là 2000mg/kg Trong đó, - tocopherol chiếm 25%, - tocopherol 74.5% và  - tocopherol 0.5% bên cạnh các đặc trưng hóa lý của dầu (H Padmaja và cs, 2014; E Betikul và cs, 2013), tính kháng vi sinh vật (BH Ali và cs, 2005) là cơ sở khoa học

để khai thác dầu hạt Bụp Giấm sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm

1.1.2.2 Thành phần acid béo trong dầu hạt Bụp Giấm

Theo nghiên cứu dầu hạt Bụp Giấm của Fatoumata Tounkara và cs (2011) cho biết hạt Bụp Giấm (đã luộc ở 500C, thời gian 12 giờ) là nguồn nguyên liệu giàu hàm lượng các acid béo, đặc biệt hàm lượng các acid béo không no chiếm tỷ lệ khá cao (74.33%) với các acid béo quan trọng như acid linoleic (35.55%), acid oleic (36.64%), acid palmitic (19.34%), acid stearic (4.86%)

Bảng 1.1 Thành phần các acid béo có trong dầu hạt Bụp Giấm (Fatoumata

Tổng cộng 74.13 74.33

Chất béo có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các loại vitamin tan trong dầu mỡ như: Vitamin A, D, E, K, các acid béo không no có vai trò quan trọng trong sự phát triển bình thường của cơ thể, tăng sức đề kháng và có hoạt tính sinh học cao Acid oleic là thành phần chính của chất myelin bao quanh sợi trục tế bào thần kinh, giúp dẫn truyền tín hiệu thần kinh Acid linoleic (omega - 6) là tiền chất của ARA thành phần quan trọng của màng tế bào (kể cả tế bào não), là tiền chất của nhiều chất kháng viêm giúp tăng cường sức đề kháng Hàm lượng linoleic

là tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá giá trị sinh học của chất béo, có khả năng hỗ trợ giảm thiểu triệu chứng viêm khớp tự miễn, làm giảm tính viêm sưng Omega-6 cũng rất có ích trong việc ngăn ngừa các bệnh tim mạch bằng cách làm giảm cholesterol và triglyceride trong máu Acid linolenic (omega - 3) là tiền chất của DHA, là acid béo quan trọng trong việc phát triển não bộ, mắt và hệ thần kinh (DHA chiếm 1/4 não bộ người lớn) có tác dụng chống các bệnh tim mạch, làm giảm

áp lực lên thành động mạch ở những người bị bệnh huyết áp cao, giảm nhồi máu cơ tim, kìm hãm sự lão hóa não, ngăn ngừa sự suy giảm trí nhớ Các acid béo chưa no kết hợp với các cholesterol tạo thành các ester cơ động, không bền vững và dễ bài tiết ra khỏi cơ thể, giúp ngăn ngừa xơ vữa động mạch và có tác dụng cao trong quá trình điều hòa thành mạch máu, nâng cao tính đàn hồi và hạ thấp khả năng thẩm thấu của thành mạch máu, giúp hạn chế nghẽn động mạch vành tim

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của α-linolenic acid

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của linoleic acid

1.1.3 Các phương pháp tách dầu hạt Bụp Giấm

cũ Dầu phân bố trong các khe vách và trên mặt các hạt bột là chất lỏng, độ nhớt nhỏ ở nhiệt độ cao Khi bột bị ép trong lòng máy, áp lực hình thành giúp dầu từ các khe vách thoát ra (Trần Thanh Trúc, 2005)

Hình 1.4 Sơ đồ chiết tách dầu hạt Bụp Giấm bằng phương pháp ép

Hạt Bụp Giấm

Làm sạch, sấy khô

Nghiền

Chưng sấy bột nghiền

Ép sơ bộ

Dầu thô Bánh dầu

Ép kiệt

Bánh dầu

1.1.3.2 Phương pháp trích ly

Trích ly dầu được thực hiện dựa trên đặc tính hòa tan tốt của dầu thực vật trong các dung môi hữu cơ không phân cực như: hexane; dicloetan… Chủ yếu là hexane Việc chuyển dầu phân bố bên trong cũng như mặt ngoài các cấu trúc vật thể rắn như hạt, bột chưng sấy, khô dầu vào pha lỏng của dung môi là một quá trình truyền khối xảy ra trong lớp chuyển động, dựa vào sự chênh lệch nồng độ dầu trong nguyên liệu và dòng chảy bên ngoài (Trần Thanh Trúc, 2005)

1.2 Enzyme lipase

1.2.1 Định nghĩa

Enzyme lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) là enzyme xúc tác thủy phân và tổng hợp các este được hình thành từ triglycerol và các acid béo Chúng có bản chất là protein Đặc tính kỹ thuật của lipase là hoạt động tại liên pha dầu – nước

Lipase được tìm thấy trong động vật, thực vật, nấm và vi khuẩn, có ý nghĩa sinh lý

và tiềm năng trong công nghiệp Chức năng sinh học của lipase là xúc tác quá trình thủy phân của triacylglycerol giải phóng acid béo tự do, diacylglycerols, monoacylglycerols và glycerol Lipase thủy phân chất béo thành acid béo và glycerol tại bề mặt phân pha dầu - nước và đảo chiều các phản ứng trong môi trường không có nước: tổng hợp các este từ glycerol và acid béo chuỗi dài Sản phẩm thu được bằng cách sử dụng lipase tinh khiết hơn so với sử dụng các chất xúc tác hóa học vì sử dụng chất xúc tác hóa học sinh ra nhiều sản phẩm không mong muốn và tạp chất, nhiệt độ, áp suất cao và không tái sử dụng được Như các xúc tác khác, lipase chỉ làm tăng tốc độ phản ứng nhưng không tham gia trực tiếp vào phản ứng Tuy nhiên, do khả năng xúc tác chọn lọc, các enzyme có thể xúc tác phản ứng xảy ra ở một số liên kết nhất định Vì vậy, mỗi loại enzyme khác nhau có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra theo chiều hình thành một số sản phẩm nhất định Điều này khiến cho sản phẩm của các phản ứng có xúc tác enzyme thuần nhất hơn

1.2.2 Nguồn thu nhận

Lipase được phân bố ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật Tuy nhiên, nguồn thu nhận lipase lớn nhất trong công nghiệp là vi sinh vật Lipase phân lập ở các nguồn khác nhau sẽ khác nhau về cấu trúc protein và cơ chế xúc tác, khác nhau về các acid béo đặc trưng, khả năng chịu nhiệt, pH tối ưu

Ở người và động vật có xương sống, lipase kiểm soát sự thủy phân, hấp phụ, tổng hợp chất béo và chuyển hóa lipoprotein Hầu hết lipase trích ly từ cơ thể động vật đều có nhiệt độ tối thích là 370C Ở động vật, lipase được lấy từ tuyến tụy và dạ dày

Lipase động vật ưu tiên xúc tác cho quá trình thủy phân tạo các acid béo mạch dài

có hơn 12 nguyên tử carbon Tốc độ phản ứng giảm đáng kể theo thứ tự tri, di và monoglycerides Một số loại lipase chiết xuất từ dê, cừu và bê Các enzyme này xúc tác cho quá trình thủy phân tạo các acid béo ngắn mạch có tác dụng tạo hương vị cho sản phẩm phomat

Lipase được tìm thấy tại mô dự trữ của các loại hạt có dầu, ngũ cốc trong quá trình nảy mầm Chế phẩm lipase thô được lấy từ mầm của cây cải dầu (Brassica napus),

mù tạt, cây thầu dầu và một số loại đậu Tuy nhiên, lipase thu nhận từ thực vật chưa được đưa vào ứng dụng nhiều vì quá trình tinh sạch khó khăn và hiệu quả kinh tế không cao

Lipase được thu nhận trong quá trình lên men của nấm và vi khuẩn: Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Chromobacterium spp., Candida Rugosa…

- Lipase từ Aspergillus niger và Aspergillus oryzae có khối lượng phân tử từ 25KDa

đến 200KDa và pH tối ưu từ 4.5 đến 6.5 Chúng hoạt động trên dầu dừa, dầu hạt lanh và dầu olive với hiệu suất thủy phân từ 48 - 93% và được sử dụng trong quá trình chín pho mát

- Lipase từ Candida Rugosa: khối lượng phân tử 120KDa, điểm đẳng điện ở pH 4.5

và pH tối ưu 6.5–7.5 (Petersen et al., 2001) Chúng thủy phân dầu olive với hiệu suất 95 – 97%

- Lipase từ Rhizopus: R arrhizus, R javanicus, R niveus, R delemar R arrhizus lipase có khối lượng phân tử 43KDa và điểm đẳng điện ở pH 6.3, hoạt động ở pH

tối ưu 5 – 7 và nhiệt độ tối ưu là 30 – 450C

- Lipase từ Pseudomonas: khối lượng phân tử 29KDa và điểm đẳng điện ở pH 5.8

và pH tối ưu là 6.5 – 8.5 Chúng hoạt động và ổn định ở pH kiềm, được sử dụng trong chất tẩy rửa

Enzyme lipase Porcine Pancreas được tách ra từ tuyến tụy của lợn, đây là

nguồn quan trọng để thu nhận enzyme lipase và lipase cũng là enzyme được phân lập đầu tiên từ nguồn này

1.2.3 Cấu trúc hóa học của enzyme lipase

Cấu trúc không gian của chúng gồm hai vùng xác định:

- Vùng N – terminal là một mắt lưới của xoắn α và các sợi song song β, là đoạn amino acid 1 – 336 Bộ ba xúc tác Ser, Asp và His lần lượt ở tại vị trí amino acid

153, 177 và 264

- Vùng C – terminal hầu hết là các gấp β, chứa amino acid 337 – 349, vùng này tương tác với colipase Colipase là một protein cofactor nhỏ, với khối lượng phân tử khoảng 10kDa

Cấu trúc tinh thể của enzyme lipase có một vài chỗ võng bao phủ bộ ba xúc tác Vị trí của các võng cản trở sự tiếp xúc của cơ chất với bộ ba xúc tác Vùng võng rộng nhất trong số các vùng võng được hình thành là do cầu nối disulfide giữa Cys238 và Cys262 Một võng khác được hình thành bởi phần 76 – 85 (gọi là “nắp”), thuộc vùng

N – terminal, bao phủ trung tâm hoạt động ngăn không cho cơ chất đi vào tâm hoạt động Nắp được mở ổn định bởi các liên kết hydro giữa nắp và colipase Khi nắp này mở, cho phép cơ chất đi vào tiếp xúc với tâm hoạt động

1.2.4 Tính chất của enzyme lipase

Enzyme lipase là một protein hình cầu bao gồm một chuỗi đơn của 449 amino acid, với khối lượng phân tử khoảng 50 – 52kDa Tính chất vật lý của lipase chủ yếu phụ thuộc vào các yếu tố như vị trí của các acid béo trong mạch glycerol, chiều dài chuỗi các acid béo và mức độ bão hòa của acid béo Những tính chất này cũng ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng và cảm quan của một triglyceride nhất định Nhiều lipase hoạt động trong các dung môi hữu cơ, xúc tác cho phản ứng este hóa Hoạt động lipase thường phụ thuộc vào diện tích bề mặt và điều kiện phản ứng nhẹ nhàng Một cuộc khảo sát bởi Linko và Wo trên lipase thương mại cho kết quả

lipase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus có tính chọn lọc cao đối với các acid béo chuỗi ngắn và rượu, đối với C.rugosa lipase là acid propionic, acid butyric, butanol, pentanol và hexanol Đối với M Miehei và R arrhizus, lipase là các acid béo chuỗi

dài và acetate

So với các loại enzyme lipase khác, enzyme lipase có hoạt tính tương đối thấp Hoạt tính của enzyme lipase được xác định thông qua hoạt độ của enzyme, bằng cách xác định lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng

Có rất nhiều định nghĩa về hoạt độ của enzyme, nhưng thông thường hoạt độ của enzyme được định nghĩa như sau: một đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng enzyme chuyển hóa một micromol cơ chất hoặc một micromol sản phẩm tạo thành sau một khoảng thời gian phản ứng tại một nhiệt độ và pH xác định (Kí hiệu: U)

pH của môi trường có ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzyme, vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền protein của enzyme Enzyme lipase thể hiện hoạt tính cao nhất tại môi trường pH kiềm, trong giới hạn 7.3 – 9.0 Với cơ chất là dầu oliu, pH tối ưu cho hoạt động của lipase nằm trong giới hạn là 7.5– 9.0; với ethyl acetate, pH tối ưu là 7.5

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn xác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bền, chưa bị biến tính Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme lipase là 35 – 450C Với cơ chất là triacylglycerol, lipase thể hiện hoạt tính cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng 35 – 450C, pH dao động

từ 6.7 – 7.5

1.2.5 Cơ chế hoạt động của enzyme lipase

Khi một phân tử triacylglycerol đến trung tâm hoạt động (vùng kỵ nước), nó đi vào tiếp xúc với bộ ba xúc tác Ser153, His264 và Asp177 Lúc này, bộ ba xúc tác sẽ thực hiện phản ứng thủy phân Bộ ba được định hướng khi một trong số các nguyên

tử oxy ở phần cuối của Asp177 liên kết với một nguyên tử nitơ trong vòng Histidin bằng liên kết hydro, giúp cho His264 được định vị để nguyên tử nitơ khác của nó tạo liên kết hydro với nhóm hydroxyl của Ser153 Liên kết hydro thứ hai này kéo hydro ra xa từ liên kết cộng hóa trị với oxy của nó một cách tương đối, với định vị này thì enzyme sẵn sàng để hoạt động

Bước đầu tiên của phản ứng xảy ra dựa trên phản ứng thế ái nhân của serin và của cacbon glycerol thứ nhất của chuỗi ở bên cạnh Ser153 Tác nhân ái nhân là nhóm

OH- của serin mang điện tích âm tấn công vào trung tâm tích điện dương của cacbon glycerol thứ nhất, làm cho liên kết giữa cacbon glycerol thứ nhất và oxy của este yếu đi Oxy trong liên kết este trở thành nhóm linh động và nó được thêm một proton H+ vào từ nhóm OH- của Ser153 để trung hòa điện tích âm của nó Khi oxy nhận được H+, sản phẩm acid béo từ vị trí đầu tiên được hình thành và hoàn toàn tự

ly thành H+ và OH- Do sự hình thành cầu nối hydro giữa H+ với OH- của hai phân

tử nước khác nhau, ion hydronium (H3O+) được hình thành Ion hydronium có một momen lưỡng cực rất lớn và hoạt động như một tác nhân ái nhân lên cacbon glycerol đầu tiên Thời điểm này, oxy của Ser153 rời khỏi nhóm Chuỗi bên cạnh tích điện âm của Ser153 nhanh chóng thêm một proton vào bởi ion H+ từ nước Lúc này, sản phẩm diglyceride được hình thành Liên kết hydro giữa nitơ thơm của His264 và nhóm hydroxyl trên Ser153 được phục hồi trở lại và trở về cấu trúc ban đầu của nó, sẵn sàng cho phản ứng khác

1.2.6 Ứng dụng của enzyme lipase

Lipase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: chất tẩy rửa, trong thực phẩm, dược phẩm, da, dệt may, mỹ phẩm và các ngành công nghiệp giấy Lipase được sử dụng để tạo ra các loại hương liệu tổng hợp hoặc tự nhiên từ thực vật để làm nước hoa thông qua phản ứng este hóa

Do khả năng thủy phân chất béo của lipase nên ngày nay lipase được dùng trong bột giặt để thủy phân các vết dầu mỡ trên quần áo, chăn nệm trong điều kiện nhiệt độ thấp và pH cao với những chất hóa học có hoạt tính bề mặt Trong công nghiệp

giấy, sáp và các triglyceride gây trở ngại cho quá trình sản xuất Do vậy, việc loại

bỏ các chất này là rất cần thiết Hiện nay, lipase được coi như một tác nhân sinh thái

để loại bỏ các tạp chất trên

Trong những năm gần đây enzym ngày càng được sử dụng nhiều và rộng rãi trong y học, để sản xuất một số thuốc và dùng trực tiếp để chữa bệnh như: metoprolol, 1-(isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethyl)phenoxy]propan-2-ol được

sử dụng để điều trị cao huyết áp và đau thắt ngực (đau ngực), loạn nhịp tim, đau nửa đầu và các rối loạn khác liên quan đến thần kinh giao cảm

1.3 Enzyme porcine pancreas lipase

1.3.1 Định nghĩa

Các enzyme porcine pancreas lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) được định nghĩa như là các enzyme xúc tác thủy phân các liên kết ester giữa các acid béo mạch dài và glycerol trong dầu béo tại bề mặt phân pha dầu – nước Các enzyme porcine pancreas lipase thủy phân triacylglycerol (TAG) không tan trong nước thành các diacylglycerol, các monoacylglycerol phân cực hơn cũng như các acid béo và glycerol hỗ trợ cho quá trình hấp thu và chuyển hóa qua màng Trừ các trường hợp ngoại lệ, pH hoạt động tối thích cho hầu hết các porcine pancreas lipase nằm trong khoảng 7 – 9, các porcine pancreas lipase hoạt động trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 20 – 650C, nhưng thông dụng nhất là từ 30 –

450C Nhiều chuỗi acid amin của porcine pancreas lipase đã được tìm ra như: lipase

tụy của người, bò (Bos tauru), chuột (Rattus norvegi-cus), chó (Canis familiaris), lợn (Cavia orcellus), thỏ (Oryctolagus cuniculus), ngựa (Equus caballus) (Varger

R, 1984)

1.3.2 Cấu trúc của porcine pancreas lipase

Trong những porcine pancreas lipase đã biết, không có trình tự acid amin đặc trưng nào cho mọi lipase Trái lại, trình tự của chúng rất khác biệt Điểm giống nhau của tất cả các porcine pancreas lipase là một đoạn nhỏ gồm 5 acid amin Gly – X – Ser – X – Gly (trong rất hiếm trường hợp, glycine bị thay thế bằng những acid amin khác) Trình tự này nằm gần trung tâm hoạt động và sau này, các nhà nghiên cứu đã

sử dụng chuỗi pentapeptide này để định danh những protein là lipase Mặc dù có sự khác biệt lớn trong trình tự acid amin, tất cả porcine pancreas lipase đều có một kiểu cấu trúc tương tự nhau gọi là nếp gấp  có liên quan đến cơ chế xúc tác của

nó Cấu trúc này lần đầu tiên được giới thiệu khi so sánh cấu trúc 3 chiều của enzyme có trình tự acid amin khác nhau và so sánh khi chúng gắn với cơ chất Cấu trúc gấp nếp này có phần trung tâm là 8 chuỗi xếp song song cùng chiều, chỉ có chuỗi 2 ngược chiều Các chuỗi 3 đến 8 nối lại với nhau bằng các đoạn xoắn  Sự khác biệt giữa các cấu trúc này là số chuỗi trên nếp gấp  , sự hiện diện của nhóm phụ và cấu trúc của tiểu phần sẽ liên kết với cơ chất

Cấu trúc lập thể của porcine pancreas lipase được làm sáng tỏ vào năm 1990, các nghiên cứu cho thấy vùng hoạt động của enzyme porcine pancreas lipase bị che chắn khỏi dung môi bằng một cấu trúc di động Theo Winkler F.K và cộng sự, cấu trúc di động cần di chuyển trên bề mặt liên pha cơ chất và nước để tạo ra cấu trúc hoạt động của enzyme với trung tâm xúc tác có thể tiếp xúc với cơ chất Cấu trúc tinh thể của porcine pancreas lipase hay cấu trúc dạng phức đã tạo điều kiện cho việc làm sáng tỏ sự thay đổi cấu trúc của lipase Lipase sẽ chuyển từ trạng thái bất hoạt sang trạng thái hoạt động khi cấu trúc di động chuyển từ đóng sang mở Cơ chế đóng mở nắp có thể khác nhau giữa các lipase nhưng chúng đều tạo điều kiện cho trung tâm hoạt động của lipase thông suốt để có thể liên kết với lipid (Varger R, 1984)

1.3.2.1 Cấu trúc di động của porcine pancreas lipase

Lipase sẽ có sự thay đổi hình dạng để ổn định hoạt độ khi tương tác với bề mặt liên pha nước và cơ chất Ở trạng thái đóng, cái nắp sẽ che phủ trung tâm hoạt động của enzyme, làm cho phân tử cơ chất không gắn kết được vào đó Khi chuyển sang dạng mở, trung tâm này trở thành con đường hầm để cơ chất đi vào và tham gia phản ứng Trong những năm gần đây, chức năng của cấu trúc nắp đã được làm sáng tỏ nhiều hơn Nó không chỉ đơn thuần là cái cổng đi vào trung tâm hoạt động Nắp có cấu trúc của một phân tử vừa có tính kỵ nước vừa có tính ái nước: khi đóng nắp, phần mặt ưa nước hướng ra ngoài dung môi và mặt kỵ nước hướng vào lõi

protein; khi enzyme chuyển sang trạng thái mở, mặt kỵ nước sẽ lộ ra ngoài làm tăng diện tích bề mặt kỵ nước, tăng khả năng liên kết với cơ chất Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cấu trúc phần nắp còn ảnh hưởng đến hoạt độ và tính chọn lọc của lipase Ví dụ, cùng trong một nhóm lipase, lipase tụy người và lipase tụy heo, nhưng hai lipase lại cho thấy tính đặc hiệu khác nhau Lipase tụy người chỉ có hoạt

độ cao với triglyceride, trong khi lipase tụy heo còn thể hiện hoạt độ của phospholipase và galactolipase Điểm khác nhau chính trong cấu trúc của 2 enzyme này là kích thước rất nhỏ của nắp trên lipase tụy heo (5 acid amin) Đột biến gen gây ra những biến đổi trên cái nắp đã cho thấy tầm ảnh hưởng của cái nắp đến tính chọn lọc đối với triglyceride, phospholipid và galactolipid Đột biến trên nắp của lipase này sẽ làm thay đổi chiều dài mạch của cơ chất mà nó tương thích (Van Tilbeurgh H, 1992)

1.3.2.2 Phức porcine pancreas lipase

Porcine pancreas lipase có cấu trúc phức với nhóm phụ là protein hay lipid Porcine pancreas lipase chứa 2 phần gắn với nhau bằng một khớp linh động, đầu N của phần protein xúc tác có kích thước lớn và đầu C của nếp gấp  có kích thước nhỏ hơn Nó liên quan đến hoạt độ của lipase trong những điều kiện môi trường sinh lý trong cơ thể Trong ống tiêu hóa, triglyceride được hòa với phospholipid, acid béo, protein và muối mật có tác dụng như chất nhũ hóa Muối mật sẽ ngăn cản

sự hấp thụ của porcine pancreas lipase trên cơ chất lipid nếu không có sự hỗ trợ của một protein được tiết ra cùng với dịch tụy, colipase Colipase là một phân tử protein vừa có tính ưa nước vừa có tính kỵ nước, nó có thể gắn lipase vào bề mặt phân chia pha và ổn định hoạt độ của lipase trên đó Khi liên kết với đầu C của lipase, colipase

sẽ làm lộ phần cấu trúc kỵ nước ở mặt đối diện và giúp enzyme tiếp xúc với bề mặt liên pha Liên kết với colipase không gây ra sự thay đổi về hình dạng của phân tử lipase nhưng một cách gián tiếp, nó tác động đến cái nắp trên lipase, làm nó mở ra

và mở ra phần kỵ nước giúp tăng cường hoạt động trên bề mặt liên pha nước – lipid (Van Tilbeurgh H, 1999)

Hình 1.6 Cấu trúc mô phỏng của enzyme PPL

1.3.2.3 Cơ chế xúc tác của porcine pancreas lipase

a) Trung tâm hoạt động

Trung tâm hoạt động của porcine pancreas lipase gồm 3 gốc acid amin: serine; aspartate hay glutamate và một histidine

Hình 1.7 Mô hình đóng nắp và mở nắp trong enzyme porcine pancreas lipase

Sự hoạt hóa enzyme porcine pancreas lipase thường xảy ra ở bề mặt tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất ở dạng hạt nhũ, do dịch chuyển một hoặc nhiều nắp của enzyme Sự tác động này tương đối khác nhau tùy loại cơ chất

Trong đó, phản ứng 1 mô tả quá trình chuyển từ dạng enzyme hòa tan sang dạng enzyme hoạt hóa kết hợp cơ chất Quá trình này bao gồm các giai đoạn: (1) kết gắn; (2) định hướng; (3) hoạt hóa và cuối cùng (4) gắn cơ chất vào vị trí hoạt hóa Phần còn lại (phản ứng 2) là phản ứng xúc tác giữa enzyme và cơ chất phù hợp, tạo

ra dạng trung gian (Ea*S) Cơ chế xúc tác thủy phân cơ chất gồm hai bước: Độ ái nhân của serine được tăng cường bằng việc chuyển proton đến histidine tạo thành oxyanion tấn công vào carbon của nhóm carbonyl trên liên kết ester Một hình tứ diện được hình thành mang điện tích âm của nguyên tử oxy trong nhóm carbonyl và

nó được giữ ổn định nhờ liên kết hydro với nhóm NH của mạch chính Proton trên histidin sau đó được chuyển đến oxy trên liên kết ester Liên kết ester này sau đó bị cắt đứt và một liên kết cộng hóa trị trung gian mới được hình thành giữa acid béo mới giải phóng với serine Bước 2 của quá trình là việc deacyl hóa enzyme nhờ phân tử nước đến thủy phân liên kết cộng hóa trị trên Trong bước này, proton từ nước sẽ chuyển đến serine trên tạo thành ion hydroxide Ion này sẽ gắn với nguyên

tử carbon của carbonyl trên cơ chất

Acyl hóa Ea*S Ea*Ac + P1 và đề acyl hóa Ea*Ac Ea* + P2

(Ea*: adsorbed and activated enzyme – enzyme hoạt hóa kết bám)

Cơ chế phân tử của phản ứng xúc tác bởi porcine pancreas lipase được mô tả ở hình 1.9

Hình 1.9 Cơ chế thủy phân dầu Bụp Giấm của enzyme porcine pancreas lipase A: Sự kết gắn lipid, hoạt hóa nhóm serine ưa nhân bởi histidine lân cận và O-Ser tấn công ưa nhân vào nguyên tố C-Carbonyl của cơ chất

B: Dạng tetrahydral chuyển tiếp hình thành, với nguyên tử O được ổn định bởi hai nhóm NH-peptid, histidine phóng thích một proton đến phần alcohol của cơ chất C: Dạng trung gian đồng trị (“acyl enzyme”) được hình thành, trong đó thành phần acid của cơ chất được ester hóa với serine của enzyme Phân tử nước thu vào được hoạt hóa nhờ histidine bên cạnh và ion hydroxyl tấn công ưa nhân nguyên tử C của dạng đồng trị đó

D: Histidine giải phóng 1 proton đến nguyên tử O của gốc serine hoạt hóa, liên kết ester giữa serine và acyl bị bẻ gãy giải phóng gốc acyl (Varger R, 1984)

b) Trung tâm liên kết với cơ chất

Trung tâm hoạt động của lipase bị bao phủ bên trong cấu trúc protein Cơ chất đi vào đó thông qua một trung tâm liên kết là một cái túi ở phần đầu của nếp gấp  ở trung tâm phân tử enzyme Mặc dù các lipase có cấu trúc nếp gấp tương tự nhau, trung tâm liên kết với cơ chất lại khác nhau về kích thước, cấu trúc, và tính chất lý hóa, đặc biệt là tính kỵ nước của những phần tử trong túi Độ dài, hình dạng, tính kỵ nước của túi có liên quan đến chiều dài mạch carbon của cơ chất

c) Tính đặc hiệu của porcine pancreas lipase

Khả năng sử dụng porcine pancreas lipase làm xúc tác sinh học đều dựa vào tính chọn lọc và đặc hiệu rất tinh tế của nó Tính đặc hiệu hay tính chọn lọc có thể là chọn lọc vị trí không gian, ví dụ như vị trí nhóm phân tử cơ chất của liên kết ester bị thủy phân hoặc hình thành; cũng có thể là chọn lọc hóa học, ví dụ như khả năng nhận biết cơ chất và chọn lọc đồng phân lập thể Hầu hết porcine pancreas lipase thông dụng có tính đặc hiệu vị trí nhóm hydroxyl 1,3 trong mạch glycerol Ngoài ra cũng có lipase có tính đặc hiệu cho vị trí sn-2 cho phép việc thủy phân hoàn toàn triglyceride thành acid béo và glycerol Về tính chọn lọc đối với acid béo, lipase có thể chuyển ester với acid béo có độ dài mạch bên trung bình đến mạch dài (C4 đến C18, có thể lên đến C22) nhưng với hiệu quả khác nhau Porcine pancreas lipase thể hiện hoạt độ trên các acid béo không no nhiều nối đôi (Adel Sayaria và cs, 2000)

d) Đặc hiệu cơ chất

Dầu và mỡ động thực vật là những cơ chất thích hợp của enzyme lipase Tuy nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau thì hoạt độ của enzyme cũng không giống nhau

Bảng 1.2 Tính đặc hiệu cơ chất của lipase (Abir Ben Bachaa và cs, 2005)

e) Đặc hiệu vị trí hay đặc hiệu vùng (sn - 1,3)

Tính đặc hiệu này có thể được xác định qua quá trình trans-ester hóa triolein (OOO) với palmitic acid (P), xúc tác bởi enzyme lipase Sự tạo thành tripalmitin (PPP) cho thấy enzyme không có tính đặc hiệu vị trí và sự không tạo tripalmitin mà chỉ tạo 1,3-dipalmitin 2-olein chứng tỏ enzyme có tính đặc hiệu vị trí – 1,3

O Lipase không đặc hiệu vị trí P P P

vị trí 1,3 thì sẽ thủy giải hoàn toàn triglyceride tạo ra glycerine Tuy nhiên, enzyme lipase cắt đặc hiệu vị trí 1,3 chỉ xúc tác sự trao đổi các gốc acid béo vị trí 1 và 3 trong phân tử triacylglycerol và như vậy các sản phẩm nhận được sẽ khác với các sản phẩm cắt bằng hóa học Khả năng tạo hỗn hợp triacylglycerol mới do tính đặc hiệu của enzyme lipase nói trên đã được ứng dụng trong thực tế (Varger R, 1984)

f) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme porcine pancreas lipase

Sự thủy phân lipid tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau như pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, diện tích bề mặt tiếp xúc của enzyme với cơ chất

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ lipase

1.3.3 Ứng dụng của enzym porcine pancreas lipase

Lipase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: chất tẩy rửa, trong thực phẩm, dược phẩm, da, dệt may, mỹ phẩm và các ngành công nghiệp giấy Lipase được sử dụng để tạo ra các loại hương liệu tổng hợp hoặc tự nhiên từ thực vật để làm nước hoa thông qua phản ứng este hóa Do khả năng thủy phân chất béo của lipase nên ngày nay lipase được dùng trong bột giặt để thủy phân các vết dầu mỡ trên quần áo, chăn nệm trong điều kiện nhiệt độ thấp và pH cao với những chất hóa học có hoạt tính bề mặt Trong công nghiệp giấy, sáp và các triglyceride gây trở ngại cho quá trình sản xuất Do vậy, việc loại bỏ các chất này là rất cần thiết Hiện nay, lipase được coi như một tác nhân sinh thái để loại bỏ các tạp chất trên

Trong những năm gần đây enzym ngày càng được sử dụng nhiều và rộng rãi trong y học, để sản xuất một số thuốc và dùng trực tiếp để chữa bệnh như: metoprolol, 1-(isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethyl)phenoxy] propan-2-ol được

sử dụng để điều trị cao huyết áp và đau thắt ngực (đau ngực), loạn nhịp tim, đau nửa đầu và các rối loạn khác liên quan đến thần kinh giao cảm (Aechle W và cs, 2004)

1.3.3.1 Ứng dụng lipase trong công nghiệp thực phẩm

Trong công nghiệp chất béo và bơ thực vật, lipase được dùng làm xúc tác trong phản ứng tổng hợp nên các chất béo có giá trị cao từ các chất béo có giá trị thấp hơn như tổng hợp chất thay thế bơ, ca cao từ dầu cọ phân đoạn bằng phản ứng nội chuyển hóa (Zuyi và Ward, 1993) Chúng còn được dùng làm xúc tác cho phản ứng chuyển hóa ester trong các dung môi hữu cơ tạo ra các chất tương đương với bơ

ca cao, chất thay thế chất béo có trong sữa người có tên “Betapol”, sử dụng lipase trong công nghiệp sản xuất ra các acid béo nhiều nối đôi quan trọng và sản xuất dầu diesel sinh học từ dầu thực vật (Mastuao và cs, 1981) Ngoài ra, lipase còn dùng làm xúc tác phản ứng thủy phân chất béo như mỡ bò ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn tránh làm hỏng các acid béo sản phẩm đặc biệt là các acid béo nhiều nối đôi có giá trị dinh dưỡng cao (Yoshitsugu Kosugi và cs, 1988) Một số tác giả đã dùng lipase trong phản ứng thủy phân chất béo tạo ra acid béo và glycerol, acid béo được dùng trong công nghiệp sản xuất xà phòng (Gormen & Malmos, 1991)

1.3.3.2 Các nghiên cứu thủy phân dầu mỡ bằng enzyme porcine pancreas

lipase

H.T Khor và cs (1986) nghiên cứu thủy phân dầu cọ thu nhận acid béo bằng

enzyme lipase thu từ Candida Rugosa 2975U và porcine pancreatic lipase 38U

(Sigma) thu được kết quả như sau: nhiệt độ tối ưu 370C; pH tối ưu 7.5; tỷ lệ

dầu/hexan 1:0.5 (w/v), mức độ thủy phân đạt được sau 5h là 100%

X Fu và cs (1995) nghiên cứu thủy phân dầu oliu bằng enzyme lipase được

thu nhận từ Aspergillus sp (hoạt độ lipase đặc biệt cao 60.000U/g; Shenyang, Trung

Quốc) thu được kết quả như sau: nhiệt độ tối ưu 370C; pH tối ưu 6.5 – 7.0; mức độ

thủy phân đạt được sau 2h là 75%

Ngoài ra, K Ramani và cs (2012) nghiên cứu thủy phân dầu hướng dương

bằng enzyme lipase Pseudomonas otitidis thu được kết quả như sau: nhiệt độ tối ưu

350C, pH tối ưu 7.5; mức độ thủy phân đạt được sau 3h là 92.3%

Kriti Bhandari và cộng sự (2013) nghiên cứu thủy phân dầu cá ngừ thu nhận

acid béo chứa DHA bằng lipase từ Candida Rugosa đã tiến hành thí nghiệm tại pH=

7.0, nhiệt độ 35oC thu được kết quả tối ưu cho tỉ lệ dầu/nước là 1:10 (w/v) và tỉ lệ

dầu/dung môi là 1:1(w/v); mức độ thủy phân đạt được sau 24h là 86.5%

Abid Ali Khaskheli và cs (2015) nghiên cứu thủy phân dầu thầu dầu (chứa

10 – 50% acid oleic) bằng enzyme lipase Rhizopus oryzae thu được kết quả tối ưu

như sau: nồng độ enzyme/cơ chất (0.01%, w/w); pH 7, nhiệt độ 370C, tỉ lệ dầu/nước (1:4), thời gian thủy phân 12 giờ Hiệu suất thủy phân lên đến 90%

Maria Goretti Marianti Purwantoa và cs (2015) nghiên cứu thủy phân chất

thải dầu cá Sardine bằng enzyme lipase Mucor circinelloides thu được kết quả như

sau: pH tối ưu 5.0; nhiệt độ tối ưu 350C, hàm lượng acid béo omega – 3 đạt 35%, gia tăng 12.56% so với dầu thô ban đầu là: 22.44%; mức độ thủy phân đạt được sau

3 ngày là hơn 80%

Marya Aziz và cs (2015) nghiên cứu thủy phân dầu hoa Rum bằng enzyme lipase thu nhận từ tụy heo thu lại kết quả tối ưu như sau: thời gian thủy phân đối với enzyme lipase tụy là 3 giờ; nồng độ enzyme/cơ chất lipase tụy là 2.0mg enzyme rắn/mL; nồng độ cơ chất dùng cho enzyme lipase tụy là 1mM; nhiệt độ dùng cho enzyme lipase tụy là 45; pH dùng cho enzyme lipase tụy từ 7.0 – 7.5; mức độ thủy

phân đạt được sau 3h là 91.6%

Govind V Waghmare và cs (2016) nghiên cứu thủy phân dầu ăn bị thải đi bằng enzyme lipase (Novozyme 435) kết hợp với sóng siêu âm với điều kiện dung môi tự do thu lại kết quả tối ưu như sau: tỉ lệ dầu/nước 3:1; chất xúc tác 1.25% (w/w), năng lượng siêu âm thấp hơn 100W, nhiệt độ phản ứng 500C Hiệu suất phản ứng đạt được sau 2h là 75.19%

Shweta Gupta và cs (2016) nghiên cứu phản ứng thủy phân dầu oliu bằng

enzyme lipase Candida Rugosa thu được kết quả tối ưu như sau: nhiệt độ 370C; pH 8.0; Iso – octane 0.05M, mức độ thủy phân của dầu oliu đạt được sau 24h là 38.5%

Từ các tài liệu tham khảo, có thể thấy sử dụng enzyme lipase làm xúc tác thủy phân dầu thực vật là hướng nghiên cứu đang thu hút mối quan tâm lớn Xúc tác enzyme có tính chọn lọc cao, điều kiện phản ứng thủy phân “êm dịu” (không đòi hỏi nhiệt độ và áp suất cao Sản phẩm thu được ít bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và có thể giữ được hoạt tính sinh học của chúng Tuy nhiên, đối với mỗi loại enzyme và

cơ chất cụ thể, cần phải có điều kiện phản ứng thích hợp để có hiệu suất cao nhất

Vì vậy, đề tài này tập trung nghiên cứu thủy phân dầu hạt bụp giấm với enzyme lipase tuyến tụy lợn (PPL) để xác định được điều kiện thủy phân phù hợp và bước đầu xác định hoạt tính kháng oxy hóa của sản phẩm phản ứng

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và hóa chất

2.1.1 Hạt Bụp Giấm

Cây Bụp Giấm được canh tác hơn 100ha tại huyện Tuy Phong – Tỉnh Bình Thuận, mỗi hecta thu được 500 – 600kg hạt Thời gian thu hái là vào mùa thu, thu hái trong vòng 15 – 20 ngày Hạt chứa 7.6% nước, 22.3% dầu, 24% protein, 13.5% chất xơ, 7% chất khoáng Dầu hạt Bụp Giấm tương tự như dầu hạt bông vải có tác dụng chống nấm và bệnh ngoài da Dầu chứa vitamin và các chất béo không no, có tác dụng tốt đối với người cao tuổi và người kiêng ăn Ở Myanma, hạt Bụp Giấm chữa suy nhược cơ thể, còn ở Đài Loan, hạt được dùng để nhuận tràng nhẹ, bổ và lợi tiểu

2.1.2 Chế phẩm enzyme Porcine Pancreas lipase (PPL)

Enzyme PPL được sử dụng dưới dạng chế phẩm dạng bột, thu được từ tuyến tụy lợn

do hang Sigma (Mỹ) cung cấp Chế phẩm có hoạt độ riêng là 158U/mg protein, hàm lượng protein là 22.89% (w/w)

Một đơn vị hoạt độ riêng của enzyme (U) được định nghĩa là lượng protein của enzyme giải phóng ra một μmol acid béo từ sự thủy phân cơ chất dầu béo trong thời gian 1 giờ tại pH = 7.7, nhiệt độ 370C

2.1.3 Hóa chất khác

- Acid clohydric (Dùng để thủy phân trong quá trình tách phân đoạn sản phẩm thủy phân), sodium hydroxide, potassium hydroxide (Dùng để trung hòa acid béo, thu acid béo dưới dạng muối K có thể hòa tan trong nước)

- Dimethyl sulfoside (DMSO)

2.1.4 Hexane (www.binhtri.com)

n-Hexane là một hydrocarbon với công thức phân tử C6H14 Hexane là thành phần quan trọng của xăng Là chất lỏng không màu ở nhiệt độ phòng, với nhiệt độ sôi từ 50 – 700C n-Hexane là dung môi không phân cực, dễ bay hơi có mùi giống mùi xăng Chúng được sử dụng rộng rãi do giá cả phải chăng, tương đối an toàn và phần lớn là trơ với các chất khác

2.1.4.1 Tính chất của hexane

- Độ tinh khiết: 99%

- Công thức phân tử: C6H14

- Khối lượng phân tử: 86.18 g/mol

- Ngoại quan: Chất lỏng không màu

- Tính tan trong nước ở 200C: 13mg/l

- Áp suất hơi: 17 kPa (ở 200C)

- Độ nhớt: 0.294cp (ở 200C)

2.1.4.2 Điều chế hexane

n-Hexane chủ yếu được lấy từ dầu mỏ, thành phần chính xác của phân đoạn phụ thuộc chủ yếu vào nguồn dầu và việc tinh chế Sản phẩm công nghiệp (thường chứa khoảng 50% dạng mạnh thẳng, còn lại là các đồng phân như 2-MP, 3-MP, MCP, 2,2-dimethylbutane, neohexane) được chưng cất ở nhiệt độ sôi 65 – 700C

2.1.4.3 Ứng dụng

Li trích dầu thực vật: Hexane làm dung môi ly trích dầu thực vật Chúng giúp

thu hẹp phạm vi chưng cất từ dầu trích, với hàm lượng aromatic thấp giúp loại bỏ hàm lượng màu aromatic không cần thiết Do vậy, chúng được dùng làm dung môi

ly trích của nhiều loại dầu thực vật như: dầu đậu nành, dầu dừa, dầu đậu phụng, dầu

- Máy đo quang phổ UV – VIS

- Cân điện tử Satosisus

- Thiết bị đồng hóa

- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Máy cô quay chân không

- Tủ sấy, cân phân tích

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định giá trị vận tốc ban đầu của enzyme PPL

Vận tốc ban đầu của enzyme porcine pancreas lipase được xác định thông qua đường biểu diễn biến thiên của lượng acid béo sinh ra theo thời gian, trong khoảng

thời gian khảo sát lượng acid béo tăng tuyến tính theo thời gian, tức là đường biểu diễn lượng acid béo sinh ra theo thời gian là một đường thẳng Khi thời gian kéo dài

về sau thì lượng acid béo sinh ra không còn là đường thẳng nữa mà trở thành đường cong Chính vì vậy, ngay tại thời điểm ban đầu lượng acid béo sinh ra theo thời gian

là một đường thẳng nên chúng tôi chọn đây là tốc độ phản ứng ban đầu của enzyme PPL Nếu để lâu thì enzyme sẽ bị biến tính

Cách thực hiện:

+ Chuẩn bị nhũ dầu: Chuẩn bị 300ml nhũ dầu và tiến hành đồng hóa cơ (5000 vòng/phút) trong 20 phút, ổn định hệ nhũ trên máy khuấy từ 10 phút Nhũ dầu đạt nếu không có hiện tượng phân lớp khi để yên 1 giờ

+ Chuẩn bị một loạt 10 erlen 50ml, cho vào đó 10ml ethanol 960 và thêm 3 giọt phenolphthalein 1%

+ Cho dung dịch enzyme vào erlen 250ml đặt trên máy khuấy từ có chứa nhũ dầu

và bắt đầu tính giờ Sau 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60 phút, vô hoạt enzyme bằng cách hút 3ml dịch thủy phân cho vào erlen 50ml trên

+ Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.1N bằng burrete đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây

+ Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.1N với mẫu trắng

Công thức xác định tốc độ thủy phân ban đầu của enzyme PPL:

0

( ).0,1.1000 60

a b

v  

(µmol/ml.phút) Trong đó: a: Lượng NaOH chuẩn độ ở mẫu có enzyme (ml)

b: Lượng NaOH chuẩn độ ở mẫu trắng (ml)

0,1: Nồng độ NaOH

2.3.2 Xác định mức độ thủy phân của enzyme porcine pancreas lipase

Mục đích: Đánh giá hiệu suất thủy phân của enzyme porcine pancreas lipase trên cơ chất là dầu hạt Bụp Giấm

Cách thực hiện:

+ Chuẩn bị nhũ dầu: Chuẩn bị 300ml nhũ dầu và tiến hành đồng hóa cơ (5000 vòng/phút) trong 20 phút, ổn định hệ nhũ trên máy khuấy từ 10 phút Nhũ dầu đạt nếu không có hiện tượng phân lớp khi để yên 1 giờ

+ Chuẩn bị một loạt 10 erlen 50ml, cho vào đó 10ml ethanol 960 và thêm 3 giọt phenolphthalein 1%

+ Cho dung dịch enzyme vào erlen 250ml đặt trên máy khuấy từ có chứa nhũ dầu

và bắt đầu tính giờ Sau 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60 phút, vô hoạt enzyme bằng cách hút 3ml dịch thủy phân cho vào erlen 50ml trên

+ Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.1N bằng burrete đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây

+ Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.1N với mẫu trắng

Công thức xác định mức độ thủy phân của enzyme porcine pancreas lipase

( ).0,1.

.1000(%) 3000.

Trong đó: a: Lượng NaOH chuẩn độ ở mẫu có enzyme (ml)

b: Lượng NaOH chuẩn độ ở mẫu trắng (ml)

0.1: Nồng độ NaOH

Mtb: Khối lượng trung bình của dầu hạt Bụp Giấm

m: Khối lượng dầu trong nhũ tương (g)

2.3.3 Xác định acid béo bằng phương pháp sắc ký khí (GC/FID)(Phạm Hùng

Việt, 2003)

2.3.3.1 Quy trình xử lý mẫu chuẩn hỗn hợp

Cân chính xác lần lượt 100mg chuẩn acid oleic và 150mg chuẩn acid linoleic cho vào bình định mức 10ml Định mức bằng dung môi n – hexan Ta thu được dung dịch chuẩn của acid oleic và acid linoleic có nồng độ tương ứng là 10mg/ml và 15mg/ml Lấy 0.1ml dung dịch này cho vào ống nghiệm 20ml có nút xoáy Thêm vào ống nghiệm 2ml dung dịch NaOH 0.5M pha trong metanol, đậy kín nắp, lắc ống nghiệm trong thời gian 15 phút Cho tiếp 2ml BF3 20% trong metanol, sục khí

N2, đun cách thủy 800C trong 30 phút Mẫu sau đó được chiết bằng 4ml dung dịch n