nghiên cứu khả năng thủy phân protein trong đầu tôm bằng enzyme protease nội tại

26 3.3.6 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng pH môi trường đến hiệu suất thủy phân protein bằng enzyme protease nội bào trong thịt đầu tôm .... Việc nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm trong

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Vi Nhã Tuấn với sự

hướng dẫn của Ts Trần Thanh Trúc Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn

là trung thực và do chính tác giả thực hiện Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài

“Nghiên cứu khả năng thủy phân protein trong đầu tôm bằng enzyme protease

nội tại” đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Cần Thơ, ngày 09 tháng 12 năm 2013 Người hướng dẫn Người viết

Trần Thanh Trúc Vi Nhã Tuấn

LỜI CẢM ƠN



Nhờ sự tận tình giúp đỡ của thầy cô và các bạn, đề tài tốt nghiệp của em đã hoàn

thành Có được kết quả này, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:

Thầy Nguyễn Văn Mười và cô Trần Thanh Trúc, những người đã trực tiếp hướng

dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài Mặc dù bận rộn với công

việc giảng dạy nhưng thầy cô vẫn thường xuyên theo dõi, hướng dẫn và giúp đỡ em

rất tận tình

Thầy cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng,

Trường Đại hoc Cần Thơ đã cho em những kiến thức quý báu trong thời gian học

tập tại trường Những kiến thức tích lũy được từ sự giảng dạy tận tình của quý thầy

cô đã giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này

Cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và

Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em

hoàn thành tốt đề tài của mình

Chị Võ Thị Anh Minh – học viên Cao học ngành Công nghệ thực phẩm khóa 19,

chị đã truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ em tận tình về kiến

thức cũng như phương pháp học tập, nghiên cứu

Các bạn sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khoá 36 đã nhiệt tình đóng góp ý kiến

và động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm

Cuối lời em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô trường Đại học

Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học tập tại

trường

Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công

Em xin chân thành cảm ơn

Cần Thơ, ngày 09 tháng 12 năm 2013

Sinh viên thực hiện

TÓM TẮT



Nghiên cứu khả năng thủy phân protein bằng enzyme protease nội bào từ đầu tôm sú nhằm

tìm hiểu về quy luật biến đổi về khả năng thủy phân protein đã được tiến hành Thông qua

nội dung nghiên cứu, một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein như điều

kiện bảo quản lạnh đông, thời gian thủy phân thích hợp, ảnh hưởng của pH môi trường

thủy phân đã được quan tâm Đặc biệt, điều kiện tiền xử lý nhiệt nhằm kích hoạt enzyme

protease nội bào đã được tối ưu hóa theo phương pháp bề mặt đáp ứng với 2 thừa số bao

gồm 24 đơn vị thí nghiệm

Từ các kết quả thí nghiệm cho thấy, thời gian thủy phân protein tốt nhất không có sự phát

triển vi sinh vật gây thối trong đầu tôm sú là 8 giờ Nguyên liệu có thể được tồn trữ đông ở

nhiệt độ -18°C, hiệu suất thủy phân protein sau 8 tuần duy trì khoảng 80% so với thời

điểm ban đầu (mẫu không lạnh đông), tuy nhiên hiệu suất thủy phân giảm thấp ở tuần bảo

quản thứ 3 và 4 Đồng thời, quá trình thủy phân protein đạt tốt nhất điều chỉnh pH môi

trường là 9, kết hợp với thông số tối ưu của điều kiện tiền xử lý nhiệt nguyên liệu là

50,73°C và thời gian 4,43 phút

Từ khóa: thịt đầu tôm sú, thời gian thủy phân, tiền xử lý, pH môi trường,

protease

MỤC LỤC



LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH HÌNH vi

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT viii

Chương 1 TỒNG QUAN 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 THỊT ĐẦU TÔM SÚ - NGUỒN NGUYÊN LIỆU CHỨA ENZYME PROTEASE 3 2.1.1 Tôm sú – nguồn thủy sản lạnh đông xuất khẩu 3

2.1.2 Thực trạng xử lý và tiêu thụ đầu tôm sú và thịt đầu tôm sú ở nước ta 4

2.2 KHÁI QUÁT VỀ PROTEASE VÀ HỆ PROTEASE TRONG THUỶ SẢN 6

2.2.1 Tổng quan về protease 6

2.2.2 Hệ serine protease 11

2.2.3 Protease của tôm sú 13

2.2.4 Khả năng ứng dụng protease 14

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân của enzyme 16

2.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN 18

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 21

3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm 21

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 21

3.1.3 Hóa chất sử dụng 21

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 22

3.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả 22

3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả 22

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23

3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 23

3.3.2 Xác định thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú 24

3.3.3 Thí nghiệm 1: Xác định thời gian thủy phân thích hợp đến đặc tính cảm quan dịch thủy phân và hiệu suất thủy phân protein 24

3.3.4 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng trữ đông thịt đầu tôm đến sự ổn định của hiệu quả thủy phân protein bằng protease nội bào 26

3.3.5 Thí nghiệm 3: Tác động của điều kiện tiền xử lý giúp kích hoạt protease nội bào

đến hiệu suất thủy phân protein từ thịt đầu tôm 26

3.3.6 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng pH môi trường đến hiệu suất thủy phân protein bằng enzyme protease nội bào trong thịt đầu tôm 27

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 THÀNH PHẦN HÓA LÝ CƠ BẢN CỦA THỊT ĐẦU TÔM SÚ 29

4.2 XÁC ĐỊNH THỜI GIAN THUỶ PHÂN PROTEIN TỪ THỊT ĐẦU TÔM SÚ THÍCH HỢP 30

4.3 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TRỮ ĐÔNG THỊT ĐẦU TÔM ĐẾN HIỆU QUẢ THỦY PHÂN PROTEIN 31

4.4 ẢNH HƯỞNG NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN TRƯỚC KHI THUỶ PHÂN ĐẾN HIỆU SUẤT THỦY PHÂN PROTEIN BẰNG ENZYME PROTEASE NỘI BÀO TỪ ĐẦU TÔM 33

4.5 ẢNH HƯỞNG pH ĐẾN HIỆU SUẤT THỦY PHÂN PROTEIN BẰNG ENZYME PROTEASE NỘI BÀO TỪ THỊT ĐẦU TÔM 38

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 KẾT LUẬN 40

5.2 ĐỀ NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ix

PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ xv

PHỤ LỤC 3 KẾT QUẢ SỐ LIỆU XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN xxviii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Tôm sú Penaeus monodon 4

Hình 2.1 Phản ứng thủy phân liên kết peptide do tác động của protease 6

Hình 2.2 Cơ chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase 7

Hình 2.3 Cấu tạo hóa học của serin peptidase 8

Hình 2.4 Cấu tạo phân tử của serine protease 9

Hình 2.5 Cấu tạo phân tử cystein protease 9

Hình 2.6 Cấu tạo phân tử của aspartic protease 10

Hình 2.7 Cấu tạo phân tử của metallo protease 11

Hình 2.8 Sơ đồ các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease 12

Hình 2.9 Hình dạng các gốc amino acid ở các túi khác nhau của serine protease 12

Hình 2.10 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến phản ứng thủy phân của enzyme 16

Hình 2.11 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng thủy phân của enzyme 16

Hình 2.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân của enzyme 17

Hình 2.13 Ảnh hưởng của pH môi trường đến phản ứng thủy phân của enzyme 18

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 23

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 25

Hình 4.1 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thuỷ phân protein bằng protase nội bào trong thịt đầu tôm 30

Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng thời gian bảo quản lạnh đông đến hiệu suấtthủy phân protein 32

Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý nguyên liệu lên hiệu suất thủy phân protein của enzyme protease 34

Hình 4.4 Đồ thị tương quan giữa hiệu suất thuỷ phân theo thực nghiệm và tính toán theo phương trình hồi quy 36

Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và thời gian đến hiệu suất thủy phân protein 36

Hình 4.6 Đồ thi so sánh hiệu suất thủy phân và hàm lượng protein hòa tan giữa hai mẫu đối chứng và tối ưu 37

Hình PL1 Đồ thị phương trình đường chuẩn protein xxviii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú 5

Bảng 2.2 Một số serine protease có nguồn gốc động vật thông dụng hiện nay 8

Bảng 3.1 Phương pháp và thiết bị sử dụng để phân tích các chỉ tiêu 22

Bảng 4.2 Kết quả thống kê sự thay đổi hiệu suất thuỷ phân và protein hòa tan theo thời gian bảo quản lạnh đông 32

Bảng 4.3 Ảnh hưởng các nhân tố đến phương trình hồi quy 35

Bảng 4.4 Hiệu suất thủy phân và hàm lượng protein hòa tan thay đổi theo pH 38

Bảng PL1 Xây dựng đường chuẩn protein x

Bảng PL2 Số liệu xây dựng đường chuẩn protein xxviii

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

BSA Bovin serum albumin

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

HLSO Head Less Shell On

PMSF Phenyl Methane Sulfonyl Flouride (PMSF)

SBTI Soya Bean Trypsin Inhibitor

VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers

CHƯƠNG 1 TỒNG QUAN

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngành chế biến thủy sản trong nước và trên thế giới hàng năm thải ra một lượng lớn

các phụ phẩm cần được xử lý và chế biến tiếp Phụ phẩm thủy sản thường là nội

tạng, đầu, xương, da…Để giải quyết một lượng lớn phụ phẩm như hiện nay, tại Việt

Nam và trên thế giới đang có xu hướng thu phần phụ phẩm để chế biến thành những

sản phẩm có giá trị gia tăng Ở nước ta hiện nay, tôm là loài động vật thủy sinh

đang đứng đầu trong ngành nuôi trồng thủy sản Với mức đóng góp 70 – 80% giá trị

tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản nên hiện nay tôm là mặt hàng chế biến xuất

khẩu chủ lực của ngành, chủ yếu là tôm đông lạnh Tôm là thực phẩm có giá trị dinh

dưỡng cao (chứa 21,04% protein) Theo báo cáo của Bộ Thủy Sản sản lượng tôm

năm 2012 là 476.424 tấn Trong quá trình gia công chế biến tôm thường loại ra các

phế phụ phẩm như nội tạng, đầu và vỏ tôm (thường chiếm 50 – 70% nguyên liệu

ban đầu) Với tỷ lệ đầu tôm được loại bỏ trong quá trình chế biến khoảng 34% khối

lượng ban đầu (Tran et al., 2011), trung bình hàng năm Việt Nam có khoảng 35.000

- 46.000 tấn đầu tôm được thải ra từ các nhà máy Hiện nay, lượng đầu tôm chủ yếu

dùng làm phân bón, thức ăn gia súc, thủy sản Tuy nhiên giá trị thành phẩm của các

sản phẩm này chưa cao Việc nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm trong thời

gian gần đây là một hướng mới nhằm sử dụng có hiệu quả nguồn đầu tôm phụ

phẩm, đây được xem như là một loại bao bì có tính năng bảo vệ và có thể sử dụng

như thực phẩm mà không hề ảnh hưởng đến môi trường chung quanh (Trung et al.,

2003) Tuy nhiên, việc sản xuất chitosan đòi hỏi phải loại bỏ lượng thịt trong đầu

tôm (chiếm đến 15,25% khối lượng đầu tôm và 5,5 % so với nguyên liệu tôm sú

tươi), tạo ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường Chính vì thế, yêu cầu đặt ra là nghiên

cứu biện pháp sử dụng nguồn nguyên liệu giàu protein và enzyme này nhằm nâng

cao giá trị thương phẩm của tôm sú, đồng thời làm giảm tác động ô nhiễm môi

trường do quá trình xử lý đầu tôm gây ra là vấn đề có tính cấp thiết

Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ

20 đến nay Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại lợi nhuận lớn cho nhiều nước,

sản lượng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị trường thế gới tăng

20 - 30% mỗi năm (Murado et al., 2009) Trong đó, protease là enzyme thủy phân

có giá trị thương mại rất lớn, chiếm khoảng 60% tổng lượng enzyme công nghiệp

được cung cấp trên thị trường thế giới (Joo và Chang, 2006) với nhiều ứng dụng

các nghiên cứu ứng dụng protease gần đây đã chỉ ra vai trò tích cực của việc sử

dụng các protease trung tính và đặc biệt là protease ưa kiềm trong việc tầm soát các

bệnh liên quan đến sự nghẽn mạch do sự đông tụ của fibrin (Phan Thị Bích Trâm et

al., 2007) hay ứng dụng trong thủy phân protein, làm mềm thịt (Heu và Kim, 2002),

thủy phân tạo dịch trích protein từ phụ phẩm cá (Prasertsan và Prachumratana,

2013), khử protein trong phụ phẩm tôm, giúp quá trình chiết tách chitin, chitosan

đạt hiệu quả tốt (Nedra et al., 2011) Chính điều này đã mở ra triển vọng cho việc

nghiên cứu hoạt tính enzyme protease từ thịt đầu tôm sú, giúp tận dụng triệt để

lượng phụ phẩm của tôm trong quá trình chế biến và tăng hiệu quả kinh tế cho

ngành thủy sản nói chung, ngành xuất khẩu tôm nói riêng

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục đích chung của đề tài là nghiên cứu khả năng thuỷ phân protein của thịt đầu

tôm bằng enzyme nội tại Để đạt được mục đích này, đề tài tập trung vào các nội

dung cụ thể sau:

 Xác định thời gian thủy phân thích hợp đến đặc tính cảm quan dịch thủy

phân và hiệu suất thủy phân protein

 Đánh giá ảnh hưởng của việc trữ đông đến hiệu quả thủy phân protein từ thịt

đầu tôm sú

 Tác động của điều kiện tiền xử lý (nhiệt độ, thời gian) nhằm kích hoạt

protease nội bào đến hiệu suất thủy phân protein từ thịt đầu tôm

 Khảo sát ảnh hưởng việc điều chỉnh pH ban đầu đến hiệu quả thủy phân

protein từ thịt đầu tôm bằng enzyme protease nội bào

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 THỊT ĐẦU TÔM SÚ - NGUỒN NGUYÊN LIỆU CHỨA ENZYME

PROTEASE

2.1.1 Tôm sú – nguồn thủy sản lạnh đông xuất khẩu

2.1.1.1 Tổng quan

Tôm sú (có tên khoa học là Penaeus monodon, Fabricius, 1798, trích dẫn bởi

Holthuis, 1980) là loài sống ở nơi đáy bùn pha cát với độ sâu từ ven bờ đến 40 m

nước Khi tôm trưởng thành thường di chuyển xa bờ vì chúng thích sống vùng nước

Trong tự nhiên tôm sú nước mặn đến mùa sinh sản sẽ tiến vào gần bờ để đẻ trứng,

trứng nở ra ấu trùng và trải qua năm thời kỳ biến thái: Naupilus, Zoea, Mysis,

Postlarvae, Juvenile Từ đây ấu trùng theo sóng biển dạt vào cửa sông nơi nước biển

và nước sông pha trộn lẫn nhau nên độ mặn thấp hơn Đây chính là điều kiện tốt cho

ấu trùng phát triển Tôm sú có đặc điểm sinh trưởng nhanh, trong 3 ÷ 4 tháng có thể

đạt cỡ bình quân 40 ÷ 50 gam (Holthuis, 1980)

Hình 2.1 Tôm sú Penaeus monodon

(Nguồn: http://tepbac.com/species/full/1/Tom-su.htm)

2.1.1.2 Tình hình sản xuất tôm đông lạnh ở Việt Nam

Tôm đông lạnh đã và đang là một mặt hàng xuất khẩu có kim ngạch cao ở Việt Nam

và đang cạnh tranh mạnh mẽ với thị trường xuất khẩu lớn trên thế giới là Thái Lan

vì gặp khó khăn do vấn đề tôm bệnh Hơn thế nữa, nguồn cung tôm thế giới bị hạn

chế bởi sản lượng tôm từ Thái Lan giảm mạnh do ảnh hưởng của EMS khiến giá

tôm tăng trên toàn cầu Nhờ đó, giá trị xuất khẩu tôm Việt Nam sang các thị trường

lớn tăng lên

Trong đó, tôm sú là sản phẩm chính, chiếm hơn 50% tổng lượng tôm xuất khẩu

trong cả nước Theo số liệu của VASEP (2010), tổng khối lượng xuất khẩu của mặt

hàng tôm sú là 121.399 tấn, chiếm 10,44% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản trong cả

nước và 56,7% tổng giá trị xuất khẩu ngành tôm Đến cuối tháng 6 năm 2013, tổng

lượng xuất khẩu tôm sú có sụt giảm, nhưng vẫn là ngành hàng chủ lực nhất Trong

đó, mặt hàng tôm sú bỏ đầu HLSO là sản phẩm được ưa chuộng trên nhiều thị

trường, đặc biệt trên thị trường Nhật Bản Tôm sú HLSO Việt Nam cỡ 16/20 cuối

tháng 6/2013 tăng thêm 5,5 USD/kg so với tháng 1/2013, từ 10,72 USD/kg lên

16,23 USD/kg Tôm sú HLSO cỡ 16/20 từ Ấn Độ cũng tăng thêm gần 5 USD/kg, từ

11,03 USD/kg lên 15,95 USD/kg

(Nguồn:

http://www.vasep.com.vn/Tin-Tuc/378_30440/Hien-trang-va-tiem-nang-thi-truong-xuat-khau-tom-Viet-Nam.htm)

Điều này mở ra hướng khai thác nguồn thịt đầu tôm sú dồi dào này cho chế biến các

sản phẩm giá trị gia tăng, nâng cao giá trị của con tôm sú ở Việt Nam

2.1.2 Thực trạng xử lý và tiêu thụ đầu tôm sú và thịt đầu tôm sú ở nước ta

Một trong những ứng dụng phổ biến nhất là sử dụng đầu tôm trong chế biến

chitin, chitosan Trong quy trình này, việc thủy phân protein trong thịt đầu tôm

et al (2008) cũng đã nghiên cứu đưa ra giải pháp tiền xử lý bằng acid formic trong

quy trình sản xuất chitosan từ đầu tôm nhằm giảm thiểu lượng hóa chất và chất thải

gây ô nhiễm môi trường Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007) đã nghiên cứu

tách chiết chitin từ đầu – vỏ tôm bằng các phương pháp sinh học (sử dụng

Bromelanin trong dịch ép vỏ dứa) Nhiều nghiên cứu trong nước đã tận dụng nguồn

đầu tôm chủ yếu cho chế biến thức ăn gia súc Phan Thị Bích Trâm và Phạm Thu

Cúc (2004) đã xác nhận thành công của việc xử lý vỏ đầu tôm với rỉ đường và

enzyme dùng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm Trịnh Ngọc Vinh (2006) đã tiến

hành ủ chua đầu vỏ tôm có thêm vi khuẩn Lactobacillus spp giúp quá trình lên men

được nhanh hơn Sau đó, khảo sát nồng độ đường, nồng độ muối, nồng độ vi khuẩn

Lactobacillus spp thích hợp trong việc bảo quản đầu vỏ tôm bằng phương pháp lên

men ủ chua Qua đó, góp phần tạo ra sản phẩm thức ăn gia súc có chất lượng cao

hơn, có tính phổ biến rộng rãi, giá trị kinh tế cao và giảm thiểu việc gây ô nhiễm

môi trường Phạm Thị Đan Phượng và các cộng sự của Trường Đại học Thủy sản

Nha Trang (2008) cũng đã nghiên cứu xử lý carotenoprotein thu hồi từ quá trình sản

xuất chitin và bước đầu thử nghiệm phối trộn thức ăn cá

Thành phần hóa học cơ bản của thịt đầu tôm sú (bảng 2.1) cho thấy đây

chính là nguồn giàu protein, đồng thời thịt đầu tôm có giá trị pH khá cao (7,3) khi

so sánh với pH của thịt tôm tươi (pH = 6,8 ÷ 6,9; Nguyễn Xuân Phương, 2003)

Điều này cho thấy, thịt đầu tôm rất dễ chịu sự tấn công của các vi sinh vật và các

biến đổi sinh hóa, hóa học gây hư hỏng (Tran et al., 2011)

Bảng 2.1 Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú

(Nguồn : Tran et al., 2011)

Các nghiên cứu này đều cho thấy tầm quan trọng của việc ứng dụng một hệ

enzyme protease nhằm trợ giúp cho quá trình thủy phân dịch protein có sẵn trong

nguồn nguyên liệu đầu tôm này là cần thiết

2.2 KHÁI QUÁT VỀ PROTEASE VÀ HỆ PROTEASE TRONG THUỶ SẢN

2.2.1 Tổng quan về protease

2.2.1.1 Khái niệm enzyme protease

Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thủy phân các liên kết peptid của

protein hay polypeptid (–CO–NH–) tạo thành các sản phẩm peptide, pepton,

tri-dipeptide, axit amin Nhiều enzyme protease có khả năng xúc tác phản ứng thủy

phân liên kết ester, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc axit amin

Hình 2.1 Phản ứng thủy phân liên kết peptide do tác động của protease

(Nguồn: Barrett, 2001)

2.2.1.2 Phân loại enzyme protease

 Dựa vào cơ chế xúc tác:

Theo IUMBM “Internation Union of Biochemistry and Molecular Biology”

peptidase chia thành hai nhóm:

 Exopeptidase (còn gọi peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch):

thủy phân liên kết –CO–NH– ở đầu tận cùng chuỗi polypeptide, bao gồm

amino–peptidase (xúc tác đầu có gốc amin tự do gọi là enzyme aminopeptidase),

carboxyl–peptidase (xúc tác cắt liên kết –CO–NH– ở đầu carboxyl tự do gọi là

enzyme carboxylpeptidase)

 Endopeptidase (còn gọi proteinase hay enzyme phân cắt nội mạch):

xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide nằm bên trong chuỗi polypeptidase

Hình 2.2 Cơ chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase

(Nguồn: Đặng Thị Đăng Phương, 2005)

 Dựa vào pH hoạt động

Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH khác nhau, protease được chia

làm ba nhóm:

 Protease axit: pH tối thích trong khoảng 2 ÷ 5 Chúng được thu nhận từ

các loại nấm mốc đen: Aspergillus niger (A niger), A awamori, A saitoi và các

loài Mucor pusillus, Rhizopus sp., Trametes sanguineara

 Protease trung tính: pH tối thích khoảng hẹp 6 ÷ 7,5 không bền ở nhiệt độ

cao và mất hoạt tính khi có sự hiện diện protease kiềm Được thu nhận từ những

loài nấm mốc khác nhau nhưng chủ yếu là các loài nấm mốc vàng, điển hình như A

oryzae, A flavus, A fumigatus, A tericola

 Protease kiềm: pH tối thích trong khoảng 8 ÷ 11 được thu nhận từ nấm

mốc, nấm men và vi khuẩn Bacillus subtilis Những protease kiềm là nhóm được

quan tâm khá nhiều gần đầy vì có thể sử dụng chúng như những chất phụ gia trong

quá trình thuộc da, trong chất giặt tẩy, xử lý chất thải môi trường

(Đặng Thị Đăng Phương, 2005)

 Dựa vào đặc điểm cấu tạo trung tâm hoạt động

Được chia thành 4 nhóm:

 Serine peptidase (EC 3.4.21)

Hình 2.3 Cấu tạo hóa học của serin peptidase

Nhóm protease này có khối lượng phân tử từ 20000 ÷ 27000 Một số protease có

khối lượng phân tử lớn hơn như các enzyme của Penicillium cyoneo – fulvum lên

đến 44.000 Số gốc axit amin thường ít hơn 280 gốc, có pH tối thích từ 7 ÷ 11 và

điểm đẳng điện tại pH = 9 Đại diện cho nhóm là các enzyme có nguồn gốc từ động

vật là trypsine, chymotrypsine, elastate, plasmine và thrombine Một số được tổng

hợp từ nấm mốc và vi khuẩn Bacillus cereus, B firmus, B lichenoformis, A flavus,

A oryzae, A sojae, Streptomyces frachiac, E coli Hai acid amin hình thành tâm

hoạt động là serine và histidine Tác nhân làm mất hoạt tính enzyme nhóm này là

diisopropyl-phosphofluoridate (DFP) hay phenylmethanesulfonyl flouride (PMSF),

coumarin và một số chất ức chế thuận nghịch như antitrypsine ở đậu nành (SBTI),

aprotinine, chymostatine Hiện nay nhóm serine protease đã được phát hiện và

nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau với các tên thông dụng ở Bảng 2.2

Bảng 2.2 Một số serine protease có nguồn gốc động vật thông dụng hiện nay

Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài

Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài Máu

Máu

Hệ thống tiêu hóa ở động vật

(Nguồn: Phan Thị Bích Trâm, 2010)

Hình 2.4 Cấu tạo phân tử của serine protease

(Nguồn: http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MASS/examples.html)

 Cytein peptidase (EC 3.4.22)

Thường gặp ở thực vật bậc cao Đặc trưng nhóm này là papaine, bromeline, ficine

và protease từ vi sinh vật Streptococus, Clostridium histolyticum Tâm hoạt động

bao gồm 2 acid amin là cystein và histidine Enzyme hoạt động vùng pH rộng

khoảng 4,5 ÷ 10 và pH tối thích từ 6 ÷ 7,5 phụ thuộc cơ chất, có khả năng bền nhiệt

độ từ 60 – 80°C ở pH tự nhiên Chất ức chế hoạt động enzyme là sulfhydryl,

iodoacetamid, p-cloromereur

Hình 2.5 Cấu tạo phân tử cystein protease

(Nguồn: http://csgid.org/csgid/deposits/view/1018)

 Aspartic peptidase (EC 3.4.23)

Khối lượng phân tử từ 30000 ÷ 40000, gồm 290 ÷ 340 gốc axit amin Đại diện là

các enzyme có nguồn gốc từ động vật như rennin, pepsin Aspartic peptidase nguồn

gốc từ vi sinh vật có thể chia hai nhóm cơ bản là pepsin–like và rennin–like Nhóm

pepsin–like được thu nhận từ A oryzae, A niger, A awamori, A saitoi, Rhizopus

chinensis, Penicillium spp., Trametes sanguinea… Nhóm giống rennin được thu

nhận từ A usami, Mucor pusillus, Endothia parasitica… Phân tử aspartic peptidase

có hai nhóm carboxyl, một ở miền tiếp xúc và một ở trung tâm hoạt động Trung

tâm hoạt động gồm 3 axit amin với 2 phân tử axit aspartic và phân tử tyrosine

Vùng pH tối thích từ 2 ÷ 4 (còn gọi là protease – axit tính), riêng pathepsin D có pH

tối thích từ 3 ÷ 5 Tuy nhiên pH tối thích còn phụ thuộc cơ chất và nguồn enzyme

Với rennin pH từ 6 ÷ 7, tính đặc hiệu rất cao cắt liên kết k–casein làm đông tụ sữa

Enzyme bị ức chế bởi pepstatin, diazoacetyl, DL norlox-metil ester

Hình 2.6 Cấu tạo phân tử của aspartic protease

(Nguồn: http://www2.units.it/ceb/romeo.html)

 Metallo peptidase (còn gọi là protease kim loại EC 3.4.24)

Khối lượng phân tử từ 33800 ÷ 48000, có từ 315 ÷ 450 gốc axit amin Enzyme

nhóm này bao gồm exopeptidase, dipeptidase, amino peptidase, carboxylpeptidase,

prolidase, prolisase và một số protease thu nhận từ vi sinh vật như: A oryzae,

Bacillus cereus, B megaterium, B subtillis, B thermoprotealyticus, B

subtiliamylo- saccariticus, Streptomyces griseus, S naraensis, Acremonium

kiliense, Clostridium… Hầu hết các protease đều chứa các ion kim loại trong phân

tử enzyme Phần lớn đều chứa 1 mol Zn2+ trên 1 mol protein, với prolidase và

prolisase thay bằng 1 mol Mn2+ Hoạt động trong vùng pH 6 ÷ 9 Nhìn chung, tính

đặc hiệu của chúng không cao, bị bất hoạt bởi EDTA, natridodecylsulfate,…

Hình 2.7 Cấu tạo phân tử của metallo protease

(Nguồn: http://opm.phar.umich.edu/protein.php?pdbid=3b4r)

2.2.2 Hệ serine protease

Serine protease có chung nhóm phân loại EC 3.4.21 là một trong số các enzyme

được nghiên cứu khá rộng rãi ngoài khả năng thủy phân protein trong quá trình tiêu

hóa của động vật phổ biến nhất là trypsin, chymotrypsine và elastase Serine

protease còn tham gia vào nhiều hiện tượng sinh lý trong cơ thể như phá cục máu

nghẽn và hoạt hóa các bổ thể (Phan Thị Bích Trâm, 2011 ; Gupta et al., 2002)

Trung tâm hoạt động của nhóm enzyme này chứa các amono acid aspartic, histidin

và serine trong đó serine giữ vai trò trực tiếp gắn với cơ chất theo cơ chế được trình

bày Hình 2.8

Cơ chế theo hình 2.8 gồm 3 phản ứng:

Phản ứng 1: nhóm –OH của serine trong trung tâm hoạt động ezzyme kết hợp với

nhóm C=O của liên kết peptide trong chuỗi polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp tứ

diện (tretahedral complex)

Phản ứng 2: ở trạng thái phức hợp chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên chuyển

diện tích lên O tạo nhóm C=O mới làm đứt liên kết peptide giải phóng mạch

polypeptide đầu N và hình thành các hợp chất trung gian acyl-emzyme mới

Phản ứng 3: với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu C còn lại

và khôi phục trung tâm hoạt động của serine protease

Hình 2.8 Sơ đồ các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease

(Nguồn : Phan Thị Bích Trâm, 2011)

Như vậy, ngoài cơ chế chung các enzyme thuộc nhóm này có tính chất cắt riêng biệt

là do trong phân tử protein có một “túi” (pocket) luôn được định vị gần trung tâm

hoạt động nhóm serine (Hình 2.9)

Hình 2.9 Hình dạng các gốc amino acid ở các túi khác nhau của serine protease

Hình dạng và sự tích điện của túi khác nhau sẽ cho các vị trí cắt chuyên biệt của

từng serine protein khác nhau

Chymotrypsine với túi chỉ chứa các nhánh amino acid kỵ nước cồng kềnh Vì vậy,

nhóm này chỉ thích hợp với các mạch bên –R của phenylalanin, tryptophan, tyrosine

của chuỗi polypeptide

Trypsine với các túi chứa aspartic ở vị trí trong cùng nên chỉ thích hợp với các mạch

bên R của các amino acid tích điện dương như arginine, lysine

Elastase với túi chứa hai phân tử valine nên chỉ chứa đủ các amino acid của mạch

bên R như glycine, alanine và valine

Plasmin thuộc nhóm serine protease (EC 3.4.21.7) là enzyme quan trọng có mặt

trong máu để thủy phân các cục máu nghẽn fibrin, hoạt động giống trypsine có khả

năng thủy phân các liên kết peptide có mạch bên R của asginine và lysine trong

chuỗi polypeptide

(Gupta et al., 2002)

2.2.3 Protease của tôm sú

Sự tiêu hoá và trao đổi chất protein và các hợp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác

khác nhau rất nhiều Hầu hết, các cơ chế tiêu hoá và hấp thụ khác với động vật có

xương sống Các enzyme tiêu hoá, đặc biệt các enzyme tiêu hoá protein ở giáp xác

nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá Các

protease tìm thấy trong tôm bao gồm carboxypeptidases A và B, trypsine,

chymotrypsine, cathepsin và collagenase (Hernandez–Cortes et al 1997; Honjo

et al 1990; Kim et al 1992; Liu and Cheung 1989; Nip et al 1985; Roy et al 1996;

Tsai et al 1986; Van Worrnhoudt et al 1992)

Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sản khác là các protease nội

bào, tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó là nội tạng và cơ thịt Đặc biệt

là ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập

trung nhiều nhất ở phần đầu, sau đó đến các cơ quan khác

Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsine hoặc protease serine

dạng trypsine và có khả năng hoạt động rất cao

Một số protease tiêu biểu như: cathepsin, dipeptidase, carboxypeptidase, trypsine…

(Nguồn: Bộ Nội thương, 1982)

Khả năng hoạt động của các enzyme tiêu hoá protein khác nhau tuỳ theo loài

và tôm đất (Metapenaecus ensis) thấp hơn ở Penaeus pencillatus, Penaeus

monodon và Penaeus japonnicus

Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu (1993) cùng cộng tác viên về

protease đầu tôm biển và Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004) về protease đầu tôm bạc

nghệ cho thấy các enzyme tiêu hoá protein là các enzyme hoạt động mạnh trong

môi trường kiềm

Theo Nguyễn Việt Dũng (1999) thì protease từ tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở

môi trường gần trung tính

Như vậy, qua một số nghiên cứu của một số tác giả cho thấy enzyme từ tôm nói

chung là các protease kiềm tính Các enzyme này đều có tính chất chung của

enzyme là:

– Hoà tan được trong nước, dung dịch nước muối và một số dung môi hữu cơ

nên dựa vào tính chất này để tách chiết chúng

– Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hoà (sulphatamon), ethanol,

acetone để thu chế phẩm enzyme

– Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt

Protease là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau

như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da,

công nghiệp sản xuất xà phòng

 Trong công nghiệp và chế biến thực phẩm

o Trong sản xuất nước chấm: nước mấm, tương, chao…

o Trong công nghệ thực phẩm: làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi

chế biến

o Trong công nghệ sữa các protease như rennin, pepsine được dùng

trong sản xuất formate, sữa đông tụ

o Trong công nghệ thuộc da: làm mềm lông, sạch lông, bôn da,…

o Trong công nghệ tơ tằm: làm bóng và tách rời các sợi tơ

 Trong nông nghiệp: protease được bổ sung vào thức ăn động vật nuôi nhằm

tăng khả năng tiêu hóa, chúng được xử lý trực tiếp vào thức ăn trước khi sử dụng

hoặc xử lý sơ bộ thức ăn Hiện nay, các chế phẩm vi sinh chứa hỗn hợp protease và

các enzyme thủy phân khác cũng được sử dụng cho ngành nuôi trồng thủy sản làm

tăng hệ số tiêu hóa, làm giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường nước nuôi

Ngoài ra protease còn ứng dụng rộng rãi trong một số ngành khác như công nghiệp

thuộc da để làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông ra khỏi da nhưng không

làm ảnh hưởng đến chất lượng da Trong công nghệ sản xuất xà phòng làm tăng khả

năng tẩy vết bẩn có thành phần là protein

(Phan Thị Bích Trâm, 2011)

 Trong mỹ phẩm: người ta trộn một lượng nhỏ protease vào keo xoa, keo

cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế

bào da

 Trong y học

o Protease được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật, sản

xuất huyết thanh miễn dịch

o Sử dụng enzyme collagenase trong điều trị cơ gân, mạch máu,… bị xơ cứng

o Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh

mạch

o Các protease như trypsine,  -chymotrypsine dùng sản xuất thuốc chữa bệnh

kém tiêu hóa, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông đường hô hấp rất thông dụng trên thị

trường dược phẩm

 Trong kỹ nghệ phim ảnh: protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các

nguyên liệu như phim ảnh, phim Ronghen Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ

tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các

loại phim và giấy ảnh quý

(Đỗ Quý Hai, 2004)

2.2.4.2 Ứng dụng của protease kiềm nguồn gốc động vật

Protease ưa kiềm là nguồn cung cấp enzyme chủ yếu trên thị trường enzyme thế

giới (Godfrey và West, 1996) Bên cạnh nguồn protease ưa kiềm nguồn gốc vi

khuẩn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp, điển hình như

Alkazym (Novodan, Conpenhagen, Đan Mạch), Tergazyme (Alconox, NewYork,

da, lông heo) cũng được biết đến với nhiều ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất xà

phòng, xử lý chất thải, ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc nhờ vào việc thủy

phân dịch protein của các phụ phẩm của thủy sản

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân của enzyme

2.2.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì tốc độ phản ứng phụ thuộc

vào [S], v= K[E] có dạng y=ax Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách đo vận tốc

phản ứng do enzyme đó xúc tác Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc

phản ứng chậm

Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa thì vận

tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó

Hình 2.10 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến phản ứng thủy phân của enzyme

(Nguồn: Đỗ Quý Hai, 2004)

2.2.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ

chất Nhưng khi tăng nồng độ cơ chất đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ

chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng

Hình 2.11 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng thủy phân của enzyme

(Nguồn: Đỗ Quý Hai, 2004)

Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất, nồng độ

từng enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những điều kiện cụ

thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme

2.2.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng enzyme

không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ

tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ

giảm và dẫn đến mức triệt tiêu

Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm,

khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính

Ngược lại, ở nhiệt độ 0°C, enzyme bị hạn chế rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên

từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp

Ở nhiệt độ thấp (0 ÷ 41°C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng Sự gia tăng

vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng

Ở nhiệt độ sau đó (tùy thuộc vào từng loại enzyme, ở khoảng 45°C), vận tốc phản

ứng giảm do sự biến tính của protein Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80 ÷ 100°C

Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất,

pH, lực ion của môi trường

Hình 2.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân của enzyme

(Nguồn: Đỗ Quý Hai, 2004)

2.2.5.4 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH của môi trường có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân vì nó ảnh hưởng

đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein – enzyme

Mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều

yếu tố khác như: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ…

Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng cũng có một số

enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepxin, protease axit của vi sinh vật,…) hoặc khá

cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10

Hình 2.13 Ảnh hưởng của pH môi trường đến phản ứng thủy phân của enzyme

(Nguồn: Đỗ Quý Hai, 2004)

2.2.5.5 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay ngắn

phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệt độ,… Thời gian thủy

phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản

phẩm cần thiết của quá trình thủy phân Khi cơ chất cần thủy phân đã thủy phân hết,

quá trình thủy phân kết thúc Thời gian thủy phân phải thích hợp để đảm bảo hiệu

suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt

Trong thực tế, thời gian thủy phân phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm

thực tế cho từng quá trình thủy phân cụ thể

(Nguồn: Đỗ Quý Hai, 2004)

2.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN

Nghiên cứu thủy phân protein theo con đường enzyme đã được quan tâm không chỉ

ở các nước trên thế giới, ngay cả ở Việt Nam từ rất sớm Các nghiên cứu thủy phân

protein từ các nguyên liệu khác nhau đã được thực hiện với mục đích ứng dụng đa

dạng, từ các nghiên cứu truyền thống thủy phân protein trong sản xuất nước mắm,

nước tương (Trần Thị Luyến, 1996) đến các nghiên cứu thủy phân protein với mục

tiêu xử lý chất thải hay tạo là công đoạn tiền xử lý nguyên liệu cho các quá trình chế

biến tiếp theo Trần Thanh Nhãn và Trần Nguyễn Tú Oanh (2009) đã nghiên cứu

Các nghiên cứu của của Ngô Thị Hoài Dương et al (2008) hay Nguyễn Văn Thiết

và Đỗ Ngọc Tú (2008) đã cho thấy tầm quan trọng của việc thủy phân đầu tôm

trước khi tiến hành chiết tách, sản xuất chitin, chitosan Trong 2 năm gần đây, các

nghiên cứu thủy phân protein từ các nguồn nguyên liệu thịt và thủy sản khác nhau

tạo nhóm sản phẩm thực phẩm chức năng hay thu hồi protein từ các phụ phẩm

nhằm đáp ứng yêu cầu chế biến thực phẩm đã và đang được quan tâm mạnh mẽ

Trần Thị Hồng Nghi và ctv (2009) đã nghiên cứu tìm điều kiện tốt nhất cho việc

thủy phân protein từ phụ phẩm cá tra (đầu, xương, vây, đuôi, nội tạng và cả mỡ cá)

bằng enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis Sau đó thử nghiệm sản xuất

nước mắm từ nguồn dịch đạm thu hồi được Nguyễn Thị Mỹ Hương (2012) cũng đã

đề xuất các thông số kỹ thuật thích hợp giúp gia tăng hiệu quả thủy phân protein từ

đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex 0,5% là nhiệt độ thủy phân 45°C trong

thời gian 6 giờ với tỉ lệ nước/nguyên liệu là 1: 1, áp dụng điều kiện pH tự nhiên cho

kết quả độ thủy phân và tỉ lệ thu hồi nitơ trong sản phẩm thủy phân tăng lên cùng

với sự tăng thời gian thủy phân Lý Thị Minh Phương (2013) cũng đã vừa công bố

khả năng sản xuất dịch chiết protein từ thịt hàu do tác động của việc bổ sung

enzyme ngoại bào

Ở ngoài nước, các nghiên cứu thủy phân protein đã tiến hành rất sớm Theo Salem

và các cộng sự (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm papain,

trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá

trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark)

Kết quả cho thấy với 0,3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các

enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với

mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30% Nielsen (2001) nghiên cứu thủy phân

protein từ một loại tôm và đề xuất cải tiến phương pháp xác định mức độ thủy phân

protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác Nghiên cứu gần đây của

Randriamahatody et al (2011) còn xác định chi tiết có 14 – 15 acid amin được tìm

thấy khi thủy phân protein từ đầu tôm bởi enzyme protease có tính kiềm hoặc acid

Nhìn chung, các nghiên cứu thủy phân protein bằng phương pháp enzyme dựa trên

việc bổ sung enzyme ngoại bào là chủ yếu Mặc dù vậy, một số các nghiên cứu gần

đây cũng đã chứng tỏ khả năng sử dụng protease nội sinh có trong các phụ phẩm

như nội tạng hay đầu tôm để thủy phân protease Stein (2004) sử dụng protease nội

sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại Tây Dương cho hiệu suất thủy phân khá cao

Lượng protein thủy phân thu được (120 ± 0,4 g) so với 1 kg đầu tôm (9% w/v)

Điều kiện thủy phân 40°C, 2 giờ, tỷ lệ nước khi nghiền 1: 1 (Thiago et al., 2012)

sử dụng tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1: 1 (Thiago et al., 2012; Nguyễn Thị Mỹ

Hương, 2012) Ngoài ra, một số các yếu tố thủy phân thường được quan tâm là pH,

nhiệt độ giúp thúc đẩy hoạt động của protease, tăng hiệu quả quá trình thủy phân

protein (Thiago et al., 2012; Đỗ Thị Minh Phương, 2013), thời gian thủy phân phù

hợp để tạo dịch protein có khả năng ứng dụng trong thực phẩm hay các mục đích

khác đã được quan tâm Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2008) đề xuất thời gian

thủy phân là 24 ÷ 26 giờ để giúp loại bỏ hoàn toàn protein có trong đầu tôm, giúp

tăng hiệu quả xử lý vỏ tôm và thu nhận chitin, Trần Thị Hồng Nghi và ctv (2009)

lựa chọn thời gian thủy phân phụ phẩm cá tra là 18 giờ Trong khi đó, Đỗ Thị Minh

Phương (2013) xác định thời gian thủy phân thịt hàu thích hợp là 8 giờ; Đỗ Thị Mỹ

Hương (2012) đề xuất thời gian thủy phân protein đầu cá ngừ vây vàng là 6 giờ, đặc

biệt Thiago et al., 2012 chỉ áp dụng chế độ thủy phân 2 giờ ở nhiệt đô 40°C cho

việc thủy phân đầu tôm

Trên cơ sở đó, việc nghiên cứu thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú với nhu cầu sử

dụng trong thực phẩm được thực hiện với bước đầu tiên là sử dụng protease nội sinh

có trong thịt đầu tôm Chính vì vậy, các giải pháp giúp gia tăng hiệu quả hoạt động

của protease nội sinh có trong thịt đầu tôm, thúc đẩy quá trình thủy phân protein từ

nguồn nguyên liệu này đã được quan tâm khảo sát

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM

3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm

Địa điểm: Thực hiện bố trí thí nghiệm, đo đạc kết quả, xử lý số liệu tại phòng thí

nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng,

Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 05/8/2013 đến 15/11/2013

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm

 Cân điện tử Vibra, model DJ-1000TW, độ chính xác 0,01 g, Nhật

 Cân điện tử Ohaus, model AR-240, độ chính xác 0,0001 g, Nhật

 Máy ly tâm, model 800 Electronic Centrifuge, Trung Quốc

 Nhiệt kế HANNA, model S42866, độ chính xác 0,1, Ý

 pH kế HANNA, model TOA pH meter HM-12P, độ chính xác 0,01, Ý

 Tủ đông Acson International, model Acson R134a, nhiệt độ cấp đông -25°C,

Nhật

 Máy khuấy từ Toshiba (Magnestir MG-10, Nhật)

 Bộ điều nhiệt (Memmert, Đức, điều chỉnh đến cận 100°C, độ chính xác 0,1°C)

 Máy xay sinh tố Big Sar Model PP179, 3 tốc độ, từ 2000 vòng/phút (rpm) đến

4000 rpm

 Máy quang phổ so màu (Model 722, Trung Quốc)

 Một số dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm và một số dụng cụ khác có liên

quan

3.1.3 Hóa chất sử dụng

 Acid citric, (Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%)

 Trisodium citrate, (Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%)

 Sodium chloride (NaCl), (Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%)



 Disodium hydrogen photphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O), (Trung

Quốc, độ tinh khiết 99%)

 Glycine, (Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%)

 Sodium hrydoxit, (Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%)

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Đầu tôm được lấy từ huyện Thới Bình, tỉnh Cà Mau, bao gói và bảo quản trong

thùng xốp bằng nước đá (nhiệt độ gần 0C), sau đó đem về phòng thí nghiệm bộ

môn Công nghệ thực phẩm, Đại học Cần Thơ Thời gian vận chuyển tối đa là 5 giờ

Nguyên liệu sau khi lấy về đến phòng thí nghiệm tiến hành xử lí sơ bộ, để ráo nước

phân chia thành các mẫu có khối lượng xác định (khối lượng mẫu sử dụng cho một

đơn vị thí nghiệm – 200 g/mẫu), bao gói trong bao bì PA và trữ đông ở 18 ± 2C

3.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả

Bảng 3.1 Phương pháp và thiết bị sử dụng để phân tích các chỉ tiêu

Chỉ tiêu Phương pháp

Đạm tổng số Xác định bằng phương pháp Kjedahl, TCVN 8125:2009

Hàm lượng protein hòa tan Xác định bằng phương pháp Biuret, TCVN 8125:2009

Độ ẩm Xác định bằng phương pháp NMKL số 23-1991

pH Sử dụng pH kế, theo ISO 2917:1999(E)

Hiệu suất thủy phân Xác định bằng phương pháp Adler – Nissen, 1986

3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Kết quả của thí nghiệm

trước được sử dụng làm thông số cố định cho thí nghiệm kế tiếp

Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centrution

16.1, phần mềm Excel Phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD để kết

luận về sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức Sử dụng quy hoạch thực

nghiệm theo phương pháp đa nhân tố để thiết lập phương trình hồi quy thể hiện sự

tương quan giữa nhiệt độ và thời gian tiền xử lý thịt đầu tôm thích hợp

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Nguyên liệu – thịt đầu tôm sú

Xác định hiệu suất thủy phân

Thời gian bảo quản

3.3.2 Xác định thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú

Mục đích: Xác định thành phần hóa lý của thịt đầu tôm sú ban đầu, làm cơ sở cho

việc chuẩn bị nguồn nguyên liệu đồng đều đối với các khảo sát hiệu quả thủy phân

protein tiếp theo

Cách tiến hành:

- Tiến hành lấy mẫu ở nhiều đợt khác nhau (5 đợt mẫu, 5 kg/đợt)

- Mẫu sau khi được xử lý sơ bộ, để ráo nước được sử dụng để phân tích thành phần

hóa lý ban đầu

- Lấy mẫu ở ít nhất 5 vị trí khác nhau trên khối nguyên liệu cho một lần khảo sát

- Kiểm tra độ ẩm, protein, pH có trong mẫu

Kết quả thu nhận: Đánh giá đặc điểm, thành phần của nguồn nguyên liệu thịt đầu

tôm sú

3.3.3 Thí nghiệm 1: Xác định thời gian thủy phân thích hợp đến đặc tính cảm

quan dịch thủy phân và hiệu suất thủy phân protein

Mục đích: Tìm ra thời gian thủy phân thích hợp nhất giúp hiệu suất thủy phân

protein từ thịt đầu tôm cao và dịch thủy phân không có mùi lạ

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố

Nhân tố A: Thời gian thủy phân, thay đổi theo 5 mức độ

A3: 7 giờ

Cố định tỉ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi (w/v) và nhiệt độ thủy phân trong

dung môi (nước cất) lần lượt 1: 1 và 30 ± 2C (nhiệt độ phòng)

Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày ở hình 3.2

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1

Ứng với mỗi nghiệm thức thời gian là một mẫu thử, lặp lại 3 lần

Số nghiệm thức: 5 nghiệm thức

Số mẫu thí nghiệm: 5 nghiệm thức x 3 = 15 mẫu

Khối lượng mẫu cho một lần khảo sát: 200 g

Tiến hành thí nghiệm: Nguyên liệu đầu tôm sau khi xử lí sơ bộ được nghiền nhỏ với

tỉ lệ khối lượng nguyên liệu/dung môi là 1: 1 Tiến hành thủy phân với nhiệt độ thủy

phân cố định là nhiệt độ phòng (30°C) Ứng với từng mức thời gian thủy phân khảo

sát, tiến hành xác định hiệu suất thủy phân protein do tác động của enzyme protease

nội bào có trong mẫu đầu tôm sau khi xử lí

Chỉ tiêu theo dõi:

- Hiệu suất thủy phân protein (%)

- Hàm lượng đạm hòa tan có trong mẫu khảo sát (mg/100 g)

- Đánh giá cảm quan mùi của dịch thủy phân

Kết quả thu nhận: Xác định thời gian thủy phân thích hợp để giúp quá trình thuỷ

phân protein bằng protease nội bào đạt hiệu quả và dịch thủy phân có giá trị cảm

quan cao (chưa phát sinh mùi thối)

Đầu tôm (Đã nghiền) Thủy phân với các thời gian

Xác định hiệu suất protein thủy phân

Chọn ra thời gian thủy phân tối ưu

3.3.4 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng trữ đông thịt đầu tôm đến sự ổn định

của hiệu quả thủy phân protein bằng protease nội bào

Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của thời gian trữ đông (-18 ± 2C) đến sự ổn định

chất lượng của nguyên liệu, thể hiện qua hiệu suất thủy phân protein

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố.

Nhân tố B: Thời gian bảo quản (ở nhiệt độ -18 ± 2C), thay đổi với 8 mức thời gian

Mẫu chuẩn đối chứng là mẫu không bảo quản (mẫu vừa xử lý xong): B0

Ứng với mỗi nghiệm thức thời gian là một mẫu thử, lặp lại 3 lần

Số nghiệm thức: 1  8  8 nghiệm thức + 1 mẫu đối chứng

Số mẫu thí nghiệm: (8 nghiệm thức + 1 mẫu đối chứng) x 3 = 27 mẫu

Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện tương tự như thí nghiệm 1, tuy

nhiên thời gian thuỷ phân dựa vào kết quả của thí nghiệm 1 và nhiệt độ thủy phân

vẫn cố định là nhiệt độ phòng (30°C) với dung môi sử dụng là nước cất (tỉ lệ

nguyên liệu và dung môi 1: 1, w/v, g/mL)

Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất thủy phân protein và hàm lượng đạm hòa tan có trong

mẫu khảo sát

Kết quả thu nhận: Sự ổn định chất lượng của nguyên liệu đầu tôm theo thời gian trữ

đông

3.3.5 Thí nghiệm 3: Tác động của điều kiện tiền xử lý giúp kích hoạt protease

nội bào đến hiệu suất thủy phân protein từ thịt đầu tôm

Mục đích: Xác định được điều kiện tiền xử lý thích hợp nhất giúp cải thiện hiệu suất

thủy phân protein từ thịt đầu tôm

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố

Nhân tố C: Nhiệt độ tiền xử lý thịt đầu tôm (C), thay đổi với 6 mức độ