Nghiên cứu khả năng thủy phân protein của alpha chymotrypsin và papain khi bị viêm

BỘ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ợ c HÀ NỘI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG THUỶ PHÂN PROTEIN CỦA a-CHYMOTRYPSIN VÀ PAPAIN KHI BỊ VIÊM KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ợ c s ĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 1995-2000 Người thực : Sinh viên Lê Thị Diễm Hồng Người hướng dẫn : PGS TS iNguyễn Xuân Thắng Nơi thực : Bộ môn hoá sinh-Vi sinh Thòi gian thực hiện: 6/03 đến 23/05/2000 HÀ NỘI, 5-2000 ĩ n i LƠ I CAM- Ơ9Í Em xin bàv tỏ ỉòng biết ơn chân ửiầnh, lờ i cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Xuân Thắng, người ửiầv n h iệt tình hướng dẫn h ế t lòng giúp đỡ em hoàn thành bẩn khoầ luận nầỵ ẼĨĨ1 xừl thành cẩm ơn cha mẹ, thây giáo, cô giáo trưởng đại học Dược Hà N ộ i đặc biệt cấc thầỵ giáo, cô giảo, cô k ỹ thuật viên Bộ môn Hoá Sinh - Vi sinh động viên, giúp đỡ em n h iệt tình suốt thời gian học tập thưc đ ề tài Hà Nội, ửiáng năm 2000 Sinâ viên Lê Tili (Diêm J-Cồng MỤC LỤC Mục lụ c Chú giải chữ viết tá t Phần I: Đặt vấn đề Phần II: Tổng quan Tổng quan lý thuyết viêm Các mô hình nghiên cứu gây viêm thực nghiệm 10 Tổng quan enzym chống viêm 11 Phần III: Kết thực nghiệm 14 Nguyên vật liệu phương pháp thực nghiệm 14 Kết thực nghiệm nhận xét .17 Bàn luận 32 Phần IV: Kết luận đề xuất 35 A Kết luận 35 B Đề xuất 36 Tài liệu tham khảo 37 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT Ịrr Immunoglobulin Globulin miễn dịch IL Interleukin INF Interferon NSAID Non-steroid anti-inflammatory drug Thuốc chống viêm phisteroid PAF Platelet activating factor Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỂ Viêm trình bệnh lý phố biến, gặp nhiều bệnh, nhiều nguyên nhân gây Nhìn chung, viêm phản ứng bảo vệ thể, giúp thể chống lại tác nhân gây viêm Nhưng viêm nặng kéo dài dẫn đến rối loạn chức quan phận thể, gâv nhiều ảnh hưởng xấu cho thể gây nguy hại tới tính mạng người bệnh Để đáp ứng yêu cầu đó, ngưòd ta nghiên cứu nhiều loại thuốc chống viêm thuốc chống viêm Steroid, thuốc chống viêm phi Steroid (NSAID) Bên cạnh tác dụng tốt, chúng chứa đựng yếu tố bất lợi thể gây suy giảm miễn dịch, xốp xương, loãng xương, kích ứng đường tiêu hoá, Chính vậv, thuốc chống viêm có chứa enzym protease (papain, a-chymotrypsin) chế tạo từ chất gần gũi với thể người nghiên cứu Các enzym protease có vai trò quan trọng điều trị kích thích tiêu hoá, chống viêm Trước đây, Việt Nam có nhiều côns trình nghiên cứu protease chủ yếu để ứng dụng chúng phònơ chốns suy dinh dưỡng trẻ em mà chưa quan tâm tìm hiểu tác dụng chống viêm chế chống viêm chúng Do đó, chúns tiến hành đề tài: ”Nghiên cứu khả thuỷ phân Protein a - Chymotrypsin papain khỉ bị viêm” Đê tài nhằm sô mục tiêu sau đây: Nghiên cứu khả nãns phân huv protein nhữns trạng thái biến tính khác a-chymotrypsin papain Góp phần tìm hiểu chế chống viêm papain achvmotrypsin Tìm hiểu chế tác dụng chât sây viêm in vivo chế chống viêm in viĩro PHẦN II: TỔNG QUAN Tổng quan lý thuyết viêm: Theo Ado (1973), viêm phản ứng chỗ mạch máu tổ chức liên kết hệ thần kinh nhân tố gây bệnh mối liên hệ tính phản ứng thể Theo Vũ Triệu An, viêm phản ứng bảo vệ thể mà tảng phản ứng tế bào, phản ứng hình thành phát triển phức tạp dần trình tiến hoá sinh vật [4] Trong từ điển Bách Khoa Dược học định nghĩa: Viêm phản ứng chỗ thể, mô bị kích thích bị thương tổn Đó phản ứng phức tạp mô liên kết mần hoàn mao mạch nơi bị tác động, biểu triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau rối loại chức phận [12] 1.1 Nguyên nhân gây viêm: [4], [8] Có nhiều nguyên nhân gây viêm, chia thành hai nhóm sau: 1.1.1 Nguyên nhân bên ngoài: - Sinh vật: Do nhiễm vi khuẩn, virus, ký sinh trùng - Vật lý: Cơ học (đụng đập, chấn thương), nhiệt (bỏng nóng bỏng lạnh), xạ ion - Hoá học: Các chất hoà tan gây hoại tử tế bào dung dịch hoá chất (acid, kiềm, muối, ) chất đặc gây thực bào bạch cầu 1.1.2 Nguyên nhân bên trong: Các nguyên nhân bên gập hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng (viêm tắc động mạch), phản ứng kháng nguyên kháng thể Tuy nhiên, khó phân biệt rõ ràng hai loại nguyên nhân gây viêm thực tế, nguyên nhân bên thường kèm theo biến đổi thể từ tạo nguyên nhân bên 1.2 Những phản ứng ổ viêm: Tại ổ viêm có hai loại phản ứng xảy ra: [4], [8] 1.2.1 Phản ứng tuần hoàn: Phản ứng xảy sớm sau tổn thương phát triển mức độ khác nhau, phụ thuộc vào trầm trọng tổn thương mô theo trình tự sau: 1.2.1.1 Co mạch chớp nhoáng tiểu động mạch xảy có tác nhân kích thích, hưng phấn thần kinh co mạch tron bị kích thích 1.2.1.2 Xung huyết động mạch, giãn tiểu động mạch, mao mạch tiểu tĩnh mạch: Sau co mạch chớp nhoáng tiểu động mạch tượng giãn mạch Đầu tiên giãn tiểu động mạch mao mạch tiểu tĩnh mạch dẫn đến tăng tuần hoàn chỗ nhằm cung cấp lượng cho hoạt động ổ viêm (gây nóng đỏ) đưa nhiều bạch cầu tới ổ viêm làm nhiệm vụ bảo vệ Nguyên nhân tượng giãn mạch ba yếu tố chính: a Hưng phấn thần kinh giãn mạch vùng động mạch tiểu động mạch b Do tác động yếu tố thể dịch có mặt ổ viêm histamin, bradykinin, leucotrien gây co tế bào nội mô; cytokin (IL-1, TNF, INF-y ) gây nên tái tổ chức cấu trúc xương tế bào, dẫn đến hình thành vùng nối gian bào rộng, lỗ hổng tế bào c Các sợi liên kết vùng mao mạch tiểu động mạch bị tổn thương, làm giảm trương lực thành mạch, gây giãn mạch 1.2.1.3 Phản ứng tuần hoàn mạnh dẫn tới rối loạn nghiêm trọng giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chậm dần, gây tăng tính thấm thành mạch làm thoát dịch rỉ viêm giàu protein vào mô quanh huyết quản Do chèn ép dịch ri viêm số yếu tố mạch máu liệt thần kinh vận mạch, tế bào nội mạc sưng to, tăng độ nhót cửa máu gây ứ máu làm tuần hoàn từ động mạch sang tĩnh mạch, thiếu ôxy, gây rối loạn chuvển hoá nghiêm trọng, tổn thương tổ chức viêm phát triển toàn diện (biểu lâm sàng phù đau) 1.2.2 Phản ứng tế bào: Đây phản ứng phản ánh khả bảo vệ thể chống viêm phản ứng này, bạch cầu đóng vai trò quan trọng Do tốc tộ tuần hoàn chậm lại, bạch hầu, chủ vếu bạch cầu đa nhân trung tính dạt vào thành mạch, bám vào nội mô dừng lại điểm, gọi vách tụ cầu Dưới tác dụng chất trang gian hoá học IL-l, TNF nội độc tố, bạch cầu tế bào nội mô bộc lộ hai loại phân tử dính bề mặt selectin, integrin Nhờ đó, khả dính bạch cầu với tê bào nội mô tăng lên rõ rệt Sau dính vào tế bào nội mô, bạch cầu chuyển động nhẹ dọc theo bề mặt nội mô, luồn chân giả vào kẽ hở tế bào nội mô ơiúng xuyên qua vùng nối dãn rộng tế bào nội mô để xen vào tế bào nội mô màng đáy, từ vào khoảng gian bào mao mạch Hiện tượng bạch cẩu vận động hướng tới ổ viêm coi tượng hoá ứng động bạch cầu Tác dụng ổ viêm có số chất có tác dụng gây hoá ứng động: sản phẩm vi khuẩn (các peptid có acid amin tận Nformyl-methionin), thành phần hệ thống bổ thể bị hoạt hoá (C3a, C5a, C5b,6,7), sản phẩm chuyển hoá acid arachidonic theo đường lipoxygenase hoá (đặc biệt Ịeucotnen B4), cytokin, mảnh vụn sợi tạo keo sản phẩm phân huỷ tế bào tơ huyết sán phám phân huv tơ huyết [8] Tại ổ viêm, bạch cầu hoạt hoá hoạt hoá, khả thực bào chúng tăng lên rõ rệt Quá trình thực bào diễn sau: đầu bạch cầu tiếp cận vói đối tượng thực bào, bao vây nuốt đối tượng thực bào bao gồm tất vi khuẩn mảnh tế bào bị phân huỷ ổ viêm Khi bị thực bào, nghĩa đối tượng lọt vào thực bào xảy năm khả năng: [4] + Đối tượng thực bào bị tiêu nhờ vai trò lisosom: Khi vi khuẩn bị thực bào, chúng tập trung khôns bào gắn với màng bào tương tạo thành thể phagosom, phagosom liên kết với ĩysosom thành phaaolvsomo chứa nhiều hydrolase acid: men đóng vai trò phân tiuv vi trùng thời tiêu huỷ tế bào thực bào + Đối tượng thực bào không bị tiêu huỷ, mà tồn lâu tế bào bụi than thực bào phổi (gây bệnh bụi than) + Đối tượng thực bào không bị tiêu huỷ theo thực bào nơi khác gây ổ viêm (như bệnh lao mãn tính) + Đối tượng thưc bào bi nhả mà đại thực bào không chết • o + Đối tượng thực bào làm chết thực bào vi trùng lao, hay liên cầu khuẩn 1.3 Các chất trung gian hoá học tham gia vào trình viêm: Trong phản ứng viêm có tham gia nhiều chất trung gian hoá học Các chất giải phóng có tác động ban đầu viêm suốt trình viêm, trì khuếch đại phản ứng viêm Các chất trung gian hoá học gổm có: 1.3.1 Các protein huyết tương: [8] - Hệ thống bổ thể, đáng ý thành phần C3a C5a làm tăng tính thấm thành mạch gây giãn mạch, chủ yếu giải phóng histamin từ dưỡng bào C5a hoạt hoá đường chuyển hoá lipoxygenase acid arachiđonic bạch cầu đa nhân trung tính bạch cầu đơn nhân, gây giải phóng tiếp chất trung gian hoá học viêm C5a tác nhân hoá ứng động mạch vđi bạch cầu - Bradykinin, chất gây giãn mạch tăng tính thấm thành mạch giải phóng từ 0C2- globulin hệ thống kinin bị hoạt hoá tác dụng yếu tố Hageman (yếu tố x n đường đông máu nội sinh) - Hệ thống đông tiêu tơ huyết: Hệ thống đông máu ỉoạt protein huyết tương bị hoạt hoá yếu tố Hageman Bưđc cuối trình chuyển fibrinogen thành fibrin tác động thrombin Trong trình biến đổi này, fibrinopeptid hình thành, sây tăng tính thấm mao mạch có hoạt tính hoá ứng động với bạch cầu 1.3.2 Các amỉn hoạt mạch: [8] - Histamin: hình thành sẵn có hạt giải phóng hạt dưỡng bào đáp ứng vói kích thích: tổn thương vật lý (chấn thương, bỏng), phản ứng miễn dịch làm gắn kháng thể với dưỡng bào, đoạn bổ thể gọi độc tố gây phản vệ (C3a C5a), protein giải phóng histamin xuất phát từ bạch cầu, neuropeptid, cytokin (IL-1, IL-8) Histamin gây giãn tiểu động mạch tăng tính thấm thành mạch tiểu tĩnh mạch - Serotonin: có tác động tương tự Histamin, giải phóng từ tiểu cầu bị kích thích chúng kết dính sau tiếp xúc vói sợi tạo keo, ADP, phức hợp nguyên kháng - kháng thể, yếu tố hoat hoá tiểu cáu Kết thể bảng Báng 7; Ảnh hưởng nhiệt độ gây biến tính chất lòng tráng trúng đối vói khả thuỷ phân Papain Ị Ghi chú: % protein b| thu ỷ Ị)hàn 50 1,96 70 10,8 87 25,2 100 54,2 ị Kết trung bình lần thí nghiệm; Papain sử dụng có hàm lượng lOmg Nhận xét: Qua bảng cho thấv: Trong thời gian, nhiệt độ gâv biến tính cao, khả thuv phân protein lòng trắng trúĩig biến tính Papain lớn nhiệt độ 50°c, Protein bị biến tính không đáng kể bị thủy phân 1,96% Ở nhiệt độ 100°c, protein bị biến tính nhiều bị thủy phân 54,2% 2.2.1.2 Anh hưởng nồng độ acid gây biến tính chất lòng; trắng trứng khả thuỷ phân papain: Với mục đích tìm hiểu ảnh hưởng nồng độ acid gây biến tính chất lòng trắng trứng khả thuỷ phân Papain Chúng tiến hành thí nghiệm: gây biến tính chất lòng trắns trứng acid HC1 15% để đạt nồng độ gây biến tính 5% thời gian 10 phút, 20 phút, 40 phút, 60 phút Sau xác định khả thuỷ phân protein lòng trắng trứng biến tính Papain Kết thu thể Bảng 24 lĩán« 8: Ảnh hưởng nồng độ add gây biến tính chất lòng trắng trứng đối vói khả thuỷ phân Papain Thòi gian gây biến tính (phút) % Protein bị thuỷ phán 10 3,1 Ị 20 8,2 j ị 40 14,7 60 33,9 Ghi chú: Kết trung bình ba lần thí nghiệm; Papain sử dụng có hàm lượng 10 mg Từ kết cho thấy: Thời gian gây biến tính lâu, khả thuỷ phân protein Papain tăng, thời gian 10 phút, khả thuỷ phân protein Papain thấp 3,1% thời gian 60 phút, khả thuv phân protein Papain cao 33,9% 2.2.1.3 Anh hưởng nồng độ kiềm gày biến tính chất lòng trắng trứng ctốivới khả thuỷ phân Papain Gây biến tính chất lòng trắng trứng dung dịch NaOH 30% để đạt nồng độ gây biến tính 5% thời gian 10 phút, 20 phút, 40 phút, 60 phút Sau xác đinh khả thuỷ phân protein Papain chất lòng trắng trứng biến tính Kết thu thể bảng Bảng 9: Ảnh hưởng nồng độ kiềm gây biến tính chất lòng trắng trứng khả thuỷ phân % protein bi thuỷ phản ^9 20 15,5 40 26,1 60 43,0 Thời gian gây bỉến tính (phút) .10 Ghi chú: Kết trung bình lần thí nghiệm; Papain sử dụng có hàm lượng 10 mg Nhận xét: Qua bảng cho thấy: Yới nồng độ gây tác động thời gian biến tính nhau, chất lòng trắng trứng bị biến tính kiềm mạnh bằns acid Khi thời gian biến tính lâu, khả thuỷ phân protein Papain tăng Ớ thời gian 10 phút, protein bị thuỷ phân thấp 5.2% Ở thời gian 60 phút, protein bị thuỷ phân cao 43,0% 2.2.2 Cơ chất thử lọn: 2.2.2.1 Anh hườns nhiệt độ gây biến tính châ't thịt lợn khả thuỷ phân protein Papain Tiến hành khảo sát khả thuỷ phân protein Papain chất thịt lọn biến tính nhiệt độ 50°c, 70°c, 87°c thời gian 10 phút Kết thu thẻ bảng 10 Bảng 10: Anh hưởng nhiệt độ gây biến tính chất thịt lọn đối vói khả thuỷ phản Papain Nhỉệt độ gây biến tính (t0€ ) % protein bị thuỷ phân 50 6,5 70 22,1 87 25,2 Ghi : Kết trung bình ba lần thí nghiệm; Papain sử dụng có hàm lượng 10 mg Từ kết cho thấy: Nhiệt độ gây biến tính cao, khả thuỷ phân protein thịt lợn biến tính papain lớn Ở nhiệt độ 50°c, khả thuỷ phân protein papain thấp 6,5% Ở Nhiệt độ 87°c, khả riăng thuỷ phân protein Papain cao 25,2% 26 2.2.2.2 Anh hưởng nồng độ acid gây biến tính chất thự lợn khả năn thuỷ phân Papain Gây biến tính chất thịt lợn acid HC1 15% để đạt nồng độ gây biến tính 5% thời gian thav đổi 10 phút, 20 phút, 40 phứt, 60 phút Sau xác định khả thuỷ phân protein thịt lợn biến tính Papain Kết thu thể ỏ' bảng 11 Bảng 11: Ảnh hưởng nồng độ acid gây biến tính chất thịt lợn khả thuỷ phân Papain Thời gian gáy biến tinh (phút) ị Ghi chú: ĩ % protein bị thuỷ phân 10 16,2 20 18,5 40 21,8 60 27,9 Kết trung bình ba lần thí nghiệm; Papain sử dụng có hàm lượng 10 mg Qua bảna cho thấy: Thời gian gây biến tính lâu, khả thuỷ phân protein papain tăng Ớ thời gian 10 phút, khả thuỷ phân protein papain thấp 16,2% Ớ thòi gian 60 phứt, khả thuỷ phân protein papain cao 27,9% 2.2.2.3 Anh hưởng nồng độ kiềm gâv biến tính chất thịt lợn khả thuỷ phân papain Sử dụng dung dịch NaOH 30% để đạt nồng độ gây biến tính chất thịt lợn 5% thời gian 10 phút, 20 phút, 40 phút, 60 phút Sau xác định khả năn2 thuỷ phân protein thịt lợn biến tính Papain cùrig điều kiện Kết thu thể bảng 12 27 Bảng 12: Ảnh hưởng nồng độ kiểm gây biến tính chất thịt ỉợn đối vói khả thuỷ phân Papain Thời gian gây biến tíiili (phút) % proteỉu bi thuỷ phân Ỉ0 23,7 ỉ Ghi chú: 20 29,6 40 37,2 60 42,2 Kết ỉà trung bình ba lần thí nghiệm; Papain sử dụng có hàm lượng 10 mg Từ kết cho thấv: Cơ chất thịt lợn bị biến tính bằng; kiềm mạnh acid với nồng độ gây biến tính thời gian biến tính Thời gian gây biến tính lâu, khả thuỷ phân protein papain tăng thòi gian 10 phút, khả năns thuv phân protein papain thấp 23,7% thời gian 60 phút, khả thuỷ phân protein papain cao 42,2% 2.3 Khả tiêu protein a - Chymotrypsin kết hợp vói serin: Chúng ta biết Chymotrypsin thuộc loại Serin-protease Để nghiên cứu ảnh hưởng Serin khả thuỷ phân protein a chymotrvpsin, thí nghiệm tiến hành xác đinh khả thuỷ phân protein a - Chymotrypsin đơn độc có mặt serin nồng độ khác nhau: 0,6%, 1,25%, 2,5%, 5% điều kiện nhiệt độ 40°c thời gian 30 phút Kết thu thể bản? 13 28 Báng 13: Ảnh hưởng serin khả thuỷ phân protein a- Chymotrypsin j % protein bi thuyphaa ™j (X - Chymotrypsin 17,7 a - chvmotrypsin+Serin 0,6% 23,4 ! I a - Chymotrypsin +Serin 1,25% 22,2 a - Chymotrypsin + Serin 2,5% 28,5 a - Chymotrypsin + Serin 5% 33,8 Ghi chủ: Kết trung bình lần thí nghiệm; oc - Chymotrypsin sử dụng có hàm lượng img Kết biểu diễn dạng đồ thị sau: % protein bị thuỷ phân Hình 2: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng serin khả thuỷ phân protein a - Chymotrypsin Nhận xét: Khi kết hợp với serin, phần trăm tiêu protein ccchymotrypsin tăn2 lên Vì vậy, serin chất hoạt hoá a - chvmotrypsin 29 2.4 Khả tiêu protein chuột gây viêm thực nghiệm: 2.4.1 Đối với a - Chymotrypsin: Chọn chuột nhắt trắng chủng giống Swiss, tiêm vào bên đùi 0,05 ml dung dịch Formol 2%, hỗn dịch Kaolin 10% dung dịch Dextran 6% để gây viêm, đùi bên không tiêm để đối chứng Sau tiêm ngày, xác định khả thuỷ phân protein a - Chymotrypsin chất thịt chuột biến tính điều kiện 40°c 30 phút Kết thu thể bảng 14 Bảng 14: Khả tiêu protein cc - chymotrypsin sau gây viêm chuột % protein bf thuv phân Hoá chất gày viêm Chân chuột gày viêm Chán đĩiiột không gây viêm Formol 26,8 Kaolin 11,4 Dextran 22,9 Ghi chú: ! Kết trung bình hai lần thí nghiệm; a- Chymotrypsin sử dụng có hàm lượng lmg Qua bảng ta thấy: Khả gây viêm hoá chất xếp theo thứ tự tăng dần sau: Kaolin < Dextran < Formol Như vậy, dung dịch Formol gây viêm chuột mạnh nhất, Kaolin gây viêm chuột yếu Khả thuỷ phân protein thịt chuột biến tính Kaolin achymotrypsin thấp 11.4% Khả thuỷ phân protein thịt chuột biến tính Formol a - chymotrypsin cao 26,8% Đối với chân không gây viêm cc - chymotrypsin tác dụng thuỷ phân protein 2.4.2 Đối với Papain: 30 ! Chọn chuột nhắt trắng chủng giống Swiss, tiêm vào đùi 0,05 mỉ dung dịch Formol 2%, hỗn dịch Kaolin 10% duns dịch Dextran 6% để gây viêm, đùi bên không tiêm để đối chứng Sau tiêm ngày, xác đinh khả thuỷ phân protein papain chất thịt chuột biến tính điều kiện: 37°c 30 phủi Kết thu thể bảng 15 Bảng 15: Khả tiêu protein Papain sau gây viêm chuột % protein bi thuỷ phân Hoá chất gây viêm Chân, chuột gâỵ viêm I Chân chuột không gây viêm Formol 15,2 Kaolin 8,7 Dextran 10,6 Ghi chú: Kết trung bình hai lần thí nghiệm; Papain sử dụng có hàm lượng 10 mg Qua bảng ta thấy: Khả gây viêm hoá chất xếp theo thứ tự tăng dần sau: Kaolin < Dextran < Formol Như vậy, dung dịch Formol gâv viêm chuột mạnh nhất, dung dịch Kaolin gây viêm chuột yếu Khả thuỷ phân protein thịt chuột biến tính bỏi Kaolữi Papain thấp 8,7% Khả thuỷ phân protein thịt chuột biến tính bời Formol Papain cao 15,2% Đối với chân không gây viêm Papain tác dụng thuỷ phân protein Từ kết bảng 14 15 ta có biểu đồ: 31 ị ị 30 □ Formol ^ Kaolin n Dextran - a - Chymotrypsin - Papain ^ Các enzym Hình 3: Biểu đồ biểu diễn khả thuỷ phân protein a Chymotrypsin papain sau gây viêm chuột Bàn luận: Cơ chế tác dụna enzym phức tạp, enzym có cách tác dụns xúc tác khác Phần lớn chế hoạt động xúc tác giả định biết nét Ví dụ, chế xúc tác Chymotrypsin đề nshị gồm giai đoạn: Cơ chất tới enzym, chất liên kết với enzym, chất liên kết tách ra, sản phẩm tạo ra, cộng hợp với nước, nước phản ứng với acylenzym, liên kết acyl với enzym bị phá vỡ, sản phẩm thứ hai hình thành [2], [17] Hoạt động xúc tác enzym đặc hiệu phụ thuộc vào chất công nhận nhiều năm Thế nhưns chưa thấy tài liệu công bố tác dụng trạng thái chất ảnh hưởng đến mức độ xúc tác a - Chymotrypsin Papain Qua trình thực nghiệm, kết thu cho thây, xức tác thuỷ phân protein Chymotrypsin Papain phụ thuộc nhiều vào trạng chất Nếu chất Drotein trạng thái tự nhiên nguyên vẹn nghía si; xắp xếp vững bền cấu trúc không gian từ bậc trở lên ổn định liên kết hydro siữa chuỗi peptid làm cho xúc tác thuỷ phân peotid nàv khó khăn Điều việc đưa chất peptid gắn vào enzym khó khăn holl dẫn đến kết chvmotrypsin Papam kliông có tác dụng xúc tác phân huỷ chất peptid dạng không bị biến tính Khi chất protein (lòng trắng trứng, protein thịt) bị biến tính nhiệt, acid hay kiềm làm cho xúc tác a - Chymotrypsin Papain hoạt động tốt mức thuỷ phân protein cao Gây biến tính protein nhiệt, acid, kiềm phá hủy tác dụng sinh học protein cấu trúc không gian bị đảo lộn liên kết hydro Nhiệt phá huỷ cấu trúc protein trcng vòng vài phút nhiệí độ quanh 80°c Acid, kiềm phá huỷ cấu trúc thay đổi trạng thái protein Trong acid mạnh, protein điện âm Trong kiềm mạnh, protein điện đương Những kết thu chứng minh rằng: Sự xúc tác thuỷ Dhàn a Chymotrypsin Papain phụ thuộc nhiều vào trạng thái chất Điều giả đinh giải thích chất bị biến tính, gia nhập protein vào trung tâm hoạt động a - Chymotrypsin Papain dễ dàng Mức độ biến tính nhiều xúc tác thuỷ phân chất protein cans mạnh Tác dụng xúc tác thuỷ phân protein a - Chymotrypsin papain không in vitro mà in vivo tương tự Tất kết thu cho thấy, hoá chất gây biến tính protein chuột thực nghiệm Formol, Dextran, Kaolin làm tăng tác dụng xúc tác thuỷ phân protein nơi có tièm hoá chất gây viêm thực nghiệm Như vậy, tác dụng chống viêm a - Chymotrypsin Papain làm tiêu protein lạ tác nhân gây viêm tạo thực nghiệm chuột, a - Chymotrypsin Papain tác dụng loại protein nguyên dạng albumin bò, albumin huvết thanh, lòng trắng trứng sống, thịt sống Kết phù hợp với thực nghiệm Vũ Hòng Anh [1] Khi dùng Papain bôi vào vết viêm cách gây bỏng, không ỉàm tổn hại tổ chức non xơ phát triển Những kết nhỏ bé bước đầu tìm hiểu thêm chế tác dụng a - Chymotrypsin Papain 3ự thuỷ phân proiein liên quan đến trình chống viêm enzvm nghiên cứu thục nghiệm 34 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT A Kết ỉuận: Sau thời gian thực nghiệm, rút số kết luận sau: a - Chymotrypsin, Papain có tác dụng thuỷ phân protein thịt lợn biến tính, protein lòng trắng trứng biến tính nhiệt độ, acid, kiềm, a Chymotrypsin có tác dụng thuỷ phân protein thịt lợn biến tính tốt Papain Hai enzym tác dụng thuỷ phân chất protein không biến tính a - Chymotrypsin, Papain có tác dụng thuỷ phân protein thịt lợn biến tính, protein lòng trắng trứng biến tính kiềm mạnh protein thịt lợn protein lòng trắng trứng biến tính acid Thời gian gây biến tính ảnh hưởng đến khả thuỷ phân protein a - Chymotrypsin Papain Thời gian gây biến tính lâu, khả thuỷ phân protein a - Chymotrypsin Papain tốt a - Chymotrypsin có tác dụng thuỷ phân protein thịt lợn biến tính nhiệt độ 50°c thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút tốt Papairi Khi kết hợp serin với cc - Chymotrypsin, khả thuỷ phân protein a Chymotrypsin tăng lên a - Chymotrypsin, Papain có tác dụng thuỷ phân protein chuột gây viêm hoá chất theo thứ tự Kaolin < Dextran < Formol, a Chymotrypsin có tác dụng thuý phân protein chuột gây viêm tốt Papain Do vậy, giải thích tác dụng chống viêm enzym thực nnhiệm súc vật 35 B Đề xuất: Từ kết thu trình thí nghiệm, đưa đề xuất sau: Cơ chế chống viêm phức tạp, kết bước đầu nghiên cứu tác dụng chồng viêm a - Chymotrypsin Papain cho phép giải thích chế chống viêm để hiểu sâu sắc hơn, ứng dụng tốt đề tài nên tìm hiểu nghiên cứu sâu 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Vũ Hổng Anh Góp phần nghiên cứu tác dụng chống viêm chế phẩm chứa Papaỉn Luận văn Thạc sĩ Dược học Năm 1999 Bộ môn Hoá sinh Vi sinh - Trường Đại học dược Hà nội Hoá Sinh I 1996, trang: 36 -59; 96-133 Bộ môn Hoá sinh vi sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội Hoá sinh II 1996, trang: 128- 175 Bộ môn sinh lý bệnh - Trường Đại học Y Hà Nội Bài giảng sinh iý bệnh NXB Y học, 1986, trang: 68-76 Tào Duy Cần Tra cứu sử dụng thuốc biệt dược nước ngoài, NXB Khoa học Kỹ thuật, 1999, trans;: 404, 645, 1161, 1391 Nguyễn Hữu Chấn Enzym xúc tác sinh học NXB Y học Hà Nội, 1996, trang: 206-221 Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt nam NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, 1991, trang: 372 - 375 Lê Đình Roanh, Nguyễn Đình Mão Bệnh học vièm bệnh nhiễm khuẩn NXB Y học, 1997, trang: 3-7, 49-102 Đỗ Thị Thanh, Nguyễn Xuân Thắng Papain từ đu đủ - dạng thuốc sirô theo dõi hoạt tính enzym Tạp chí Dược học Số 4/1994, trang 16-17 ] Nguyễn Xuân Thắng Đặc tính Protease thực vật dùng làm thuốc Tạp chí Dược học Số 6/1995, trang: 19 - 21 11 Nguyễn Xuân Thắng Sự ổn định tính chất papain chứa viêm nang theo thời gian bảo quản Tạp chí Dược học Số 7/1997, trang: 12-17 37 12 Từ điên Bách khoa dược học NXB Từ điển Bách khoa, Hà Nội 1999, trang: 138, 472, 473, 630 - 632 13 Vũ Đình Vinh, Đặng Hanh Phúc, Đỗ Đình Hồ Kỹ thuật y sinh hoá trường Đại học Quân y - 1974, trang: 222 - 224 14 Goodman and Gilman's The pharmacological basis of therapy, 9th edition, the McGraw- Hill compaies, Inc, 1996 , p 1637 15 Enzym nomenclature - Printed in the Netherlan 1972, p 238-239; 242 16 Albert Y Leung and Steven Foster Encyclopedia of common natural ỉngedients uses in foods, drugs and cosmetics, 2nd edition, John Wiley & Sons, Inc, 1996, p 402 - 404 17 Albert L.Lehninger, David L Nelson, Michael M Cox Principles of Biochemistry 1993, p 226 18 Marazzi - Uberti - Arch - int Pharmacodyn 1966, p 162, 373 19 Taugri J Phar Pharmacal 1964, p 16 635 20 The United States, pharmacopoeia 22, The National formulary United States pharmacopeial convention Inc 1990, p 307, 308, 1012 38 [...]... bằns acid Khi thời gian biến tính càng lâu, khả năng thuỷ phân protein của Papain càng tăng Ớ thời gian 10 phút, protein bị thuỷ phân thấp nhất là 5.2% Ở thời gian 60 phút, protein bị thuỷ phân cao nhất là 43,0% 2.2.2 Cơ chất thử lọn: 2.2.2.1 Anh hườns của nhiệt độ gây biến tính cơ châ't thịt lợn đối với khả năng thuỷ phân protein của Papain Tiến hành khảo sát khả năng thuỷ phân protein của Papain đối... càng cao, khả năng thuv phân protein lòng trắng trúĩig biến tính của Papain càng lớn ở nhiệt độ 50°c, Protein đã bị biến tính nhưng không đáng kể và bị thủy phân là 1,96% Ở nhiệt độ 100°c, protein bị biến tính nhiều nhất và bị thủy phân là 54,2% 2.2.1.2 Anh hưởng của nồng độ acid gây biến tính cơ chất lòng; trắng trứng đối với khả năng thuỷ phân của papain: Với mục đích tìm hiểu ảnh hưởng của nồng độ... lợn bị biến tính bằng; kiềm mạnh hơn bằng acid với cùng một nồng độ gây biến tính và thời gian biến tính như nhau Thời gian gây biến tính càng lâu, khả năng thuỷ phân protein của papain càng tăng ơ thòi gian 10 phút, khả năns thuv phân protein của papain thấp nhất là 23,7% ở thời gian 60 phút, khả năng thuỷ phân protein của papain cao nhất là 42,2% 2.3 Khả năng tiêu protein của a - Chymotrypsin khi. .. bảna trên cho thấy: Thời gian gây biến tính càng lâu, khả năng thuỷ phân protein của papain càng tăng Ớ thời gian 10 phút, khả năng thuỷ phân protein của papain thấp nhất là 16,2% Ớ thòi gian 60 phứt, khả năng thuỷ phân protein của papain cao nhất là 27,9% 2.2.2.3 Anh hưởng của nồng độ kiềm gâv biến tính cơ chất thịt lợn đối với khả năng thuỷ phân của papain Sử dụng dung dịch NaOH 30% để đạt nồng độ gây... hưởng của nhiệt độ thay đổi theo thời gian gây biến tính cơ chất thịt lợn đối với khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin và papain Tiến hành khảo sát khả năng thuỷ phân protein của cc - Chymotrypsin và papain đối với cơ chất thịt lợn biến tính ở nhiệt độ 50°c trong thời dan khác nhau: 10 phút, 20 phút, 30 phút Từ đó so sánh khả năng tiêu protein thịt lợn biến tính giữa oc - Chymotrypsin và papain. .. thuỷ phân — Papain -8—oc -Chymotrypsin Hình 1: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ thay đổi theo thời gian gây biến tính cơ chất thịt lợn đối với khả năng thuỷ phân của a Chymotrypsin và papaỉn Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy: Khả năng thuv phân protein thịt lợn biến tính của a - chvmotrypsin tốt hơn papain Thời gian 2;âv biến rinh càng 21 lâu, khả năng thủv phân của a - Chymotrypsin và papain. .. nhiều thì khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin càng tăng, ở thời gian 10 phút, khả năng thuỷ phân protein lòng trắng trứng biến tính của a - Chymotrypsin thấp nhất là 24,8% ơ thời gian 60 phút, khả năng thuỷ phân protein lòng trắng trứng biến tính của GC - Chymotrypsin cao nhất là 37,1% 2.ỉ 1.3 Anh hưởng của nồng độ kiểm gây biến tính cơ chất lòng trăn2 trứng đối với khả năng thuỷ phàn của a - Chymotrypsin. .. trứng đối vói khả năng thuỷ phân của Papain Thòi gian gây biến tính (phút) % Protein bị thuỷ phán 10 3,1 1 Ị 20 8,2 j ị 40 14,7 1 60 33,9 1 Ghi chú: Kết quả trên là trung bình của ba lần thí nghiệm; Papain sử dụng có hàm lượng 10 mg Từ kết quả trên cho thấy: Thời gian gây biến tính càng lâu, khả năng thuỷ phân protein của Papain càng tăng, ơ thời gian 10 phút, khả năng thuỷ phân protein của Papain thấp... tính càng cao, khả năng thuỷ phân protein lòng trắng trứng biến tính của cc - Chymotrypsin càng lớn ở nhiệt độ 50°c, protein lòng trắng trứng biến tính của a - Chymotrypsin hầu như không bị thuỷ phân, ở nhiệt độ 100°c, protein lòng trắng trứng biến tính bị thuỷ phân cao nhất là 72,7% 2.1.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ acid gây biến tính cơ chất lòng trắng trứng đối vói khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin. .. kết hợp vói serin: Chúng ta đã biết Chymotrypsin thuộc loại Serin-protease Để nghiên cứu ảnh hưởng của Serin đối với khả năng thuỷ phân protein của a chymotrvpsin, thí nghiệm được tiến hành xác đinh khả năng thuỷ phân protein của a - Chymotrypsin khi đơn độc và khi có mặt của serin ở các nồng độ khác nhau: 0,6%, 1,25%, 2,5%, 5% trong cùng điều kiện nhiệt độ 40°c và thời gian 30 phút Kết quả thu được ... lâu, khả thuỷ phân protein papain tăng thòi gian 10 phút, khả năns thuv phân protein papain thấp 23,7% thời gian 60 phút, khả thuỷ phân protein papain cao 42,2% 2.3 Khả tiêu protein a - Chymotrypsin. .. cao, khả thuv phân protein lòng trắng trúĩig biến tính Papain lớn nhiệt độ 50°c, Protein bị biến tính không đáng kể bị thủy phân 1,96% Ở nhiệt độ 100°c, protein bị biến tính nhiều bị thủy phân. .. cứu khả thuỷ phân Protein a - Chymotrypsin papain khỉ bị viêm Đê tài nhằm sô mục tiêu sau đây: Nghiên cứu khả nãns phân huv protein nhữns trạng thái biến tính khác a -chymotrypsin papain Góp phần