Vai trò của trực khuẩn e coli gây viêm ruột tiêu chảy trên đàn công nuôi tại vườn quốc gia Cúc phương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM *** LƯƠNG THỊ THÙY DUNG VAI TRÒ CỦA TRỰC KHUẨN E.COLI GÂY VIÊM RUỘT TIÊU CHẢY TRÊN ĐÀN CÔNG NUÔI TẠI VƯỜN QUỐC GIA CÚC PHƯƠNG CHUYÊN NGÀNH: THÚ Y MÃ SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHẠM NGỌC THẠCH HÀ NỘI – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, cơng trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Tác giả luận văn Lương Thị Thùy Dung Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận văn ngồi cố gắng thân, tơi ln nhận quan tâm giúp đỡ thầy giáo, cô giáo bạn bè đồng nghiệp Nhân dịp này, trước tiên xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu thầy, cô giáo khoa Thú y, Viện đào tạo sau đại học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội dành nhiều thời gian cơng sức giúp đỡ tơi q trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học: PGS TS Phạm Ngọc Thạch trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo Bộ môn Nội – Chẩn – Dược, khoa Thú y giúp đỡ tơi q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới BSTY Hồng Xn Thủy - Phó giám đốc Trung tâm cứu hộ bảo tồn động vật hoang dã, rừng Quốc gia Cúc Phương, tập thể cán trung tâm tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian thực tập Đồng thời, xin cảm ơn PGS.TS Cù Hữu Phú cán Bộ môn Vi trùng – viện Thú y Quốc gia tạo điều kiện tốt nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu Tôi vô biết ơn bạn bè, đồng nghiệp người thân gia đình tơi ln động viên khích lệ giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn để hồn thành luận văn Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Tác giả luận văn Lương Thị Thùy Dung Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT VÀI NÉT VỀ CHIM CÔNG 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Hiện trạng phân bố công giới nước 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Khả sinh sản 1.1.5 Chăm sóc ni dưỡng chim cơng má vàng, má trắng 10 1.1.6 Bệnh chim công chăn nuôi 12 1.1.7 Giá trị kinh tế 12 1.2 TRỰC KHUẨN E.COLI 13 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nước 13 1.2.2 Tình hình nghiên cứu giới 14 1.2.3 Một số đặc tính trực khuẩn E.coli 16 1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn E.coli 18 1.2.5 Các yếu tố độc lực quan trọng đặc tính gây bệnh vi khuẩn E.coli gây bệnh gia cầm 21 1.3 BỆNH DO E.COLI GÂY RA Ở GIA CẦM 31 1.3.1 Căn nguyên 31 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 1.3.3 Cơ chế sinh bệnh 32 1.3.4 Hướng phòng trị bệnh E.coli 33 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Ðối tượng phạm vi nghiên cứu 35 2.2 Ðịa điểm nghiên cứu 35 2.3 Nội dung nghiên cứu 35 2.4 Nguyên liệu nghiên cứu 36 2.4.1 Mẫu bệnh phẩm sử dụng nghiên cứu 36 2.4.2 Môi trường hóa chất 36 2.4.3 Động vật thí nghiệm 36 2.5 Phương pháp nghiên cứu 37 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 37 2.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli 38 2.5.3 Phương pháp xác định vi khuẩn E.coli phân lập 39 2.5.4 Phương pháp xác định số yếu tố có liên quan đến độc lực vi khuẩn E.coli 40 2.5.5 Kiểm tra độc lực chủng vi khuẩn E.coli phân lập chuột bạch 43 2.5.6 Xác định serotype kháng nguyên O chủng vi khuẩn E.coli phân lập phản ứng ngưng kết nhanh phiến kính 44 2.5.7 Phương pháp xác định khả mẫn cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn E.coli phân lập 45 2.5.8 Thử nghiệm số phác đồ trị bệnh tiêu chảy E.coli gây chim công 46 2.5.9 Xử lý số liệu 48 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Điều kiện tự nhiên vườn Quốc gia Cúc Phương 49 3.1.1 Điều kiện tự nhiên, địa hình 49 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 3.1.2 Đất đai, khí hậu, hệ động vật 49 3.1.3 Điều kiện xã hội 50 3.2 Tình hình dịch bệnh đàn chim cơng ni Trung tâm cứu hộ bảo tồn động vật hoang dã, vườn Quốc gia Cúc Phương 51 3.2.1 Thực trạng chim công bị viêm ruột tiêu chảy 51 3.2.2 Thực trạng chim công bị rối loạn hô hấp chấn thương 54 3.2.3 Các biểu lâm sàng chim công bị tiêu chảy nghi nhiễm E.coli 56 3.3 Phân lập giám định E.coli từ phân chim công nuôi vườn Quốc gia Cúc Phương 58 3.3.1 Kết phân lập E.coli từ phân chim công bị tiêu chảy nghi nhiễm E.coli chim công khỏe 58 3.3.2 Kết xác định số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn E.coli phân lập từ phân chim công bị tiêu chảy chim công khỏe 60 3.3.3 Kết xác định serotype số yếu tố độc lực chủng E.coli phân lập từ chim công khỏe mạnh chim công bị tiêu chảy 61 3.3.4 Kết kiểm tra độc lực chủng E.coli phân lập từ đàn chim công khỏe bị tiêu chảy chuột thí nghiệm 67 3.4 Kết kiểm tra khả mẫn cảm chủng E.coli phân lập từ chim công bị tiêu chảy với số loại thuốc kháng sinh 69 3.5 Kết thử nghiệm số phác đồ điều trị chim công bị viêm ruột tiêu chảy E.coli gây 73 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 Kết luận 76 Đề nghị 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT TÊN BẢNG TRANG Bảng 1.1 Phân loại khoa học Bảng 1.2 Phân loại lồi chim cơng Bảng 1.3 Phân biệt trống mái công Việt Nam ( công lục) công Ấn Độ ( công xanh) Bảng 1.4 Yêu cầu nhiệt độ úm chim công 10 Bảng 1.5 Tỷ lệ nở phương pháp ấp trứng chim công 10 Bảng 1.6 Thành phần thức ăn cho công theo độ tuổi 11 Bảng 1.7 Các loại vacxin tiêm phịng cho cơng 12 Bảng 1.8 Giá bán chim công 13 Bảng 2.1 Khái quát qui trình xác định số yếu tố độc lực E.coli 42 Bảng 2.2 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm kháng kháng sinh theo NCCLS (2010) 45 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm điều trị bệnh viêm ruột tiêu chảy chim công E.coli gây 47 Bảng 3.1 Thực trạng chim công bị tiêu chảy nuôi vườn Quốc gia Cúc Phương 52 Bảng 3.2 Tỷ lệ bị rối loạn hô hấp chấn thương chim công giai đoạn từ tháng 6/2013 đến tháng 6/2014 55 Bảng 3.3 Biểu lâm sàng chim công bị tiêu chảy nghi nhiễm E.coli (n = 27 con) 57 Bảng 3.4 Kết phân lập E.coli từ dịch ngoáy trực tràng chim công 59 Bảng 3.5 Một số đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn E.coli phân lập từ phân chim công bị viêm ruột tiêu chảy 60 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi Bảng 3.6 Kết kiểm tra yếu tố gây bệnh vi khuẩn E.coli phân lập từ chim công bị tiêu chảy chim công khỏe 63 Bảng 3.7 Kết xác định yếu tố gây bệnh serotype E.coli phân lập từ chim công khỏe chim công bị tiêu chảy 65 Bảng 3.8 Kết kiểm tra độc lực chủng E.coli phân lập từ đàn chim công khỏe bị tiêu chảy chuột bạch 68 Bảng 3.9 Kết kiểm tra độ mẫn cảm chủng E.coli phân lập từ chim công bị tiêu chảy với số loại kháng sinh thông thường 70 Bảng 3.10 Hiệu số phác đồ điều trị thử nghiệm đàn chim công bị tiêu chảy E.coli gây 73 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ STT TÊN BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 3.1 Thực trạng chim công bị tiêu chảy nuôi vườn Quốc gia Cúc Phương ( từ 6/2013 – 6/2014) 52 Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ tử vong chim công bị tiêu chảy phân trắng, xanh tiêu chảy phân lẫn máu giai đoạn từ 6/2013 đến 6/2014 53 Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ bị rối loạn hô hấp chấn thương chim công giai đoạn từ tháng 6/2013 đến 6/ 2014 55 Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ mẫu dịch ngốy trực tràng dương tính với E.coli 59 Biểu đồ 3.5 Kết kiểm tra yếu tố gây bệnh vi khuẩn E.coli phân lập từ chim công bị tiêu chảy chim công khỏe 63 Biểu đồ 3.6 Các yếu tố gây bệnh chủng E.coli phân lập từ chim công khỏe chim công bị tiêu chảy 66 Biểu đồ 3.7 Kết kiểm tra độc lực chủng E.coli phân lập từ đàn chim công khỏe bị tiêu chảy chuột bạch 68 Biểu đồ 3.8 Kết kiểm tra độ mẫn cảm chủng E.coli phân lập từ chim công bị tiêu chảy với số loại kháng sinh thông thường 71 Biểu đồ 3.9 Hiệu số phác đồ điều trị thử nghiệm đàn chim công bị tiêu chảy E.coli gây 74 Biểu đồ 3.10 Thời gian khỏi bệnh ba phác đồ điều trị (Mean ± SD, ngày) 75 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT APEC : Avian Pathogennic Escherichia coli BG : Brilliant Green BHI : Brain Heart Infusion Colv : Yếu tố kháng khuẩn Colicin V CRD : Chronic Respiratory Disease cs : Cộng DNA : Deoxyribonucleic Acid E.coli : Escherichia coli EMB : Eosin Methylen Blue EPEC : Entero pathogenic Escherichia coli ETEC : Enterotoxigenic Escherichia coli F : Fimbriae L.n : Lophura nycthemera LT : Labile Heat Toxin NCCLS : National Committee of Clinical Laboratory Standards NĐ- CP : Nghị định – Chính phủ NXB : Nhà xuất PBS : Phophate Buffered Saline PCR : Polymerase Chain Reaction ST : Stable Heat Toxin TAE : Tris – Acetic – EDTA TSB : Tryptose Soy Broth TT&BTĐTV : Trung tâm bảo tồn động thực vật VQG Vườn quốc gia : KHKTTY Khoa học kỹ thuật thú y Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix 100 100 Mẫn cảm trung bình 73.33 80 70 T ỷ lệ % Mẫn cảm 86.67 86.67 86.67 90 Kháng 66.67 60 60 60 46.67 50 40 33.33 40 26.67 26.67 30 13.33 20 10 13.33 13.33 13.33 13.33 13.33 0 0 13.33 13.33 0 26.67 0 0 0 Ampicillin (Am) Kanamicin (Km) Streptomycin Sulfisoxazole Tetracycline (Sm) (Su) (Tc) Gentamycin CiprOfloxacin (Gm) (Cip) Ofloxacin (Ofx) Cephalothin (Cf) Neomycin Colistin (Col) (Nm) Thuốc kháng sinh Biểu đồ 3.8 Kết kiểm tra độ mẫn cảm chủng E.coli phân lập từ chim công bị tiêu chảy với số loại kháng sinh thông thường Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71 Ghi chú: Biểu đồ 3.8 biểu diễn tỷ lệ mẫn cảm 15 chủng E.coli điển hình (phân lập từ dịch ngoáy trực tràng chim công bị tiêu chảy) với 11 loại thuốc kháng sinh cấp độ: Mẫn cảm, trung gian kháng thuốc, theo tiêu chuẩn Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ tiêu chuẩn lâm sàng Phịng thí nghiệm, năm 2010 Các thuốc Ampicillin, Kanamicin, Neomycin cho kết kháng sinh đồ E.coli tương tự Độ mẫn cảm cao kháng sinh đạt 4/15 chủng, chiếm tỷ lệ thấp (26,67%) Ngược lại tỷ lệ cao (60,00%) chủng E.coli kháng lại thuốc này, có 2/15 chủng cịn lại có mức độ mẫn cảm trung bình Như vậy, sử dụng thuốc kháng sinh để điều trị bệnh E.coli gây đàn chim công trung tâm cho hiệu thấp Đối với kháng sinh lại bao gồm Streptomycin, Sulfisoxazole, Gentamycin Colistin, tỷ lệ chủng E.coli có độ mẫn cảm cao 46,67%, 73,33%, 66,67% 73, 33% Trong số kháng sinh này, Streptomycin có tỷ lệ kháng thuốc cao (40,00%) Trong tỷ lệ chủng kháng Gentamycin, Colistin Sulfisoxazole 33,33%, 26,67% 13,33% Đối chiếu với nhật ký sử dụng thuốc kháng sinh chế phẩm có chứa thuốc kháng sinh trung tâm cho thấy Các kết nghiên cứu hồn tồn có sở loại thuốc cho tỷ lệ mẫn cảm thấp tỷ lệ kháng cao Ampicillin, Kanamicin Neomicin dùng phổ biến trung tâm thời gian dài Các thuốc lại Streptomycin, Sulfisoxazole, Gentamycin Colistin sử dụng hiệu điều trị không cao Từ kết kiểm tra kháng sinh đồ chủng E.coli phân lập được, Tetracyclin Ofloxacin lựa chọn làm thành phần hai phác đồ điều trị thử nghiệm Đây hai kháng sinh có độ mẫn cảm cao Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 với chủng E.coli phân lập từ chim cơng bị tiêu chảy Bên cạnh hai kháng sinh khơng có chủng vi khuẩn kháng 3.5 Kết thử nghiệm số phác đồ điều trị chim công bị viêm ruột tiêu chảy E.coli gây Các cá thể chim công bị tiêu chảy E.coli chia thành nhóm để điều trị phác đồ mô tả phần phương pháp nghiên cứu Hiệu phác đồ điều trị đánh giá thông qua tiêu bao gồm: tỷ lệ khỏi (%) thời gian khỏi bệnh trung bình (ngày) Kết trình bày bảng 3.10, biểu đồ 3.9 biểu đồ 3.10 Từ biểu đồ 3.9, dễ dàng nhận thấy phác đồ phác đồ cho hiệu điều trị cao, tỷ lệ khỏi phác đồ đạt 100% Trong phác đồ 1, với thành phần Gentamycin sulphate, cho hiệu điều trị thấp nhiều, (P