Nghiên cứu tình hình nhiễm, vai trò của vi khuẩn clostridium perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở bò, lớn nuôi tại hà nội và một số vùng phụ cận

Luận văn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp i BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI HUỲNH THỊ MỸ LỆ NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH NHIỄM, VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÒ, LỢN NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ MỘT SỐ VÙNG PHỤ CẬN LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Dịch tễ học Thú y Mã số : 62 62 50 15 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Bá Hiên 2. TS. ðỗ Ngọc Thuý HÀ NỘI – 2010 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan: công trình khoa học này là của tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan: mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án đều đã được cảm ơn. Các thông tin trích dẫn trong luận án đều chính xác và được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 15 tháng 3 năm 2010 Tác giả Huỳnh Thị Mỹ Lệ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Viện Đào tạo Sau Đại học, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y - trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo Nghiên cứu sinh tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn ban điều hành dự án Việt - Bỉ, trường ĐHNN Hà Nội đã hỗ trợ kinh phí để tôi thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ thuộc bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, khoa Thú y - Trường ĐHNN Hà Nội; bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia và Trung tâm Cúm Quốc Gia - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy hướng dẫn khoa học là TS. Nguyễn Bá Hiên - bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, khoa Thú y - trường ĐHNN Hà Nội và TS. Đỗ Ngọc Thuý - bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Giáo sư Jacques Mainil, Giáo sư Annick Linden - khoa Thú y - trường Đại học Liège, Vương quốc Bỉ và PGS.TS. Trương Quang, TS. Trần Thị Lan Hương, GVC. Lê Văn Lãnh - khoa Thú y - trường ĐHNN Hà Nội đã cung cấp tài liệu và những ý kiến quý báu để tôi hoàn thiện đề tài nghiên cứu. Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè và các em sinh viên đã đóng góp công sức, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu và luận án. Hà Nội, ngày 15 tháng 3 năm 2010 Tác giả Huỳnh Thị Mỹ Lệ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp iv MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS VÀ BỆNH DO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GÂY RA 4 1.1.1. Giới thiệu chung về genus (giống, chi) Clostridium 4 1.1.2. Vi khuẩn Clostridium perfringens 11 1.1.3. Hiểu biết về một số bệnh đường tiêu hoá chủ yếu ở bò và lợn do vi khuẩn C. perfringens gây ra 22 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM VỀ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS VÀ BỆNH DO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GÂY RA 31 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 31 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 31 1.3. MỘT SỐ BIỆN PHÁP PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH DO VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GÂY RA 34 1.3.1. Biện pháp phòng bệnh 34 1.3.2. Biện pháp điều trị 38 Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 40 2.1.1. Nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn C. perfringens ở bò và lợn mắc hội chứng tiêu chảy 40 2.1.2. Nghiên cứu vai trò của vi khuẩn C. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở bò và lợn 40 2.1.3. Bước đầu nghiên cứu dịch tễ học phân tử vi khuẩn C. perfringens gây hội chứng tiêu chảy ở bò và lợn 40 2.2. NGUYÊN LIỆU 41 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 41 2.2.2. Động vật thí nghiệm 41 2.2.3. Môi trường, hoá chất 41 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 42 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp v 2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn hiếu khí và yếm khí 43 2.3.3. Phương pháp giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn C. perfringens phân lập được 46 2.3.4. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng C. perfringens phân lập được 49 2.3.5. Phương pháp xác định gen mã hóa độc tố và định typ bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 51 2.3.6. Phương pháp giải trình tự gen 53 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu 56 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 57 3.1. TÌNH HÌNH NHIỄM VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Ở BÒ VÀ LỢN MẮC HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY 57 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens ở bò 57 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens ở lợn 62 3.2. NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÒ VÀ LỢN 72 3.2.1. Số lượng của vi khuẩn C. perfringens trong phân bò, lợn bị tiêu chảy và khoẻ mạnh 72 3.2.2. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trong môi trường chuồng nuôi, sữa bò và bệnh phẩm của bò, lợn bị tiêu chảy 77 3.2.3. Kết quả giám định đặc tính sinh học và khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng C. perfringens đã phân lập được 84 3.3. BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGRENS GÂY HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÒ VÀ LỢN 100 3.3.1. Kết quả xác định gen mã hóa yếu tố độc lực và định typ các chủng C. perfringens phân lập được 100 3.3.2. Kết quả giải trình tự gen các chủng C. perfringens 117 Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 123 4.1. KẾT LUẬN 123 4.2. ĐỀ NGHỊ 124 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 125 TÀI LIỆU THAM KHẢO 126 PHỤ LỤC Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp vi CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN A : Adenin ADP : adenosine diphosphate AMP : Amplification buffer API : Analytical Profile Index ATCC : American Type Culture Collection BHI : Brain Heart Infusion bp : base pair C : Cytosin CAMP : Christie Atkins Munch-Petersen CDC : Centers for Disease Control and Prevention CFU : Colony Forming Unit CI : Confidence interval CPE : Clostridium perfringens enterotoxin CW : Clostridium welchii C. perfringens : Clostridium perfringens DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate E. coli : Escherichia coli ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EYA : Egg Yolk Agar FAO : Food and Agriculture Organization G : Guanin HBS : Haemorrhagic bowel syndrome kDa : kilo Dalton KM : Khoẻ mạnh LD : Lethal dose µl : microlitre NCCLS : National Committee of Clinical Laboratory Standards OR : Odds Ratio RNA : Ribonucleic Acid rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid PCR : Polymerase Chain Reaction SIM : Sulfide – Indole - Motility T : Thymin TAE : Tris - Acetate - EDTA TE : Tris - EDTA TC : Tiêu chảy TGC : Thioglycollate TGE : Transmissible gastroenteritis TSC : Tryptose Sulphite Cycloserine Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp vii DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 1.1 Bệnh do vi khuẩn Clostridium gây ra ở người và động vật 5 1.2 Điều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn C. perfringens 12 1.3 Các loại độc tố do vi khuẩn C. perfringens sản sinh ra 13 1.4 Bệnh gây ra bởi các độc tố chính của vi khuẩn C. perfringens 20 2.1 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo NCCLS (1999) 50 2.2 Trình tự mồi của phản ứng Multiplex PCR dùng để xác định gen mã hoá độc tố của các chủng C. perfringens 52 2.3 Thành phần các chất trong phản ứng Multiplex PCR dùng để xác định gen mã hoá độc tố của các chủng C. perfringens 52 2.4 Chu kỳ nhiệt của phản ứng Multiplex PCR dùng để xác định gen mã hoá độc tố của các chủng C. perfringens 53 2.5 Trình tự cặp mồi để giải trình tự gen 54 2.6 Thành phần phản ứng PCR để giải trình tự gen 54 2.7 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR để giải trình tự gen 54 2.8 Chu kỳ nhiệt của phản ứng giải trình tự gen 55 3.1 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy và bò khỏe mạnh 57 3.2 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy tại các địa phương 58 3.3 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy theo lứa tuổi 60 3.4 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh 64 3.5 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy tại các địa phương 67 3.6 Số lượng vi khuẩn C. perfringens và E. coli trong mẫu phân bò bị tiêu chảy và bò khỏe mạnh 73 3.7 Số lượng vi khuẩn C. perfringens và E. coli trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh 75 3.8 Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trong mẫu môi trường chuồng nuôi và sữa của bò bị tiêu chảy 78 3.9 Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trong bệnh phẩm của bò và lợn bị tiêu chảy 82 3.10 Một số đặc tính sinh học của các chủng C. perfringens phân lập được từ mẫu phân bò, lợn bị tiêu chảy và khỏe mạnh 85 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp viii 3.11 Một số đặc tính sinh học của các chủng C. perfringens phân lập được từ môi trường chuồng nuôi, sữa và phủ tạng 86 3.12 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa và định danh các chủng C. perfringens phân lập được bằng hệ thống API 20A 87 3.13 Kết quả kiểm tra độc tố trong chất lọc từ một số mẫu phân bò bị tiêu chảy 89 3.14 Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng C. perfringens phân lập được từ bò bằng phương pháp tiêm truyền trên chuột 91 3.15 Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng C. perfringens phân lập được từ lợn bằng phương pháp tiêm truyền trên chuột 93 3.16 Khả năng mẫn cảm của các chủng C. perfringens phân lập được từ bò và lợn bị tiêu chảy với 12 loại kháng sinh 97 3.17 Kết quả định typ các chủng C. perfringens phân lập được từ mẫu phân và phủ tạng bò bị tiêu chảy 102 3.18 Kết quả xác định gen cpe và cpb2 của các typ vi khuẩn C. perfringens phân lập từ bò 109 3.19 Kết quả xác định gen cpe và cpb2 của các typ vi khuẩn C. perfringens phân lập từ lợn 113 3.20 Kết quả xác định gen cpe và cpb2 của các typ vi khuẩn C. perfringens phân lập từ môi trường chuồng nuôi và sữa 117 3.21 Một vài đặc tính sinh học của những chủng C. perfringens được lựa chọn để giải trình tự gen 118 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ix DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 2.1 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn hiếu khí và yếm khí từ các mẫu phân của gia súc bị tiêu chảy 44 2.2 Sơ đồ quy trình phân lập và giám định vi khuẩn C. perfringens 45 3.1 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy và bò khỏe mạnh 58 3.2 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy theo lứa tuổi 61 3.3 Biểu đồ so sánh tỷ lệ lợn bị tiêu chảy có các trạng thái phân khác nhau 63 3.4 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh 65 3.5 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy theo lứa tuổi 65 3.6 Bò bị tiêu chảy nặng, gầy còm 69 3.7 Phân bò bị tiêu chảy (màu đen, nhiều nước, mùi thối khắm) 69 3.8 Lợn bị chết vì tiêu chảy (ruột đầy hơi, xuất huyết) 69 3.9 Các thiết bị dùng để tạo môi trường nuôi yếm khí vi khuẩn C. perfringens 70 3.10 Vi khuẩn C. perfringens trong môi trường nước thịt gan yếm khí 70 3.11 Vi khuẩn C. perfringens trong môi trường Cooked meat 71 3.12 Vi khuẩn C. perfringens trong môi trường Thioglycollate 71 3.13 Vi khuẩn C. perfringens dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần 71 3.14 Vi khuẩn C. perfringens trên môi trường CW (+ 4% lòng đỏ trứng) 71 3.15 Khuẩn lạc C. perfringens gây dung huyết kép trên môi trường thạch máu 72 3.16 Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường TSC 72 3.17 Biểu đồ biến động số lượng vi khuẩn C. perfringens và E. coli trong mẫu phân bò bị tiêu chảy và bò khỏe mạnh 74 3.18 Biểu đồ biến động số lượng vi khuẩn C. perfringens và E. coli trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh 76 3.19 Bò bị tiêu chảy, toàn bộ bầu vú sưng, đỏ ửng 81 3.20 Phản ứng CAMP ngược của vi khuẩn C. perfringens trên môi trường thạch máu 88 3.21 Đặc tính mọc của vi khuẩn C. perfringens trên môi trường SIM 88 3.22 Vi khuẩn C. perfringens trên môi trường Litmus Milk 88 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp x 3.23 Giám định các đặc tính sinh hoá và định danh vi khuẩn C. perfringens bằng hệ thống API 20A 88 3.24 Tính chất mọc của C. perfringens trên môi trường thạch lòng đỏ trứng 89 3.25 Chuột thí nghiệm chết do độc tố của vi khuẩn C. perfringens 95 3.26 Mổ khám kiểm tra bệnh tích của chuột thí nghiệm chết do độc tố của vi khuẩn C. perfringens 96 3.27 Kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn C. perfringens 100 3.28 Sản phẩm của phản ứng PCR sau quá trình điện di để xác định các loại gen mã hóa độc tố của vi khuẩn C. perfringens phân lập từ bò 104 3.29 Sản phẩm của phản ứng PCR sau quá trình điện di để xác định các loại gen mã hóa độc tố của vi khuẩn C. perfringens phân lập từ lợn 107 3.30 Không có tín hiệu A tại vị trí 54 của cả 5 chủng T1, T2, T3, T4 và T5 119 3.31a Tín hiệu C/T tại vị trí 172 của chủng T4 119 3.31b Tín hiệu A/G tại vị trí 319 của chủng T4 120 3.31c Tín hiệu T/G tại vị trí 438 của chủng T4 120 3.32a Tín hiệu A tại vị trí 508 của chủng T2 120 3.32b Tín hiệu A tại vị trí 552 của chủng T2 và T3 121 3.33 Tín hiệu C tại vị trí 608, C tại vị trí 609 và G tại vị trí 615 của chủng T2 121 3.34 Tín hiệu A tại vị trí 676 của 5 chủng T1, T2, T3, T4 và T5 122