Bước đầu đánh giá độ ổn định hoạt tính protease trong chế phẩm chứa papain, pancreatin, pepsin

Đó là quá trình thuỷ phân thức ăn thành các chất dinh dưỡng, biến thức ăn từ dạng cấu tạo phức tạp thành dạng đơn giản, cơ thể có thể sử dụng được.. Ngoài việc do chế độ ăn thiếu protein

Ngỉíồi thực hiện : Trần Thị Thu Trang Người hưởng dẫn : PGS-TS Nguyễn Xuán Thắng

DS Nguyễn Văn R ư Noi thực hiện : Bộ môn Hoá Sinh - Vi Sinh Thời gian thực hiện : 0110312000 - 1510512000

9-OV

M ) ’3 Q c A m Ơ Q Í

^Oêi lồìiíỊ ỉiínlt ỉvọn q rừi lìièt ổn iâ ir iííe em x ỉtt ('ít â n th à n h aâm tín í()Cị(S - CTtV Qlfjaựễn (Ầulân < r7ft(íiwj, iMỊiiòi (tã tận tìn h giúp, em tro n g Mttêí q u á f rìu ti là m thu'ọ ttựítỉêitt tỉ ti ỈKìiin Ỉỉtàitỉt íưĩn Uhúá ín â ti Híiự.

rí)ồn(Ị thài, em xỉn eítâtt th à n h eàm Ưu rJ)t$ Q tguụln (Ị)ản (Qti,

II(/un! ĩtã h ỗ teỢ q iú p itđ ent trúng, su ối q u á trình, là m thực, n g h iê m.

Q ĩh âit riìp n à ụ em cũng, arỉtt (T'íoe editi đu cáe tỉiẩ ụ , eâ g iá o ỉrtìttg

Oiỉtỉ í7Af' íTCỈm (¥ìuụĩin , Q ĩqtụiễit 'Ỹĩtti iTCíiau/i (Tã ỉạtì mọi itĩềtt kiện tỉỉitậ n

lọ t v ề p h ư đ ttg tiên, k ỹ th u ậ t (fiáp đỡ' em lì oàn tỉià íth bản k h ú á itiậ tt n à ỉ/.

£ m x ỉn eỉtứa eáa th ầ y , cô d ồ i d à o iứ e kỉtơẻ, đ q t đươe tth ỉều th à n h

tích í von (Ị qỉảniỊ dợụ tm nghiến cứu hlw a ítọtu

7/5Ờ Q ĩồỉ ttg à ụ : 15 th án g, 5 n ă m 2 0 0 0

Sinh, lùên

< 7Jrần <77// Í7/»Í ^ra ttg

MỤC LỤC

Phần I - Đặt vấn đề 1

Phần II- Tổng quan 2

2.1 Tình hình suy dinh dưỡng 2

2.2 Prolease 4

Phần III- Thực nghiệm và kết quả 10

3.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 10

3.2 Thực nghiệm và kết quả 17

3.2.1 Tạo chế phẩm 17

3.2.2 Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính protease 18 X 3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính protease 20

3.2.4 Khả năng thu ỷ phân của các protease với các protein 22

3.2.5 Độ ổn định hoạt tính protease (heo thời gian 26

3.3 Bàn luận 28 >< Phần IV - Kết luận 31

PHẦN I

ĐẶT VÂN ĐỂ

Tiêu hoá và hấp thu là hai quá trình quan trọng xảy ra ở bộ máy tiêu hoá

Thức ăn muốn được hấp thu vào cơ thể tốt thì tnrớc hết phải được tiêu hoá Đó

là quá trình thuỷ phân thức ăn thành các chất dinh dưỡng, biến thức ăn từ dạng

cấu tạo phức tạp thành dạng đơn giản, cơ thể có thể sử dụng được Sự tiêu hoá

thức ăn ảnh hưởng trực tiếp đến tình trạng sức khoẻ đặc biệt khi thức ăn nghèo chất dinh dưỡng hoặc khi khả năng tiêu hoá của cơ thể kém thì việc tăng cường sự tiêu hoá là vấn đề cần thiết

Ở nước ta trong những năm gần đây, tình hình sức khoẻ và chế độ dinh

dưỡng đã được cải thiện, song tỷ lệ suy dinh dưỡng (SDD) ở trẻ em vẫn CÒ11

cao Suy dinh dưỡng có nhiều nguyên nhân nhưng ăn uống là một nguyên nhân chủ yếu Ngoài việc do chế độ ăn thiếu protein thì sự thiếu hiểu biết của các bà mẹ về dinh dưỡng, sức khoẻ và kiến thức nuôi con là một nguyên nhân

quan trọng gây SDD ở (lẻ em Chính vì vậy, dù chế độ ăn đầy đủ protein

nhưng do cách cho ăn không hợp lý khiến trẻ bị rối loạn tiêu hoá không hấp thu được thức ăn, cuối cùng dẫn đến SDD Khi trẻ bị suy dinh dưỡng thì hàm lượng các men tiêu hoá giảm gây ảnh hưởng tới khả năng tiêu hoá và hấp thụ các chất dinh dưỡng nhất là protein Do đó việc dùng thuốc có chứa men tiêu hoá giúp cho trẻ tiêu hoá tốt thức ăn kích thích trẻ ăn ngon là cần thiết trong việc phòng và chống SDD Thực tế cho thấy, nhiều chế phẩm chứa một enzym duy nhất như pepsin viên, a chymotrypsin, trypsin viên đã có hiệu quả tốt Song vấn đề đặt ra là phối hợp các enzym trong chế phẩm có thể làm tăng cường tác dụng của chúng hay không Để góp phần nghiên cứu vấn đề này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng lẫn nhau của một số protease có nguồn gốc khác nhau trong đó bước đầu đánh giá độ ổn định hoạt tính của chúng trong chế phẩm hỗn hợp và mức độ phân giải protid từ các nguồn đạm khác nhau dùng làm thức ăn Đề tài có thể góp phần nhỏ làm cơ sở cho việc bào chế các dạng thuốc kết hợp enzym trong điều trị, góp phần vào chương

PHẦN II

TỔNG QUAN

2.1.Tình hình suy dinh dưỡng

Suy đinh dưỡng đang là vấn đề quan trọng đối với việc nâng cao sức khoẻ

của trẻ em ở các nước đang phát triển nói chung và đặc biệt là ở Việt Nam

hiện nay Đó là tình trạng bệnh lý xảy ra khi chế độ ăn nghèo protein- năng V lượng làm ảnh hưởng đến sự phát triển thể chất và tinh thần của trẻ

Để có biện pháp phòng và điều trị SDD thích hợp, các tác giả đã đi sâu tìm hiểu về các nguyên nhân gây vSDD ở trẻ em Nguyên nhân gây ra SDD có

nhiều nhưng nổi bật là một số nguyên nhân chính sau:

+ SDD do chế độ ăn thiếu protein:

Ở lứa tuổi nhỏ nhu cầu về protid và các acid amin cần thiết của trẻ rất cao Sở dĩ nhu cẩu cao như vậy là để đảm bảo cho sự phát triển nhanh của cơ thể trẻ Nguồn protid này phải được cung cấp từ những thức ăn protid động vật

có chất lượng cao như: trứng, sữa, thịt Tại các nước đang phát triển, thức ăn dùng cho trẻ khi mẹ thiếu sữa hoặc thức ăn thời kỳ cai sữa chủ yếu là gạo, bột

mỳ, ngô, ỉiía mạch Các loại thức ăn này có nhiều năng lượng nhưng thiếu protid, mặt khác protid ngũ cốc có chất lượng thấp hơn so với protid động vật *- Nhu cẩu phát triển cơ thể mạnh, đòi hỏi số lượng thức ăn phải nhiều, chất lượng thức ăn phải cao Nếu khẩu phần ăn của trẻ thiếu về số lượng và kém về chất lượng kéo dài sẽ làm cho trẻ bị SDD nặng

+ SDD do nhiễm khuẩn:

Các bệnh nhiễm khuẩn là những nguyên nhân trực tiếp dẫn đến SDD và

tử vong cao ở trẻ em như: ỉa chảy, sốt xuất huyết, viêm phổi, viêm phế quản

Khi bị nhiễm khuẩn đặc biệt là khi có sốt cao, cơ thể tiêu hao nhiều năng lượng và các chất dinh dưỡng, giảm cảm giác thèm ăn, tiêu hoá hấp thu kém,

mức cung cấp các chất dinh dưỡng không đủ đáp ứng nhu cầu của cơ thể dẫn đến trẻ bị SDD Ngoài ra khi trẻ bị các bệnh về tiêu hoá như: ỉa chảy, nôn, kém ăn, các bà mẹ lại bắt C011 kiêng khem không đúng cho con ăn thức ăn thiếu chất kéo đài nên càng làm cho trẻ bị SDD.

+ Thiếu hiểu biết về đinh dưỡng và sức khoẻ:

Sự thiếu hiểu biết về dinh dưỡng rất phổ biến, nhất là ở các nước đang

phát triển, do trình độ dân trí thấp Một số bà mẹ thiếu kiến thức nuôi con theo

khoa học Viện BVBMTE đã đi đến kết luận là hơn 60% trẻ em bị SDD là do gia đình thiếu hiểu biết về nuôi con Đa số các bà mẹ đều không biết nhu cầu

về dinh dưỡng cao của trẻ trong những năm đầu để đảm bảo cho sự phát triển mạnh nên đã cho con ăn thiếu chất, không biết cho con ăn hợp lý để đảm bảo cho trẻ đủ chất dinh dưỡng Do đó có những bà mẹ có điều kiện kinh tế khá tốt nhưng con vãn bị SDD

Ngoài ra còn một số nguyên nhân khác cũng gây ra tình trạng SDD ở trẻ

em như vấn đề kinh tế kém phát triển, thu nhập thấp và vệ sinh môi trường kém

Khi trẻ bị SDD, một loạt các cơ quan (rong cơ thể đều bị tổn thương như: gan, tim mạch, não, hệ thống thần kinh, hệ thống miễn dịch, tiêu hoá Trong

đó cơ quan tiêu hoá có biểu hiện bị tổn thương sớm lõ rệt Các tế bào của tuyến tuy và niêm mạc ruột bị teo, hàm lượng các men tiêu hoá giảm, gây ảnh hưởng tới khả năng tiêư hoá hấp thu các chất dinh dưỡng nhất là protein Do

đó việc sử dụng men tiêu hoá là một khâu không thể thiếu trong phòng chống SDD và các bệnh thiếu vi chất dinh dưỡng, các bệnh mạn tính nhất là các bệnh mạn tính đường tiêu hoá cũng như các hội chứng kém hấp thu Các hỗn hợp men tiêu hoá thực phẩm chủ yếu chứa 3 loại:

- Amylase (enym t-iêu hoá chất bột)

- Lipase (enzym tiêu hoá lipicl)

Nó được chỉ định chủ yếu cho trẻ ăn không tiêu, rối loạn tiêu hoá, đầy

hơi chướng bụng sau khi ăn hay bú, tình trạng biếng ăn ở trẻ nhỏ, trẻ SDD

Hướng giải quyết nhằm chống SDD đã được đặt ra đó là dùng chế độ ăn hợp lý, Ihức ăn dỗ tiôu hoá và dặc biộl cíin bổ sung các cnzym liôu hoíí từ

ngoài vào để giảm tỷ lệ SDD ở trẻ etn đưới 5 tuổi xuống còn dưới 30%[3] năm

2000 và không còn trẻ bị SDD nặng

2.2.Protease

2.2.1 Sơ lược về Protease

Protease thuộc loại enzym hydrolase[l] Nhóm này gồm có 471 enzym trong toàn bộ hệ thống phân loại 1862 enzym[2] v ề số lượng loại này đứng thứ 2 sau enzym oxy hoá-khử và có nhiều chế phẩm đã được đươc^sử đụng trong y dược học Trong loại này, nhóm enzym protease có số lượng lớn nhất với 128 enzym[2] đã được nghiên cứu Trong khoá luận này chúng tôi nghiên cứu 3 loại protease có chứa trong các chế phẩm pancreatin, pepsin, papain Đây là những protease đã được dùng làm men tăng cường tiêu hoá sử đụng trong chương trình phòng chống suy dinh dưỡng

2.2.2 Pcpsin

Pepsin giữ một vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hoá Pepsin là enzym thuỷ phân protein và đã được nghiên cứu từ lâu Người ta đã xác định được bản chất, cấu trúc, và trọng lượng phân tủ' của nó

Ngày nay người ta đã biếl được 4 dạng pepsin là: Pepsin A, B, c , D tương ứng với các dạng tiền enzym là Pepsinogen A, B, c , D Các enzym có sự khác nhau chút ít về cấu trúc nhưng đặc tính thuỷ phân protein thì hoàn toàn giống nhau Các pepsinogen là liền enzym của pepsin, nó được tiết ra từ tế bào chính của dạ dày, Iihò' vai trò của HC1 trong dạ dày pepsinogen mới chuyển thành enzym hoạt động là pepsin

Pepsin có trọng lượng phân tử là 35.000, là một chuỗi polypeptid gồm

321 acid amin cấu trúc protein bậc 4 nhờ 3 cầu nối disulfua và một liên kết

phosphal Pepsin iioàn loàn bồn ở pH 2-5, ở liên pH này pepsin nhanh chóng

mất hoạt tính chuyển ngược thành pepsinogen

Các chế phẩm chứa pepsin từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y học, trong chăn nuôi và trong công nghiệp thực phẩm Trong chăn nuôi nó là chất kích thích tiêu hoá giúp vật nuôi mau tăng trọng, giảm chi phí Trong y học pepsin được dùng làm thuốc giúp tiêu hoá thức ăn nhất là các protid có trong thịt, trứng, sữa dùng cho người có chức năng tiêu hoá kém, trẻ em bị suy dinh dưỡng

Các biệt dược chứa pepsin đã được sử dụng phổ biến ở nhiều nơi

+ Sản phẩm trong nước[8]:

- Viên nén Pepsin 0,05g của Viện dinh dưỡng

- Viên nén Pepsin-Bl có chứa 0.05g pepsin và 0,05g vitamin BI của HATAPHAR

+ Sản phẩm nước ngoài[11 ]:

- Acipepsol(Tiệp): viên nén

Thành phần(TP): 400 mg betain clorid và 1 mg pepsin

Chỉ định (CĐ): Các chứng giảm tiết HCL ở dịch vị, đầy bụng,

chậm tiêu, phối hợp trị thiếu máu do thiếu Fe

- Librozym Plus(Kypharco): viên bọc đường

TP: Diastase 200mg, Pancreatin lOOmg, pepsin 50mg, Simethicone 50mg

CĐ: Điều trị rối loạn tiêu hoá, khó tiêu, no hơi, khó chịu sau khi ăn

Pepsinogen có cấu trúc như sau:

H ìnhl Cấu trúc phân tử của Pepsỉnogen

2.2.3 Pancreaỉin

Pancreatin là sản phẩm chiết suất từ tuyến tuỵ của động vật có vú (bò,cừu ) có chứa các enzym protease, lipase và amylase Pancreatin thuỷ phân chất béo (liành glycerol và acid béo, chuyển hồ linh bột thành dextrin và

đường, chuyển protein thành các chuỗi polypeptid ngắn rồi thành các acid amin, trong đó khả năng thu ỷ phân protein được chú trọng nhiều.

Người la đã biết pancreatin có chứa các enzym sau:

Các chế phẩm pancreatin được sử dụng lộng rãi ỏ' nhiều nước, ở nước ta chế phẩm này hoàn toàn nhập từ nước ngoài và cũng được sử dụng lộng rãi trong điều trị chứng lối loạn tiêu hoá, suy tụy ngoại tiết, viôm tụy mãn, di chứng sau cắt tụy, cắt dạ dầy

+ Pancrelase(Pháp): viên nén bọc đường 0,6gTP: Bột tuỵ lợn, pancreatin, cellulase, taninCĐ: Điều trị suy tuỵ ngoại tiết, triệu chứng rối loạn tiêu hoá,khó tiêu, đặc biệt là do thức ăn có bột gây ra.

2.2.4 Papain

Papain là một protease thực vật có nhiều trong chất nhựa mủ của quả đu

đủ xanh và các bộ phận khác của cây đu đủ (Caria papaya L Caricaceae)[5]

Papain đã được nghiên cứu từ những năm cuối thế kỷ 19 bởi Wurter, Bosehut, Balls và J K Kemmel[9]

Papain ở dạng kết tinh hay bột có màu trắng hơi vàng Cấu trúc bậc nhất

của papain gồm 221 acid am in, thuộc nhóm Serin protease Phân tủ' lượng của ^

papain tương đối nhỏ (khoảng 23.400) quang phổ bấp thụ tử ngoại đặc trưng ở

bước sóng Ằ-=278nm

Papain tan trong nước, tan tốt trong glycerol Nó không tan trong các dung môi hữu cơ

Papain có khoảng pH và nhiệt độ thích nghi tương đối lộng Nó ổn định

và hoạt động mạnh trong khoảng pH 4 - 9 , mất hoạt tính nhanh ở môi + trường acid, thích nghi ỏf nhiệt độ cao, mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 90°c.

Trung tâm hoạt động của papain có nhóm sulíuahydril (SH) Khi nhóm

SH ở dạng khử thì papain ở dạng hoạt động, hoạt tính của enzym này bị ức chế

khi nhóm SH bị oxy hoá tạo liên kết disulíua (S-S) Để phục hồi hoạt tính của men này người ta tiến hành khử các liên kết (S-S) đưa về dạng S-H Các cliất khử như HCN, Thiosúlíat và các chất hoạt hoá chứa nhóm SH như cystein, dithiothretol hay được dùng để phục hổi hoạt tính enzym Các chất này có tác dụng hoạt hoá men do chúng khử được các liên kết disulfua của enzym đưa enzym từ dạng không hoạt động sang dạng hoạt động[6]

Người ta đã sử dụng các chế phẩm chứa papain để điều trị rối loạn tiêu hoá, điều trị bệnh sãu răng, chống viêm loét Các thuốc này có tác dụng điều trị tốt và ít gây tác dụng phụ.

Các chế phẩm papain ngày nay được lưu hành khá nhiều trên thế giới dưới nhiều dạng khác nhau: dạng dung dịch, dạng bột, dạng viôn nén

Một số chế phẩm chứa papain như:

/v'

+ Neopeptine(An độ): dạng viên nangTP: a amylase, papain, thiaminmononitrat, riboílavin,pyridoxin, nicotinamid, simethicone

CĐ: Các chứng ăn châm tiêu rối loạn tiêu hoá

+ Neopeptin: siro 15ml dạng giọt

TP: a nmylase, papain, dầu (hì là, đáu anit., dÀu camm

CĐ: Các chứng đầy hơi, kém ăn, chậm tiêu, chướng bụng, rối

loạn tiêu hoá, biếng ăn ở trẻ so' sinh, trẻ em.

Thu từ quả đu đủ xanh trên cây dùng dao kliía các lãnh (khoảng 2cm một

rãnh ) theo chiều dọc, dùng bát hứng nhựa chảy xuống, gộp lại đưa lên sấy ở

nhiệt độ 45° - 50°c sau thời gian 4-6h sẽ thu được bột khô có màu trắng ngà

b) Pancreatin:

+ Dịch men Pancreatin:

Viên nén bọc đường Panthicole-F, loại bỏ vỏ bọc đường Nghiền với NaCl 0.9% cho mịn, đồng nhất thêm vừa đủ 120ml, ly tâm 3000vòng/phút, lấy dịch trong

c) Bột pepsin:

Lấy niêm mạc dạ đày tươi, rửa sạch, thái nhỏ M(g) thêm l/2xM(ml) acid

HCl 4% để ủ ấm ở nhiệt độ 40°-42°C trong thời gian 12-16h tách lấy dịch, bỏ

bã Dùng NaCl kết tủa, lấy tủa bỏ dịch Tủa được phối hợp với lactose theo tỉ

lệ 1:1, sấy khô ở nhiệt độ 40°-50°C, nghiền mịn.

3.1.1.2 Protein dùng làm co' chất

a) Casein

Dung dịch casein 1,2% được điều chế bằng cách: Cân chính xác 1.2g Casein cho vào cốc có mỏ, thêm dung dịch đệm phosphat pH 7,5 vừa đủ lOOml Đun cách thuỷ trong 60 phút, vừa đun vù’a khuấy, lọc qua gạc, pH cuối cùng của đung dịch là 7,2

Chú ý: dung dịch casein chỉ pha đùng trong 1-2 ngày và phải được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đùng phải lắc đều

b) Protid lòng trắng trứng gà (LTTG)

Dung dịch LTTG 2,4% được điều chế như sau: Cân 2,4g lòng trắng trứng

gà sống, cho một ít NaCl 0,9% vào hoà tan sau đó cho vừa đủ lOOml, khuấy đều Đun sôi cách thu ỷ, lọc qua gạc thu được lòng trắng trứng chín

c) Protid lợn

Dung dịch thịt lợn 2% được điều chế như sau: Cân 2g thịt lợn sống, nghiền trong cối cho mịn thêm vừa đủ lOOml đung dịch đệm phosphat pH 7,5 Đun sôi cách thuỷ, đồng thể thu được địch thịt lợn chín

d) Protid cá

Dung dịch thịt cá 2% được điều chế như sau: Cân 2g thịt cá trôi sống, nghiền trong cối cho mịn thêm vừa đủ lOOml dung dịch đệm phosphat pH 7,5 Đun sôi cách thuỷ, đồng thể thu được địch thịt cá chín

e) Protid gà

Dung dịch thịt gà 2% được điều chế như sau: Cân 2g thịt gà sống, nghiền trong cối cho mịn thêm vừa đủ lOOml dung dịch đệm phosphat pH 7,5 Đun sôi cách thu ỷ, đồng thể thu được clịch thịt gà chín

f) Protid bò

Dung địch thịt bò 2% được điều chế như sau: Cân 2g thịt bò sống, nghiền trong cối cho mịn thêm vừn đủ lOOml dung dịch đệm phosphat pH 7,5 Đun sôi cách thuỷ, đổng thể thu được dịch thịt bò chín

Nước cất vừa đủ 1 OOml

d Dung dịch acid tricloacetic 10%

i Dung dịch NaCl 0,9%

Nirớc cất vừa đủ ỈOOOml

3.1.1.4 Dụng cụ

- Máy đo quang Photomel 722 (Trung Quốc)

- Máy li tâm EBA 12 Hettich (Nhạt Bản)

- Máy điều nhiệt (Đức)

3.1.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

Trong quá trình nghiên cún chúng tôi sử đụng kỹ thuật, định lượng protein bằng phản ứng Biure[4]

3.1.2.1 Nguyên tác định lượng Protein: Cho tác đụng với C1 1SO4 và NaOH,

protein (có liên kết peptid) tạo thành phức chất màu tím hồng Đo quang phổhấp thụ, so với biểu đồ mẫu để định lượng protein Xây dựng biểu đồ mẫu định lượng proteiủ bằng phản ứng Biure

Cân 10g Albumin tinh khiết, hoà tan với dung dịch NaCỈ 0,9% vừa đủ lOOml để có dung dịch 10% Từ đó pha thành các dung dịch Albumin có nồng

độ L%-10%, thực hiện phản ứng như sau

Hệ số proteinK= Nồng độ protein ( mg/rnl) Kcinidn =22,1.8

DNồng độ protein=Kchl)ẩnxD

3.Í.2.2 Phương pháp xác (lịnh hoạt ctộ cn/ym

a Nguyên tắc xác định: lấy chính xác lượng protein, dưới tác dụng của enzym, prolein bị thu ỷ phAn giải phóng ra các peptid có các acid amin Xác định lượng protein còn lại bằng cách tủa với acid tricloacetic Tủa này phản

ứng với thuốc thử Gornall tạo thành màu tím hồng Đo quang phổ hấp thụ ở

bước sóng ở Ằ=530nm

b Kỹ thuật tiến hành

+ Pha loãng men đến độ pha loăng thích hợp

Đối với pepsin: pha loãng trong HC1 0,4%

Đối với pancreat in: pha loãng trong NaCl 0,9%