Bước đầu đánh giá độ ổn định hoạt tính protease trong chế phẩm chứa papain, pancreatin, pepsin

TRƯỜNG BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI B c ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐỘ Ổn ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE TRONG CHÊ PHẨM CHỨA PAPAIN, PANCREATIN, PEPSIN ❖ ( KHỐ LUẬN TỐT NGIỈIỆP DUỢC SỸ ĐẠI IIỌC KHỐ 1995-2000) Ngỉíồi thực : Trần Thị Thu Trang Người hưởng dẫn : PGS-TS Nguyễn Xn Thắng DS Nguyễn Văn Rư Noi thực : Bộ mơn Hố Sinh - Vi Sinh Thời gian thực : 0110312000 - 1510512000 9-OV IIÀ NỘI - 05/ 2000 k L4ả$ ^ M ) ’3 Q cA m ƠQÍ ^i lồìiíỊ ỉiínlt ỉvọnq rừi lìièt ổn iâir iííe em xỉtt ('ít ân th n h âm tín í()Cị(S - CTtV Qlfjaựễn (Ầulân < r7ft(íiwj, iMỊiiòi (tã tận tìn h giúp, em tro n g Mttêí q u f rìu ti m thu'ọ ttựítỉêitt tỉ ti ỈKìiin Ỉỉtàitỉt íưĩn Uhúá ín âti Híiự rí)ồn(Ị thài, em xỉn tâtt th n h ềm Ưu rJ)t$ Q tguụln (Ị)ản (Qti, II(/un! ĩtã h ỗ teỢ q iú p itđ ent trúng, su ối q u trình, m thực, n g h iê m Q ĩhâit riìp n ụ em cũng, arỉtt (T'íoe editi đu cáe tỉiẩ ụ , ê g iá o ỉrtìttg bê m ỏ tì rSittỉi, itíìa hiei lít t)âl ếe íf)h n t 'xĩht rĩh a n lt r/ ) t i lửíittỊ, Oiỉtỉ í7Af' íTCỈm (¥ìuụĩin , Q ĩqtụiễit 'Ỹĩtti iTCíiau/i (Tã ỉạtì itĩềtt kiện tỉỉitậ n lọ t v ề p h đ ttg tiên, k ỹ th u ậ t (fiáp đỡ' em lì ồn tỉià íth kh ú itiậtt n ỉ/ £ m x ỉn eỉtứa ếa th ầ y , d i d o iứ e kỉtơẻ, đ q t đươe tthỉều th n h tích í von (Ị qỉảniỊ dợụ tm nghiến cứu hlw a ítọtu 7/5Ờ Q ĩồỉ ttgàụ : 15 thán g, n ă m 0 Sinh, lùên < 7Jrần < Phần IV - Kết luận 31 PHẦN I ĐẶT VÂN ĐỂ Tiêu hố hấp thu hai q trình quan trọng xảy máy tiêu hố Thức ăn muốn hấp thu vào thể tốt tnrớc hết phải tiêu hố Đó q trình thuỷ phân thức ăn thành chất dinh dưỡng, biến thức ăn từ dạng cấu tạo phức tạp thành dạng đơn giản, thể sử dụng Sự tiêu hố thức ăn ảnh hưởng trực tiếp đến tình trạng sức khoẻ đặc biệt thức ăn nghèo chất dinh dưỡng khả tiêu hố thể việc tăng cường tiêu hố vấn đề cần thiết Ở nước ta năm gần đây, tình hình sức khoẻ chế độ dinh dưỡng cải thiện, song tỷ lệ suy dinh dưỡng (SDD) trẻ em CỊ11 cao Suy dinh dưỡng có nhiều ngun nhân ăn uống ngun nhân chủ yếu Ngồi việc chế độ ăn thiếu protein thiếu hiểu biết bà mẹ dinh dưỡng, sức khoẻ kiến thức ni ngun nhân quan trọng gây SDD (lẻ em Chính vậy, dù chế độ ăn đầy đủ protein cách cho ăn khơng hợp lý khiến trẻ bị rối loạn tiêu hố khơng hấp thu thức ăn, cuối dẫn đến SDD Khi trẻ bị suy dinh dưỡng hàm lượng men tiêu hố giảm gây ảnh hưởng tới khả tiêu hố hấp thụ chất dinh dưỡng protein Do việc dùng thuốc có chứa men tiêu hố giúp cho trẻ tiêu hố tốt thức ăn kích thích trẻ ăn ngon cần thiết việc phòng chống SDD Thực tế cho thấy, nhiều chế phẩm chứa enzym pepsin viên, a chymotrypsin, trypsin viên có hiệu tốt Song vấn đề đặt phối hợp enzym chế phẩm làm tăng cường tác dụng chúng hay khơng Để góp phần nghiên cứu vấn đề chúng tơi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng lẫn số protease có nguồn gốc khác bước đầu đánh giá độ ổn định hoạt tính chúng chế phẩm hỗn hợp mức độ phân giải protid từ nguồn đạm khác dùng làm thức ăn Đề tài góp phần nhỏ làm sở cho việc bào chế dạng thuốc kết hợp enzym điều trị, góp phần vào chương trình phòng chống suy dinh dưỡng Việt Nam PHẦN II TỔNG QUAN 2.1.Tình hình suy dinh dưỡng Suy đinh dưỡng vấn đề quan trọng việc nâng cao sức khoẻ trẻ em nước phát triển nói chung đặc biệt Việt Nam Đó tình trạng bệnh lý xảy chế độ ăn nghèo protein- V lượng làm ảnh hưởng đến phát triển thể chất tinh thần trẻ Để có biện pháp phòng điều trị SDD thích hợp, tác giả sâu tìm hiểu ngun nhân gây trẻ em Ngun nhân gây SDD có vSDD nhiều bật số ngun nhân sau: + SDD chế độ ăn thiếu protein: Ở lứa tuổi nhỏ nhu cầu protid acid amin cần thiết trẻ cao Sở dĩ nhu cẩu cao để đảm bảo cho phát triển nhanh thể trẻ Nguồn protid phải cung cấp từ thức ăn protid động vật có chất lượng cao như: trứng, sữa, thịt Tại nước phát triển, thức ăn dùng cho trẻ mẹ thiếu sữa thức ăn thời kỳ cai sữa chủ yếu gạo, bột mỳ, ngơ, ỉiía mạch Các loại thức ăn có nhiều lượng thiếu protid, mặt khác protid ngũ cốc có chất lượng thấp so với protid động vật *Nhu cẩu phát triển thể mạnh, đòi hỏi số lượng thức ăn phải nhiều, chất lượng thức ăn phải cao Nếu phần ăn trẻ thiếu số lượng chất lượng kéo dài làm cho trẻ bị SDD nặng + SDD nhiễm khuẩn: Các bệnh nhiễm khuẩn ngun nhân trực tiếp dẫn đến SDD tử vong cao trẻ em như: ỉa chảy, sốt xuất huyết, viêm phổi, viêm phế quản Khi bị nhiễm khuẩn đặc biệt có sốt cao, thể tiêu hao nhiều lượng chất dinh dưỡng, giảm cảm giác thèm ăn, tiêu hố hấp thu kém, mức cung cấp chất dinh dưỡng khơng đủ đáp ứng nhu cầu thể dẫn đến trẻ bị SDD Ngồi trẻ bị bệnh tiêu hố như: ỉa chảy, nơn, ăn, bà mẹ lại bắt C011 kiêng khem khơng cho ăn thức ăn thiếu chất kéo đài nên làm cho trẻ bị SDD + Thiếu hiểu biết đinh dưỡng sức khoẻ: Sự thiếu hiểu biết dinh dưỡng phổ biến, nước phát triển, trình độ dân trí thấp Một số bà mẹ thiếu kiến thức ni theo khoa học Viện BVBMTE đến kết luận 60% trẻ em bị SDD gia đình thiếu hiểu biết ni Đa số bà mẹ khơng biết nhu cầu dinh dưỡng cao trẻ năm đầu để đảm bảo cho phát triển mạnh nên cho ăn thiếu chất, khơng biết cho ăn hợp lý để đảm bảo cho trẻ đủ chất dinh dưỡng Do có bà mẹ có điều kiện kinh tế tốt vãn bị SDD Ngồi số ngun nhân khác gây tình trạng SDD trẻ em vấn đề kinh tế phát triển, thu nhập thấp vệ sinh mơi trường Khi trẻ bị SDD, loạt quan (rong thể bị tổn thương như: gan, tim mạch, não, hệ thống thần kinh, hệ thống miễn dịch, tiêu hố Trong quan tiêu hố có biểu bị tổn thương sớm lõ rệt Các tế bào tuyến niêm mạc ruột bị teo, hàm lượng men tiêu hố giảm, gây ảnh hưởng tới khả tiêư hố hấp thu chất dinh dưỡng protein Do việc sử dụng men tiêu hố khâu khơng thể thiếu phòng chống SDD bệnh thiếu vi chất dinh dưỡng, bệnh mạn tính bệnh mạn tính đường tiêu hố hội chứng hấp thu Các hỗn hợp men tiêu hố thực phẩm chủ yếu chứa loại: - Amylase (enym t-iêu hố chất bột) - Lipase (enzym tiêu hố lipicl) - Protease (enzym liêu hố protein) Nó định chủ yếu cho trẻ ăn khơng tiêu, rối loạn tiêu hố, đầy chướng bụng sau ăn hay bú, tình trạng biếng ăn trẻ nhỏ, trẻ SDD Hướng giải nhằm chống SDD đặt dùng chế độ ăn hợp lý, Ihức ăn dỗ tiơu hố dặc biộl cíin bổ sung cnzym liơu hí từ ngồi vào để giảm tỷ lệ SDD trẻ etn đưới tuổi xuống 30%[3] năm 2000 khơng trẻ bị SDD nặng 2.2.Protease 2.2.1 Sơ lược Protease Protease thuộc loại enzym hydrolase[l] Nhóm gồm có 471 enzym tồn hệ thống phân loại 1862 enzym[2] v ề số lượng loại đứng thứ sau enzym oxy hố-khử có nhiều chế phẩm đươc^sử đụng y dược học Trong loại này, nhóm enzym protease có số lượng lớn với 128 enzym[2] nghiên cứu Trong khố luận chúng tơi nghiên cứu loại protease có chứa chế phẩm pancreatin, pepsin, papain Đây protease dùng làm men tăng cường tiêu hố sử đụng chương trình phòng chống suy dinh dưỡng 2.2.2 Pcpsin Pepsin giữ vai trò quan trọng q trình tiêu hố Pepsin enzym thuỷ phân protein nghiên cứu từ lâu Người ta xác định chất, cấu trúc, trọng lượng phân tủ' Ngày người ta biếl dạng pepsin là: Pepsin A, B, c , D tương ứng với dạng tiền enzym Pepsinogen A, B, c , D Các enzym có khác chút cấu trúc đặc tính thuỷ phân protein hồn tồn giống Các pepsinogen liền enzym pepsin, tiết từ tế bào dày, Iihò' vai trò HC1 dày pepsinogen chuyển thành enzym hoạt động pepsin Pepsin có trọng lượng phân tử 35.000, chuỗi polypeptid gồm 321 acid amin cấu trúc protein bậc nhờ cầu nối disulfua liên kết phosphal Pepsin iiồn lồn bồn pH 2-5, liên pH pepsin nhanh chóng hoạt tính chuyển ngược thành pepsinogen Các chế phẩm chứa pepsin từ lâu sử dụng rộng rãi y học, chăn ni cơng nghiệp thực phẩm Trong chăn ni chất kích thích tiêu hố giúp vật ni mau tăng trọng, giảm chi phí Trong y học pepsin dùng làm thuốc giúp tiêu hố thức ăn protid có thịt, trứng, sữa dùng cho người có chức tiêu hố kém, trẻ em bị suy dinh dưỡng Các biệt dược chứa pepsin sử dụng phổ biến nhiều nơi + Sản phẩm nước[8]: - Viên nén Pepsin 0,05g Viện dinh dưỡng - Viên nén Pepsin-Bl có chứa 0.05g pepsin 0,05g vitamin BI HATAPHAR + Sản phẩm nước ngồi[11 ]: - Acipepsol(Tiệp): viên nén Thành phần(TP): 400 mg betain clorid mg pepsin Chỉ định (CĐ): Các chứng giảm tiết HCL dịch vị, đầy bụng, chậm tiêu, phối hợp trị thiếu máu thiếu Fe - Librozym Plus(Kypharco): viên bọc đường TP: Diastase 200mg, Pancreatin lOOmg, pepsin 50mg, Simethicone 50mg CĐ: Điều trị rối loạn tiêu hố, khó tiêu, no hơi, khó chịu sau ăn Pepsinogen có cấu trúc sau: H ìnhl Cấu trúc phân tử Pepsỉnogen 2.2.3 Pancreaỉin Pancreatin sản phẩm chiết suất từ tuyến tuỵ động vật có vú (bò,cừu ) có chứa enzym protease, lipase amylase Pancreatin thuỷ phân chất béo (liành glycerol acid béo, chuyển hồ linh bột thành dextrin đường, chuyển protein thành chuỗi polypeptid ngắn thành acid amin, khả thu ỷ phân protein trọng nhiều Người la biết pancreatin có chứa enzym sau: Trypsin a Chymotrypsin A B Eslastase (tên khác: pancreatopetidase E) Cacboxypeptidase A Ỹ Cacboxypcpl idasc A / ' Lợxinaminopeptidase Ribonuclease Deoxyribonuclease a Amylase ĨO.Lipase Trong số emzym trên, enzym 1,2,3 coi quan trọng hơn, chúng thuộc nhóm Serinprotease Nhóm có số tính chất chung bị ức chế Diisopropyl phosphoro-fluoi'idat (D.P.F), chất phản ứng với nhóm hydroxyl 1'iêng liên kết serin điểm hoạt động enzym Chúng Ihuỷ phân prolein theo kiểu Enclopepticlase[2], tất enzym chứa nhóm ImidazoI điểm hoạt động Các chế phẩm pancreatin sử dụng lộng rãi ỏ' nhiều nước, nước ta chế phẩm hồn tồn nhập từ nước ngồi sử dụng lộng rãi điều trị chứng lối loạn tiêu hố, suy tụy ngoại tiết, viơm tụy mãn, di chứng sau cắt tụy, cắt dầy Một số chế phẩm chứa pancreatin[l 1]: + Nutrizym(I.ndonexia): viên nén bọc đường TP: Bromelin, pancreatin, mật bò CĐ: Triệu chứng lơi loạn tiêu hố, suy tuỵ ngoại tiết Chế phẩm gồm phần papain + phần pepsin Trộn đều, nghiền mịn, bảo quản lọ nút kín, bọc lần túi nilon 3.2.1.6 Chế phẩm phối hợp pepsin - pancreatin: Chế phẩm hỗn hợp gồm phần pepsin + phần pancreatin Trộn đều, nghiền mịn, bảo quản lọ nút kín, bọc lần túi nilon 3.2.1.7 Chế phẩm phối hợp papain - pepsin - pancreatin: Chế phẩm bột có tỉ lệ men I: l : 1, gồm phần papain + phần pepsin + ỉ phần pancreatin Trộn đều, nghiền mịn, bảo quản lọ nút kín, bọc lần túi nilon 3.2.2 Ảnh hưởng pH tói hoạt độ protease chê phẩm Đường tiêu hố đường dùng thuốc phổ biến tiện dùng gần với sinh hoạt tự nhiên cuả bệnh nhân Tuy nhiên lại có bậc thang pH thay đổi (pH 1-8) Nó ảnh hưởng tới hoạt độ protease chế phẩm Để thấy rõ khả ảnh hưởng độ ổn định hoạt tính protease chế phẩm theo pH, chúng tơi tiến hành khảo sát khả thuỷ phân papain, pancreníin casein khn llmỷ phân pepsin lòng trắng trứng điều kiện pH 2; 4; 7,5; 8,5 Thời gian ủ men pH 30 phúl sau liến hành xác định hoạt độ chúng nhu' phương pháp nêu, thời gian xúc tác thuỷ phân 30 phút, nhiệt độ 37° c Kết thu trình bày bảng 1,2,3ĩìảng l : Ảnh hưởng p ỉ ĩ lói hoạt (ỉộ Papain cấc chê phẩm PH 7,5 8,5 Hoạt tính protease (nKat/mg protein) Papain +Pepsin Papain Papain Papain +Pepsin H-Pancreatin +Pancreat.in 9,84 8,47 7,77 10,02 36,45 36,29 46,37 1,5 46,05 43,75 34,28 22,59 27,61 33,28 24,75 18.0! 18 Ghi chú: Kết trơn giá trị trung bình lần thí nghiệm điều kiện tiến hành Kết bảng cho thấy, papain hoạt động tốt pH - 7,5 Khi phối hợp papain với pepsin cho kết tốt pH Khi papain pancreatin phối hợp với cho kết tốt pH 7,5 Đặc biệt phối hợp ba protease với cho kết đồng pH - 7,5 đồng thời hoạt tính protease lăng từ 34% đến 48% Iỉảng2: Ảnh hưởng c ủ a p ĩl íỏỉ hoạt độ Pancreatin chê phẩm PH 7,5 8,5 Hoạt tính protease (nKat/mg protein) Papain +Pepsin Pancreatin Pancreatin Papain +Pancreatin +Pancreatin +Pepsin 3,23 9,41 8,75 2,66 26,52 26,32 17,79 18,33 39,7 31,43 33,52 26,74 19,21 8,84 6,87 18,45 Ghi chú: Kết ỉrơn giá (rị trung bình lán thí nghiệm điều kiện liến hành Kết bảng cho thấy pancrealin hoạt động tốt pH 7,5 Tuy nhiên hoạt tính pancreatin chế phẩm hỗn hợp lại giảm so với chế phẩm đơn Do khơng có mặt chất hoạt hố cystein nên coi papain hỗn hợp khơng thể hoạt tính Như pepsin ảnh hưởng làm giảm hoạt tính pancreatin chế phẩm hỗn hợp Iỉảng3: Ảnh hưởng p l l tói hoại dộ Pepsỉĩi cắc ch ế phẩm PH Pepsin 7,5 8,5 55,61 45,99 10,55 3,86 % Protein bị thuỷ phân Pepsin Papain +Pepsin Papain +Pepsin +Pancreatin +Pancreatin 49,76 52,2 51,22 45,78 43,04 43,46 10,97 13,08 15,19 6,01 11,16 2,15 19 Ghi chú: Kế( trơn ]à giá trị (rung bình lẩn thí nghiệm diéu kiộn tiốh hành Kết bảng cho t.hâ'y pepsin hoạt động tốt vùng pH aciđ tối ưu pH Do tiến hành xác định khả Lhuỷ phân pepsin lòng trắng trứng gà biến tính mơi trường acicl nên papain pancreatin gần khơng hoạt động khơng ảnh hưởng tới hoạt tính pepsin Ảnh hirỏìig nhiệt độ tói hoạt độ protease chế phẩm 3 Mỗi protease có nhiệt độ thích hợp cho thuỷ phân protein Vì hoạt độ protease phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ Để thấy rõ ảnh hưởng nhiệt độ tới khả thuỷ phân protein protease chế phẩm đơn chế phẩm hỗn hợp, chúng tơi tiến liànli khảo sát khả Ihuỷ phân pnpnin vh pancreatin đối vói cnsein, khả thuỷ phân pepsin lòng trắng trứng biến tính, điều kiện nhiệt độ khác Thời gian ủ men nhiệt độ 15 phút Sau tiến hành xác định hoạt độ chúng phương pháp nêu, thời gian xúc tác Ihuỷ pliAn 30 phút, nhiột độ 37° c Kết trình bày bảng 4,5,6 I5ảng4: Ảnh hưởng nhiệt độ tói hoạt độ Papain ch ế phẩm Nhiêt (°C) ' 50 60 70 80 90 Hoạt tính protease (nKat/mg protein) Papain +Pepsin Papain Papain Papain +Pepsin +Pancreatin +Pancreatin 20,23 22,49 18,61 13,73 5,69 19,75 22,92 1.8,11 13,2 3,22 25,13 26,19 23,55 18,73 1,26 25,86 26,63 20,41 13,64 3,87 Ghi chú: Kếl Irơn giá trị trung bình lần thí nghiệm điều kiện liến hành 20 Kết bảng cho thấy 60 ° c hoạt độ papain chế phẩm cao sau giấm dần nhiệt ctộ tăng lên Đến 90 ° c thl hoạt độ papaỉn thấp Ở 50 ° c chế phẩm có mặt pancreatin hoạt độ protease chế phẩm cao xấp xỉ so với nhiệt độ 60 c Bảng5: Ảnh hưởng nhiệt độ tói hoạt độ Pancreatin chế phẩm Nhiêt (°C) Hoạt lính protease (nKal/mg protein) Papain Pancreatin Pancreatin Papain +Pepsin +Pancreatin +Pepsin +Pancreatin 50 60 70 24,96 16,23 4,34 10,91 7,69 22,23 ,5 14,37 6,98 ,8 ,8 ,5 Ghi clul: Kếl Irơn giá trị trung hình lán thí nghiệm điồu tiến hành Kết cho thấy hoạt độ pancreatin 50 °c chế phẩm ]à cao nhất, sau giảm dần gần hoạt tính nhiệt độ 70°c Tuy nhiên Uong chế phẩm có phối hợp pancreatin pepsin hoạt độ pancrcalin bị giam Iihiồu so vói chế phám pancrcalin đơn chố phẩm chứa papain - pancrentin Bảng 6: Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ Pepsin ch ế phẩm Nhiêt (°C) 40 50 60 70 Pepsin 51,04 51,91 13,92 4,12 % Pro tein bị thuỷ phân Papaỉn +Pepsin Papain Pepsin +Pancreatin +Pepsin +Pancreatin 51,74 49,65 48,49 49,84 56,49 51,15 11,49 10,13 11,9 2,12 2,45 1,36 Ghi chú: Kết giá trị trung bình lần thí nghiệm điều kiện liến hành Kết bảng cho thấy khả thuỷ phân lòng trắng trứng gà biến tính pepsin chế phẩm 40° - 50°c cao đặc biệt ln chế 21 phẩm phối hợp papain - pepsin 50°c Đến 70 ° c pepsin gần hết hoạt tính 3.2.4 Khả thuỷ phân protease chế phẩm với protein có sơ loại thực phẩm thường (lùng đòi sống ngưòi Việt Nam Trỏ bị suy dinh dưỡng cẩn cung cấp đáy đủ loại protid đặc biệt protid động vật Hơn loại protid phải loại dễ tiêu, dễ hấp thu Do ngồi casein lòng trắng trứng, để thấy rõ ảnh hưởng lẫn tới khả thu ỷ phân protein protease chế phẩm đơn chế phẩm hỗn hợp, chúng tơi tiến hành sử dụng số chất khác gần gũi với thức ăn hàng ngày protid thịt lợn, thịt gà, thịt bò thịt cá Dịch p ro t.ein sử dụng nghiên cứu ià đung dịch bị biến tính Khả thu ỷ phân proticl papain, pancreatin, pepsin tiến hành phương pháp nêu, thời gian thực phản ứng 30 phút nhiệt độ 37°c Kết trình bày bảng 7,8,9 Iỉảng 7: Mức độ thuỷ phân số' loại proteỉn Papain chê phẩm % Protein bị thuỷ phãn Cơ chất Papain Papain 4-Pepsin Papain +Pancreatin Papain +Pepsin +Pancreatin Casein Protid lợn Protid gà Protid bò Protid cá 72.74 22.3 28.6 30.7 37.76 72.41 29.12 33.08 31.47 41.83 90.97 26.9 34.9 39.7 54.12 91.95 29.26 37.86 43.53 63.94 Ghi clní: Kếí qt trơn giá trị (rung hình lẩn (hí nghiệm điồu kiộn liến hành 22 Kết biểu diễn saư: 100 e protid gà —> protid lợn Trong chế phẩm pancreatin đơn chế phẩm phối hợp pancreatin papain có mức độ thuỷ phãn loại protiđ cno so với chơ pliíĩm cồn lại Đicii chửng íỏ ảnh hưởng pepsin pancreatin Nó làm giảm hoạt tính pancreatin chế phẩm phối hợp Iĩảng9: Mức độ thuỷ phân sếloạỉ proteỉn Pepsỉn ch ế phẩm Cơ chất Pepsin Casein Prolid lợn Piotid g Protid bò Protid cá 27.37 36.18 42.64 52.68 89.15 % Protein bị thuỷ phân Papain Pepsin Papain +Pepsin +Pancreatin +Pepsin +Pancreatin 25.13 22.2 21.17 35.74 36.47 33.53 40.02 44.55 43.15 45.76 53.78 43.08 66.51 75 65.57 Glii chú: Kốl qua Irơn giá (rị (rung bình lẩn llií nghiộm Irong diồu kiộn tiến hành Kết biểu diễn sau : 100 □ Pepsin 4— ' o1— Q_ 20 > -► Protein 25 Hình : Mức độ thuỷ phân số loại protid Pepsỉn chế phẩm Chú thích :i Casein Protid lợn Prolid gà Protid bò Protid cá Kết hình cho thấy mức độ thuỷ phân pepsin chế phẩm với protid cá cao nhất, mức độ thu ỷ phAn protid bò, gà, lợn, đặc biệỉ casein thấp Điều giải thích giai đoạn đầu pepsin có lác dụng làm đơng tụ sữa hay casein 3.2.5 Theo dõi tính ổn định hoạt tính protease chế phẩm theo thòi gian Hoạt độ protease phụ thuộc vào nhiều yếu tố trình bày trên: pH, chất, nhiệt độ Ngồi phụ thuộc vào điều kiện bảo quản, thời gian bảo quản, chúng tơi xét đến độ ổn định hoạt độ protease theo thời gian bảo quản Để khảo sát yếu tố này, chúng tơi tiến hành theo dõi hoạt độ protease chế phẩm với thời gian tháng, 15 ngày xác định hoạt độ protease I lẩn phương pháp nêu Các chế phẩm bảo quản lọ thuỷ tinh nút kín, bọc lần túi nilon để hộp cát tơng nhiệt độ phòng Kết thu trình bày bảng 10, 11, 12 26 BảnglO: Hoạt độ Papain ch ế phẩm theo thời gian Thời gian (Ngay) 15 30 45 60 Papain 36,22 35,5 35,3 35,28 34,97 Hoạt tính protease (nKat/mg protein) Papain Papain +Pepsin Papain +Pepsin +Pancreatin +Pancreatin 43,65 49,22 39,36 36,9 42,99 49,15 34,7 48,8 40,59 40,15 47,29 34,32 33,94 46,58 39,84 Ghi chú: Kết trơn giá trị trung bình lần thí nghiệm điều kiện tiến hành Kết bảng 10 cho thấy, theo thời gian bảo quản hoạt độ papain chế phẩm có giảm khơng đáng kể Giảm nhiều chế phẩm phối hợp thành phần, tới 8% so với hoạt tính ban đầu lỉản gll: Hoạt độ Pancreatin ch ế phẩm theo thơi gian Hoạt tính protease (nKat/mg protein) Papain +Pepsin Papain Thời gian Pancreatin Pancreatin +Pancrca(.in -l-Pcpsill +Pancreatm (Ngày) 30,88 40,02 36,5 32,41 26,86 30,93 35,36 39,98 15 34,18 24,22 39,97 27,08 30 24,12 39,74 24,88 45 33,32 32,14 23,86 22,57 39,25 60 Ghi chú: Kết trơn giá Irị trung hình lần thí nghiệm điều kiện liến hành Kết cho thấy hoạt độ pancreatin chế phẩm đơn chế phẩm phối hợp với papain giảm khơng đáng kể Nhưng hoạt tính pancreat.in chế phẩm phối hợp với pepsin phối hợp thành phần giảm đáng kể tù' 22%-30% Như pepsin có ảnh hưởng tới hoạt độ pancreatin theo thời gian 27 Iĩảngl2: Hoạt độ Pepsỉn chế phẩm theo thời gian Thời gian (Ngày) 15 30 Pepsin 45 53 60 52,28 57,76 56,2 54,82 % Protein bị thu ỷ phân Papain Pepsin Papain +Pepsin +Pepsin +Pancreatin +Pancreatin 55,2 53,83 56,19 45,92 51,5 49,36 46,25 43,54 ,9 ,7 ,9 40,94 36,42 38,52 32,49 Ghi chú: Kếl trơn giá trị trung bình lẩn thí nghiệm diồu kiộn tiến hành Kết bảng 12 cho thấy hoạt độ pepsin chế phẩm đơn giảm khoảng 9%, lại hoạt độ pepsin chế phẩm phối hợp giảm đáng kể từ 30%-39% Điều chứng tỏ điều kiện bảo quản bình thường hoạt độ pepsin bị giảm nhanh 3.3 BÀN LUẬN 3.3.1 Độ ổn định hoạt tính Protease chế phẩm Chế phẩm có chứa pepsin, papain pancreatin hỗn hợp loại protease có nguồn gốc điều kiện hoạt động khác Pepsin hoạt động mơi trường pH acid, papain hoạt động mơi trường pH trung tính pancreatin hoạt động ỏ' mơi trường pH kiềm nhẹ Hơn pepsin pancreatin có nguồn gốc lù' dày tụy động vật có vú pnpnin có nguồn gốc (ừ nhựa mủ đu đủ xanh thuộc loại protease thực vật Ở chúng thử nghiệm với chế phẩm ủ mơi trường pH khác lừ vùng acid đến kiềm nhẹ khoảng thời gian định Các số liệu cho thấy sau 30 phút, pH ngồi pepsin la thấy papain pancreatin tồn (ại hoạt tính protease cuả chúng hoạt tính có bị giảm Dựa vào kết bảng 1, 2, cho độ giảm hoạt tính papain mơi trường acid độ giảm hoạt tính pancreatin 28 cơng pepsin Nhìn chung pH từ đến 7,5 hoạt tính protease chế phẩm đạt ìnức độ cao ổn định hổn thay đổi khoảng thời gian ủ Đặc biệt pH 8,5 pancreatin papain sau thời gian ủ có hoạt độ tương đương với vùng pH 7,5 Pepsin bị vơ hoạt vùng pH sau đua Irở pl l (ối ưu (hì có phẩn hoạt tính phục hổi Điều clo pepsin kết hợp với chất Inhibitor (chất ức chế) pH 8,5 hoạt hố trở lại pH Còn chế phẩm thành phần mức độ bị ảnh hưởng gần giống chế phẩm đon Riêng chế phẩm phối hợp pepsin - pancreatin hoạt tính pancreatin ln bị giảm so với chế phẩm đơn Điều ảnh hưởng pepsin đến hoạt tính pancreatin Mỗi protease có nhiệt độ thích hợp cho thuỷ phân protein Thử nghiệm tính bền nhiệt cuả protesaeJ:rong chế phẩm nhiệt độ khác kết cho thấy chế phẩm hỗn hợp có thích nghi với khoảng nhiệt độ rộng chế phẩm bột ngun liệu thành phần Theo thời gian bảo quản nghiên cứu thấy hoạt tính protease chế phẩm đặc biệt chế phẩm hỗn hợp có giảm Tuy nhiên kết bước đầu đánh giá độ ổn định hoạt tính protese theo thơi gian điều kiện bảo quản bình thường nhiệt độ phòng, lất nhiều yếu tố cần nghiên cứu tiếp độ ẩm, ánh sáng 3.3.2 Khả íiêu protein Protease chế phẩm Các chế phẩm đơn chế phẩm hỗn họp protese^ có khả phân giải nhiều loại protid thực phẩm hàng ngày người Việt Nani Mức độ thuỷ phân giảm dần theo thứ tự chất: casein —» protid cá —> protid bò —> protid gà -> protid lợn Điều cho thấy sữa vãn nguồn thức ăn tốt trẻ đặc biệt với trẻ bị vSDD ngồi sữa mẹ cho trẻ ăn thêm sữa bò Với loại protid khác cá nguồn dinh dưỡng tốt, dễ thu ỷ phản 29 có lợi cho trẻ bị SDD, hạn chế thức ăn khó tiêu lòng trắng trứng thời thức ăn trẻ cần làm nhỏ, đun chín 3.3.3 Kết luận chung Việc kết hợp protease có tác dụng hỗ trợ tiêu hố, chúng có khả thu ỷ phân nhiều loại prolein bữa ăn hàng ngày Với kỹ thuật bào chế việc tạo chế phẩm kết hợp protease thay cho chế phẩm đơn protease mà lại cho tác dụng tốt phải ăn tăng protein chế độ phục hồi SDD, khơng phải tăng liều, tránh tác đụng phụ trẻ em Trong chế phẩm hỗn hợp nghiên cứu, chúng tơi thấy hỗn hợp papain với pepsin papain với pancreatin có độ ổn định hoạt tính cao, có tác dụng hiệp đồng với nên đưa chế phẩm có chứa loại protease vào chương trình phòng chống SDD Riêng chế phẩm chứa pepsin với pancrcatin chế phắm chứa thành phẩn, ảnh hưởng pepsin tới giảm hoạt tính pancreatin việc kết hợp loại protease vói (rong chế phẩm hỗn hợp dạng bột líl khơng nơn Tuy nliiơn sử dụng kỹ thuật vi nang để tránh ảnh hưởng nhằm tạo chế V"phẩm hỗn hợp enzym có lác dụng hỗ trợ tiêu hố suốt từ dày tới ruột 30 PHẦN IV KẾT LUẬN # Từ loại chế phẩm protease bột pepsin, papain panrceatin phối họp để tạo loại hỗn hợp protease dạng bột Đã thử nghiệm chế phắm nghiên cứu số mơi trường pH khác (pH 2; 4; 7,5; 8,5) Kết cho thấy hoạt độ protease bị ảnh hưởng pH khác nhau, ỏ mơi trường pH - 7,5 loại protease có hoạt độ bị ảnh hưởng so với ò pH 8,5 Hoạt độ protease chế phẩm nghiên cứu hỗn hợp tạo bị ảnh hưởng nhiệt độ tương tự bột ngun liệu ban đầu Mức độ thuỷ phân số protid thực pliẩm thường dùng người Việt Nam protease chế phẩm nghiên cứu có khác loại chế phẩm chất Nhưng hoạt độ protease chung hỗn hợp có kết cao hoạt độ hàm lượng chế phẩm ngun liệu đầu Mức độ thu ỷ phân giảm theo chất: casein —* protid cá —> protid bò —> protid gà —» protid lợn Hoạt độ protease chế phẩm dạng bột có giảm thời gian theo dõi đặc biệt pepsin, panc-reatin chế phẩm hỗn hợp Chế phẩm bao gồm pepsin + pancreatin + papain (1:1:1) có khả hoạt động vùng pH acicl, (rung tính kiồm nhẹ Đây sở cải tiến quy (rình tạo chế phẩm hỗn họp enzym ứng dụng để phục hồi SDD đạt hiệu tốt 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Iĩách khoa tồn thư bệnh học , Tập - Trung tâm biên soạn từ điển Bách khoa Việt Nam, 1994, trang 260 - 263 Hố sinh 1, II - Bộ mơn Hố sinh, vi sinh , Trường Đại học Dược Hà Nội 1996 , trang 36-61 ( tập ) , trang 128 - 175 ( lộp 2) Tình hình dinh dưỡng chiến lược hành động Việt Nam ( 1998)Cơng trình Hội nghị khoa học taị Viện dinh dưỡng quốc gia , trang 134 Vũ Đình Vinh, Đặng Thanh Phức, Đỗ Đình Hồ - Kỹ T huật y sinh hố Trường Đại Học qn y 1974 - trang 222-224, 295-397, 571-572 Đỗ Tất Lợi - Những thuốc vị thuốc Việt Nam - Nhà xuất y học Hà Nội 1991 , trang 300, 412 Nguyễn Xn Thắng - Các yếu tố ảnh hưởng đến trạng thái hoạt động VÌ1 khơng hoạt động protease thực vật dùng làm thuốc - Tạp chí Y học Việt Nam số -1997, trang 44 - 50 Nguyễn Xn Thắng - Sự biến dạng phân tử tính chất protease thực vật dùng IÙĨ11 thuốc - Hội nghị khoa học cơng nghệ - Trường Đại học Dược Hà Nội - 1998, (rang 94 - 98 Đỗ Thị Thanh, Chun luận chế phẩm enzym dùng điều trị, 1993, trang 13 - 14 Kiinmel, J.R and Smith, E.LxCrystalline papain , I.Biochan ( 1954) , page 207, 515 10 Enzyni nomenclature - Printed in the Netherland 1972 , page 242 I I MIMS Việt Nam ( 1997) Volume 2, number - page 29,30 [...]... hoạt độ pepsin trong chế phẩm đơn giảm ít nhất khoảng 9%, còn lại hoạt độ pepsin trong chế phẩm phối hợp đều giảm đáng kể từ 30%-39% Điều đó chứng tỏ ở điều kiện bảo quản bình thường hoạt độ pepsin bị giảm rất nhanh 3.3 BÀN LUẬN 3.3.1 Độ ổn định hoạt tính của các Protease trong các chế phẩm Chế phẩm có chứa pepsin, papain và pancreatin là hỗn hợp của 3 loại protease có nguồn gốc và điều kiện hoạt động... pancreatin gần như không hoạt động và không ảnh hưởng tới hoạt tính của pepsin Ảnh hirỏìig của nhiệt độ tói hoạt độ protease trong các chế phẩm 3 2 3 Mỗi protease đều có một nhiệt độ thích hợp cho sự thuỷ phân protein Vì vậy hoạt độ của protease phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ Để thấy rõ sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng thuỷ phân protein của từng protease trong chế phẩm đơn và chế phẩm hỗn hợp, chúng... cho thấy các chế phẩm hỗn hợp có sự thích nghi với khoảng nhiệt độ rộng hơn các chế phẩm bột nguyên liệu thành phần Theo thời gian bảo quản nghiên cứu thấy hoạt tính các protease trong các chế phẩm đặc biệt là trong những chế phẩm hỗn hợp có giảm Tuy nhiên đây chỉ là các kết quả bước đầu đánh giá độ ổn định hoạt tính của các protese theo thơi gian ở điều kiện bảo quản bình thường ở nhiệt độ phòng, còn... nhiệt ctộ tăng lên Đến 90 ° c thl hoạt độ papaỉn còn rất thấp Ở 50 ° c trong các chế phẩm có mặt pancreatin thì hoạt độ của protease trong chế phẩm cao xấp xỉ ở so với ở nhiệt độ 60 0 c Bảng5: Ảnh hưởng của nhiệt độ tói hoạt độ của Pancreatin trong các chế phẩm Nhiêt đô (°C) Hoạt lính protease (nKal/mg protein) Papain Pancreatin Pancreatin Papain +Pepsin +Pancreatin +Pepsin +Pancreatin 50 60 70 24,96... tốt nhất ở pH 7,5 Tuy nhiên hoạt tính của pancreatin trong các chế phẩm hỗn hợp lại giảm hơn so với trong chế phẩm đơn Do không có mặt chất hoạt hoá cystein nên coi như papain trong hỗn hợp không thể hiện hoạt tính Như vậy pepsin có thể đã ảnh hưởng làm giảm hoạt tính pancreatin trong chế phẩm hỗn hợp Iỉảng3: Ảnh hưởng của p l l tói hoại dộ của Pepsỉĩi trong cắc ch ế phẩm PH Pepsin 2 4 7,5 8,5 55,61 45,99... các chế phẩm 2 thành phần thì mức độ bị ảnh hưởng gần giống như các chế phẩm đon Riêng chế phẩm phối hợp pepsin - pancreatin thì hoạt tính của pancreatin luôn bị giảm so với chế phẩm đơn Điều này có thể do sự ảnh hưởng của pepsin đến hoạt tính pancreatin Mỗi protease đều có một nhiệt độ thích hợp cho sự thuỷ phân protein Thử nghiệm tính bền nhiệt cuả các protesaeJ:rong các chế phẩm ở các nhiệt độ khác... trôn là giá Irị trung hình của 3 lần thí nghiệm trong cùng điều kiện liến hành Kết quả trên cho thấy hoạt độ pancreatin trong chế phẩm đơn và trong chế phẩm phối hợp với papain giảm không đáng kể Nhưng hoạt tính pancreat.in trong chế phẩm phối hợp với pepsin và phối hợp 3 thành phần thì giảm đáng kể tù' 22%-30% Như vậy pepsin có ảnh hưởng tới hoạt độ của pancreatin theo thời gian 27 Iĩảngl2: Hoạt độ Pepsỉn... protein trong chế độ phục hồi SDD, không phải tăng liều, tránh được những tác đụng phụ nhất là đối với trẻ em Trong các chế phẩm hỗn hợp đã nghiên cứu, chúng tôi thấy rằng các hỗn hợp papain với pepsin và papain với pancreatin có độ ổn định hoạt tính cao, có tác dụng hiệp đồng với nhau nên có thể đưa chế phẩm có chứa 2 loại protease này vào trong chương trình phòng và chống SDD Riêng chế phẩm chứa pepsin. .. 5 Protid cá Kết quả hình 4 cho thấy mức độ thuỷ phân của pepsin trong các chế phẩm với protid cá là cao nhất, mức độ thu ỷ phAn protid bò, gà, lợn, đặc biệỉ là casein thì thấp hơn Điều này được giải thích rằng ờ giai đoạn đầu pepsin có lác dụng làm đông tụ sữa hay casein 3.2.5 Theo dõi tính ổn định hoạt tính protease trong các chế phẩm theo thòi gian Hoạt độ protease phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố... pH, cơ chất, nhiệt độ Ngoài ra còn phụ thuộc vào điều kiện bảo quản, thời gian bảo quản, ở đây chúng tôi chỉ xét đến độ ổn định hoạt độ protease theo thời gian bảo quản Để khảo sát yếu tố này, chúng tôi tiến hành theo dõi hoạt độ các protease trong các chế phẩm với thời gian 2 tháng, 15 ngày xác định hoạt độ các protease I lẩn như phương pháp đã nêu Các chế phẩm đều được bảo quản trong lọ thuỷ tinh ... 3.3.1 Độ ổn định hoạt tính Protease chế phẩm Chế phẩm có chứa pepsin, papain pancreatin hỗn hợp loại protease có nguồn gốc điều kiện hoạt động khác Pepsin hoạt động mơi trường pH acid, papain hoạt. .. gần khơng hoạt động khơng ảnh hưởng tới hoạt tính pepsin Ảnh hirỏìig nhiệt độ tói hoạt độ protease chế phẩm 3 Mỗi protease có nhiệt độ thích hợp cho thuỷ phân protein Vì hoạt độ protease phụ... xét đến độ ổn định hoạt độ protease theo thời gian bảo quản Để khảo sát yếu tố này, chúng tơi tiến hành theo dõi hoạt độ protease chế phẩm với thời gian tháng, 15 ngày xác định hoạt độ protease